引用本文： 徐立, 梁軍, 金濤, 周峰. 芒果苷對大鼠急性脊髓損傷的保護作用及相關機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(8): 1019-1025. doi: 10.7507/1002-1892.20160205 復制
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱損傷最嚴重并發癥之一，常導致損傷平面以下肢體功能障礙，嚴重者甚至會導致癱瘓。目前SCI治療和康復效果均不理想，成為臨床治療難題[1]。芒果苷是一種四羥基吡酮的碳酮苷，屬雙苯吡酮類黃酮類化合物[2]。其藥理活性廣泛，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化以及防止紫外線所致皮膚老化等作用[3]。近年研究發現，芒果苷在腦外傷及腦缺血/再灌注動物模型中能顯著減輕腦組織水腫，抗氧化應激反應和抗炎性反應，從而促進神經功能恢復，但相關作用機制仍未明確[4-5]。目前認為氧化應激反應、炎性反應以及神經細胞凋亡在SCI發生、發展過程中具有重要作用，并影響SCI預后。本實驗通過建立大鼠SCI模型，給予不同劑量的芒果苷，觀察比較損傷脊髓水腫情況以及脊髓氧化應激反應因子、炎性因子以及蛋白活性，凋亡蛋白表達差異，探討芒果苷對SCI的保護作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年雄性SD大鼠90只，體質量250～300 g，購自上海交通大學實驗動物中心。芒果苷（Sigma公司，美國）；一抗大鼠Bax、Bcl-2抗體，DAB顯色試劑盒（Santa Cruz公司，美國）；大鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH）、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；紫外分光光度計（Bausch & Lomb公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 實驗分組及方法
將90只大鼠隨機分為5組：假手術組（A組）、SCI組（B組）、10 mg/kg芒果苷處理組（C組）、25 mg/kg芒果苷處理組（D組）、50 mg/kg芒果苷處理組（E組），每組18只。B、C、D、E組參照文獻[6]方法制備大鼠SCI模型。具體步驟：大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉后，切除T8～10椎板，暴露T9脊髓。采用Allen法將10 g打擊錘固定于脊髓上方6 cm高度（致傷量為60 g/cm），松開打擊錘，見大鼠出現擺尾反射，雙后肢遲緩性痙攣，為SCI模型制備成功。A組大鼠同法麻醉后，僅切除T8～10椎板，不作其他處理。C、D、E組于術后30 min分別按照10、25、50 mg/kg劑量腹腔注射芒果苷，之后每日注射1次，共注射30 d；A、B組于對應時間點注射等量生理鹽水。術后大鼠單籠飼養，防止感染。于術后72 h及30 d，各組分別取9只大鼠同上法麻醉后，取損傷節段脊髓組織進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 后肢運動功能評分
觀察各組大鼠術后存活以及切口愈合情況。術后24、48、72 h采用BBB評分[7]評價各組大鼠后肢運動功能，包括大鼠后肢各關節活動、后肢步態和協調功能、運動時爪子的精細運動；總分為0分表示完全癱瘓，21分為完全正常活動。取每只大鼠左、右側肢體評分均值作為最終評分。
1.3.2 脊髓水含量測定
術后72 h取各組脊髓長約10 mm，迅速稱重（濕重）后將其放入80℃烘箱中72 h，再次稱重（干重）。按照以下公式計算脊髓水含量：(濕重－干重)/濕重×100%。
1.3.3 ELISA檢測
術后72 h取各組脊髓組織，標準稀釋液進行稀釋，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，加終止液后混勻，酶標儀進行檢測，測量脊髓組織中氧化應激反應因子MDA、CAT、SOD、GSH以及炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性。術后30 d，取各組脊髓組織，同上法測量Caspase-3、9活性。
1.3.4 Western blot檢測
術后30 d取各組脊髓組織，充分研磨，蛋白裂解液充分裂解后，以10 000×g離心30 min，BCA法測定總蛋白濃度。行電泳、轉膜、封閉，Bax、Bcl-2一抗孵育過夜，二抗1∶10 000孵育5 h，加入顯色劑顯色，以GAPDH作為內參。凝膠成像系統成像，Image J軟件測算蛋白灰度值，計算目的蛋白與GAPDH灰度值的比值作為其相對表達量。
1.3.5 組織學及免疫組織化學染色觀測
術后30 d取各組脊髓組織，置于10%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，從損傷脊髓中心部位連續切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，倒置相差顯微鏡下觀察脊髓組織和神經元細胞形態學改變。其余切片行Cas pase-3免疫組織化學染色，倒置相差顯微鏡下觀察，Cas pase-3陽性細胞呈黃染。每張切片隨機取3個視野，利用Image Pro-Plus 6.0軟件檢測吸光度（A）值，作為Caspase-3蛋白表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 后肢運動功能評分
術后各組大鼠均順利存活至實驗完成，切口無紅腫等感染表現。術后各時間點，A組BBB評分均顯著高于B、C、D、E組，B、C、D、E組評分呈逐漸增高趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 1。
圖1
術后各時間點各組大鼠后肢運動功能BBB評分??圖 2?ELISA檢測術后72 h各組脊髓組織中氧化應激反應因子以及炎性因子活性???MDA???CAT???SOD???GSH???NF-κB???TNF-α???IL-1β???IL-6??圖 3?ELISA檢測術后30 d各組脊髓組織中Caspase-3、9活性???Caspase-3???Caspase-9??圖 4?Western blot檢測術后30 d各組Bax、Bcl-2蛋白表達???蛋白條帶圖 1：A組2：B組3：C組4：D組5：E組???蛋白相對表達量比較
Figure1.
BBB scores for evaluating neurological function at different time points ?Fig. 2 The activities of oxidative stress factors and inflammatory factors in the spinal cord by ELISA at 72 hours after SCI???MDA???CAT???SOD???GSH???NF-κB???TNF-α???IL-1β???IL-6 ?Fig. 3 The activities of Caspase-3 and Caspase-9 in the spinal cord by ELISA at 30 days after SCI???Caspase-3???Caspase-9 ?Fig. 4 The relative expressions of Bax and Bcl-2 proteins in the spinal cord by Western blot at 30 days after SCI???Protein bands 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E???Expressions of Bax and Bcl-2 proteins
2.2 脊髓水含量測定
術后72 h，A、B、C、D、E組脊髓水含量分別為76.21%±7.49%、87.59%±7.93%、83.16%±7.55%、81.98%±7.61%、79.27%±7.38%。B、C、D、E組水含量均顯著高于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。而B、C、D、E組水含量呈逐漸降低趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.3 ELISA檢測
2.3.1 氧化應激反應因子
術后72 h，B、C、D、E組MDA活性均顯著高于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組MDA活性呈逐漸降低趨勢，組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。B、C、D、E組CAT、SOD、GSH活性均顯著低于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組以上因子活性均呈逐漸增高趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2a～d。
2.3.2 炎性因子
術后72 h，B、C、D、E組NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性均顯著高于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組以上因子活性均呈逐漸降低趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2e～h。
2.3.3 Caspase-3、9
術后30 d，B、C、D、E組Cas pase-3、9活性均顯著高于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組Caspase-3、9活性均呈逐漸降低趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3。
2.4 Western blot檢測
術后30 d，B、C、D、E組Bax蛋白表達均顯著高于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組表達呈逐漸降低趨勢，組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。B、C、D、E組Bcl-2蛋白表達均顯著低于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組表達呈逐漸增高趨勢，組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
2.5 組織學觀察
鏡下觀察，A組脊髓組織形態正常；B組神經元細胞腫脹壞死，嚴重脫髓鞘樣改變，并出現較多炎性細胞浸潤；C組神經元細胞腫脹，壞死細胞較B組減少，可見細胞脫髓鞘樣改變，炎性細胞浸潤減少；D組可見正常神經元細胞，壞死細胞及脫髓鞘樣改變顯著減少，少量炎性細胞浸潤，較C組顯著好轉；E組可見脊髓組織趨于正常，神經元細胞形態明顯較D組好轉，未見明顯脫髓鞘樣改變，炎性細胞顯著減少。見圖 5。
圖5
術后30 d各組HE染色觀察（×40）???A組???B組???C組???D組???E組??圖 6?術后30 d各組Caspase-3免疫組織化學染色（×40）???A組???B組???C組???D組???E組
Figure5.
Morphology observation of the spinal cord by HE staining at 30 days after SCI (×40)???Group A???Group B???Group C???Group D???Group E ?Fig. 6 Immunohistochemistry staining of Caspase-3 in the spinal cord at 30 days after SCI (×40)???Group A???Group B???Group C???Group D???Group E
2.6 免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察，各組Caspase-3蛋白均表達于脊髓實質以及神經細胞，A組為正常脊髓，少量Caspase-3陽性細胞，B組可見大量Caspase-3陽性細胞，C、D、E組Caspase-3陽性細胞依次減少（圖 6）。A、B、C、D、E組Caspase-3蛋白表達量分別為14.15±2.76、95.24±10.36、82.65±9.42、73.12±10.11、59.45±9.41；B、C、D、E組Caspase-3蛋白表達量均顯著高于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組表達量呈逐漸降低趨勢，組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。
3 討論
國內外學者對SCI的病理生理機制進行了廣泛的探討和研究，認識到SCI在原發損傷的基礎上可能會發展一系列的進行性病理性改變，而這種繼發性損傷的病理改變將會加重SCI，甚至造成脊髓的不可逆性傷害[8]。繼發性水腫是SCI繼發性損傷的重要方面，其病理機制主要是由損傷后水腫的發展激發一系列分子和細胞機制，進而引發炎性反應等，最終引起細胞的凋亡和壞死[9]。椎管內脊髓水腫的發生會加重神經壓迫，導致脊髓神經缺血、缺氧，甚至引起神經細胞的變性和壞死。本實驗通過Allen法構建大鼠SCI模型，發現SCI大鼠脊髓水含量明顯提高，而經腹腔注射芒果苷后，水含量得到抑制，水腫情況明顯好轉，并且低、中、高濃度組水腫抑制效果逐漸增強（P < 0.05），存在劑量依賴關系。說明芒果苷在SCI早期能通過抑制脊髓水腫發揮神經保護作用。
SCI后繼發氧化應激反應是引起脊髓組織損傷的重要因素之一[10]。神經損傷后可產生并釋放大量氧自由基[11]，而脊髓神經元的細胞膜結構中富含脂質，產生的性質極不穩定的氧自由基，能攻擊細胞膜中的不飽和脂肪酸，從而引發脂質過氧化反應，破壞細胞膜結構的完整性和通透性，最終導致細胞變性、凋亡和壞死。MDA是脂質氧化的最終產物，因此MDA活性可直接反映體內氧自由基產生和釋放水平，間接反映細胞受自由基攻擊的程度[12]。SOD是細胞內主要的抗氧化酶，也是細胞內主要的自由基清除劑，可保護細胞對抗氧自由基對機體的損害，SOD水平可反映內源性氧自由基清除系統功能[13]。CAT是一種酶類清除劑，存在于細胞的過氧化物體內。它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的H2O2，從而使細胞免于遭受H2O2的損害，是過氧化物酶體的標志酶，是生物防御體系的關鍵酶之一。GSH也是機體內一種重要的抗氧化酶，可催化H2O2分解，其表達水平可間接反映機體清除氧自由基的能力。Kalayci等[14]研究發現SCI后脊髓組織內MDA水平明顯上升，SOD、GSH、CAT活性則明顯下降。本實驗發現，與A組正常脊髓組織相比，SCI后氧化應激反應因子MDA水平提高，而CAT、SOD、GSH活性明顯下調，而芒果苷可明顯逆轉這些氧化應激反應因子的表達，并且低、中、高濃度組氧化應激反應抑制效果逐漸增強（P < 0.05），呈現劑量依賴關系，與Kalayci等[14]的實驗研究結果一致。說明芒果苷能抑制SCI后脂質過氧化，增加活性氧的清除，從而發揮神經保護作用。
NF-κB家族作為早期轉錄因子，是調控炎性反應的重要環節。NF-κB可迅速對有害細胞的刺激做出反應，參與炎性反應，很多炎性因子受NF-κB的調控，包括本實驗研究的TNF-α、IL-1β、IL-6[15]。此外，NF-κB也可以被炎性因子、生長因子或趨化因子等激活。常見的炎性因子如IL-1β和TNF-α等，都能激活轉錄因子NF-κB[16]。本實驗發現，B組中NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6表達較A組明顯提高（P < 0.05），加重了脊髓的損傷程度；當加入芒果苷治療后，NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性得到有效抑制（P < 0.05）。提示芒果苷可抑制SCI后炎性反應，從而發揮神經保護作用。
Caspase-3、9是Caspase家族中2種重要的凋亡蛋白，控制著細胞凋亡啟動，被稱為凋亡的“分子開關”[17-18]。因此，Caspase-3、9蛋白表達水平從某種程度上可反映SCI部位的細胞凋亡情況。本實驗發現，與A組相比，B組SCI后Caspase-3、9蛋白活性及其蛋白表達明顯提高（P < 0.05），而芒果苷可明顯抑制Caspase-3、9蛋白活性（P < 0.05），并且低、中、高濃度組抑制效果逐漸增強（P < 0.05），呈劑量依賴關系，從而發揮抗凋亡作用。
神經細胞的凋亡和壞死是SCI最嚴重繼發性損傷。繼發性細胞凋亡主要是神經元及神經膠質細胞發生的程序性死亡，常見于脊髓缺血或擠壓傷。Bax蛋白存在于胞質線粒體內，SCI刺激可激活Bax蛋白，使線粒體膜通透性改變，從而誘發神經細胞凋亡[19]。去除Bax基因的小鼠制備SCI模型后，少突膠質細胞凋亡情況明顯下降[20]。而Bcl-2是一種細胞質蛋白，在神經細胞中表達水平較高，并且隨著神經系統的逐漸完善，其表達水平維持在較低水平。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，可抑制SCI后各種途徑引起的細胞凋亡[21]。此外，Bcl-2是一種可誘導基因，可通過轉基因方式使動物高表達Bcl-2，從而減輕脊髓神經損傷，提高脊髓組織抗凋亡的能力，有效阻止神經細胞凋亡，促進損傷中樞神經系統組織修復[22]。Fan等[23]的實驗證明Bcl-2與Bax的表達直接影響脊髓神經細胞凋亡，且凋亡程度與Bcl-2/Bax成正相關。本實驗中與A組相比，B組SCI模型凋亡蛋白Bax表達水平提高，而Bcl-2表達明顯下調（P < 0.05），而芒果苷可明顯逆轉這些凋亡的表達，并且低、中、高濃度組Bax和Bcl-2逆轉效果逐漸增強（P < 0.05），呈現劑量依賴關系。說明芒果苷在SCI后可抑制細胞的凋亡來發揮其神經保護作用。
綜上述，芒果苷可抑制大鼠SCI早期發生的脊髓水腫情況，并通過逆轉氧化應激反應，下調炎性反應進程，以及通過上調Bcl-2表達和抑制Bax表達抗細胞凋亡，從而發揮神經保護的作用。
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱損傷最嚴重并發癥之一，常導致損傷平面以下肢體功能障礙，嚴重者甚至會導致癱瘓。目前SCI治療和康復效果均不理想，成為臨床治療難題[1]。芒果苷是一種四羥基吡酮的碳酮苷，屬雙苯吡酮類黃酮類化合物[2]。其藥理活性廣泛，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化以及防止紫外線所致皮膚老化等作用[3]。近年研究發現，芒果苷在腦外傷及腦缺血/再灌注動物模型中能顯著減輕腦組織水腫，抗氧化應激反應和抗炎性反應，從而促進神經功能恢復，但相關作用機制仍未明確[4-5]。目前認為氧化應激反應、炎性反應以及神經細胞凋亡在SCI發生、發展過程中具有重要作用，并影響SCI預后。本實驗通過建立大鼠SCI模型，給予不同劑量的芒果苷，觀察比較損傷脊髓水腫情況以及脊髓氧化應激反應因子、炎性因子以及蛋白活性，凋亡蛋白表達差異，探討芒果苷對SCI的保護作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年雄性SD大鼠90只，體質量250～300 g，購自上海交通大學實驗動物中心。芒果苷（Sigma公司，美國）；一抗大鼠Bax、Bcl-2抗體，DAB顯色試劑盒（Santa Cruz公司，美國）；大鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH）、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；紫外分光光度計（Bausch & Lomb公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 實驗分組及方法
將90只大鼠隨機分為5組：假手術組（A組）、SCI組（B組）、10 mg/kg芒果苷處理組（C組）、25 mg/kg芒果苷處理組（D組）、50 mg/kg芒果苷處理組（E組），每組18只。B、C、D、E組參照文獻[6]方法制備大鼠SCI模型。具體步驟：大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉后，切除T8～10椎板，暴露T9脊髓。采用Allen法將10 g打擊錘固定于脊髓上方6 cm高度（致傷量為60 g/cm），松開打擊錘，見大鼠出現擺尾反射，雙后肢遲緩性痙攣，為SCI模型制備成功。A組大鼠同法麻醉后，僅切除T8～10椎板，不作其他處理。C、D、E組于術后30 min分別按照10、25、50 mg/kg劑量腹腔注射芒果苷，之后每日注射1次，共注射30 d；A、B組于對應時間點注射等量生理鹽水。術后大鼠單籠飼養，防止感染。于術后72 h及30 d，各組分別取9只大鼠同上法麻醉后，取損傷節段脊髓組織進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 后肢運動功能評分
觀察各組大鼠術后存活以及切口愈合情況。術后24、48、72 h采用BBB評分[7]評價各組大鼠后肢運動功能，包括大鼠后肢各關節活動、后肢步態和協調功能、運動時爪子的精細運動；總分為0分表示完全癱瘓，21分為完全正常活動。取每只大鼠左、右側肢體評分均值作為最終評分。
1.3.2 脊髓水含量測定
術后72 h取各組脊髓長約10 mm，迅速稱重（濕重）后將其放入80℃烘箱中72 h，再次稱重（干重）。按照以下公式計算脊髓水含量：(濕重－干重)/濕重×100%。
1.3.3 ELISA檢測
術后72 h取各組脊髓組織，標準稀釋液進行稀釋，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，加終止液后混勻，酶標儀進行檢測，測量脊髓組織中氧化應激反應因子MDA、CAT、SOD、GSH以及炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性。術后30 d，取各組脊髓組織，同上法測量Caspase-3、9活性。
1.3.4 Western blot檢測
術后30 d取各組脊髓組織，充分研磨，蛋白裂解液充分裂解后，以10 000×g離心30 min，BCA法測定總蛋白濃度。行電泳、轉膜、封閉，Bax、Bcl-2一抗孵育過夜，二抗1∶10 000孵育5 h，加入顯色劑顯色，以GAPDH作為內參。凝膠成像系統成像，Image J軟件測算蛋白灰度值，計算目的蛋白與GAPDH灰度值的比值作為其相對表達量。
1.3.5 組織學及免疫組織化學染色觀測
術后30 d取各組脊髓組織，置于10%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，從損傷脊髓中心部位連續切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，倒置相差顯微鏡下觀察脊髓組織和神經元細胞形態學改變。其余切片行Cas pase-3免疫組織化學染色，倒置相差顯微鏡下觀察，Cas pase-3陽性細胞呈黃染。每張切片隨機取3個視野，利用Image Pro-Plus 6.0軟件檢測吸光度（A）值，作為Caspase-3蛋白表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 后肢運動功能評分
術后各組大鼠均順利存活至實驗完成，切口無紅腫等感染表現。術后各時間點，A組BBB評分均顯著高于B、C、D、E組，B、C、D、E組評分呈逐漸增高趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 1。
圖1
術后各時間點各組大鼠后肢運動功能BBB評分??圖 2?ELISA檢測術后72 h各組脊髓組織中氧化應激反應因子以及炎性因子活性???MDA???CAT???SOD???GSH???NF-κB???TNF-α???IL-1β???IL-6??圖 3?ELISA檢測術后30 d各組脊髓組織中Caspase-3、9活性???Caspase-3???Caspase-9??圖 4?Western blot檢測術后30 d各組Bax、Bcl-2蛋白表達???蛋白條帶圖 1：A組2：B組3：C組4：D組5：E組???蛋白相對表達量比較
Figure1.
BBB scores for evaluating neurological function at different time points ?Fig. 2 The activities of oxidative stress factors and inflammatory factors in the spinal cord by ELISA at 72 hours after SCI???MDA???CAT???SOD???GSH???NF-κB???TNF-α???IL-1β???IL-6 ?Fig. 3 The activities of Caspase-3 and Caspase-9 in the spinal cord by ELISA at 30 days after SCI???Caspase-3???Caspase-9 ?Fig. 4 The relative expressions of Bax and Bcl-2 proteins in the spinal cord by Western blot at 30 days after SCI???Protein bands 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E???Expressions of Bax and Bcl-2 proteins
2.2 脊髓水含量測定
術后72 h，A、B、C、D、E組脊髓水含量分別為76.21%±7.49%、87.59%±7.93%、83.16%±7.55%、81.98%±7.61%、79.27%±7.38%。B、C、D、E組水含量均顯著高于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。而B、C、D、E組水含量呈逐漸降低趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.3 ELISA檢測
2.3.1 氧化應激反應因子
術后72 h，B、C、D、E組MDA活性均顯著高于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組MDA活性呈逐漸降低趨勢，組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。B、C、D、E組CAT、SOD、GSH活性均顯著低于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組以上因子活性均呈逐漸增高趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2a～d。
2.3.2 炎性因子
術后72 h，B、C、D、E組NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性均顯著高于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組以上因子活性均呈逐漸降低趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2e～h。
2.3.3 Caspase-3、9
術后30 d，B、C、D、E組Cas pase-3、9活性均顯著高于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組Caspase-3、9活性均呈逐漸降低趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3。
2.4 Western blot檢測
術后30 d，B、C、D、E組Bax蛋白表達均顯著高于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組表達呈逐漸降低趨勢，組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。B、C、D、E組Bcl-2蛋白表達均顯著低于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組表達呈逐漸增高趨勢，組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
2.5 組織學觀察
鏡下觀察，A組脊髓組織形態正常；B組神經元細胞腫脹壞死，嚴重脫髓鞘樣改變，并出現較多炎性細胞浸潤；C組神經元細胞腫脹，壞死細胞較B組減少，可見細胞脫髓鞘樣改變，炎性細胞浸潤減少；D組可見正常神經元細胞，壞死細胞及脫髓鞘樣改變顯著減少，少量炎性細胞浸潤，較C組顯著好轉；E組可見脊髓組織趨于正常，神經元細胞形態明顯較D組好轉，未見明顯脫髓鞘樣改變，炎性細胞顯著減少。見圖 5。
圖5
術后30 d各組HE染色觀察（×40）???A組???B組???C組???D組???E組??圖 6?術后30 d各組Caspase-3免疫組織化學染色（×40）???A組???B組???C組???D組???E組
Figure5.
Morphology observation of the spinal cord by HE staining at 30 days after SCI (×40)???Group A???Group B???Group C???Group D???Group E ?Fig. 6 Immunohistochemistry staining of Caspase-3 in the spinal cord at 30 days after SCI (×40)???Group A???Group B???Group C???Group D???Group E
2.6 免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察，各組Caspase-3蛋白均表達于脊髓實質以及神經細胞，A組為正常脊髓，少量Caspase-3陽性細胞，B組可見大量Caspase-3陽性細胞，C、D、E組Caspase-3陽性細胞依次減少（圖 6）。A、B、C、D、E組Caspase-3蛋白表達量分別為14.15±2.76、95.24±10.36、82.65±9.42、73.12±10.11、59.45±9.41；B、C、D、E組Caspase-3蛋白表達量均顯著高于A組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組表達量呈逐漸降低趨勢，組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。
3 討論
國內外學者對SCI的病理生理機制進行了廣泛的探討和研究，認識到SCI在原發損傷的基礎上可能會發展一系列的進行性病理性改變，而這種繼發性損傷的病理改變將會加重SCI，甚至造成脊髓的不可逆性傷害[8]。繼發性水腫是SCI繼發性損傷的重要方面，其病理機制主要是由損傷后水腫的發展激發一系列分子和細胞機制，進而引發炎性反應等，最終引起細胞的凋亡和壞死[9]。椎管內脊髓水腫的發生會加重神經壓迫，導致脊髓神經缺血、缺氧，甚至引起神經細胞的變性和壞死。本實驗通過Allen法構建大鼠SCI模型，發現SCI大鼠脊髓水含量明顯提高，而經腹腔注射芒果苷后，水含量得到抑制，水腫情況明顯好轉，并且低、中、高濃度組水腫抑制效果逐漸增強（P < 0.05），存在劑量依賴關系。說明芒果苷在SCI早期能通過抑制脊髓水腫發揮神經保護作用。
SCI后繼發氧化應激反應是引起脊髓組織損傷的重要因素之一[10]。神經損傷后可產生并釋放大量氧自由基[11]，而脊髓神經元的細胞膜結構中富含脂質，產生的性質極不穩定的氧自由基，能攻擊細胞膜中的不飽和脂肪酸，從而引發脂質過氧化反應，破壞細胞膜結構的完整性和通透性，最終導致細胞變性、凋亡和壞死。MDA是脂質氧化的最終產物，因此MDA活性可直接反映體內氧自由基產生和釋放水平，間接反映細胞受自由基攻擊的程度[12]。SOD是細胞內主要的抗氧化酶，也是細胞內主要的自由基清除劑，可保護細胞對抗氧自由基對機體的損害，SOD水平可反映內源性氧自由基清除系統功能[13]。CAT是一種酶類清除劑，存在于細胞的過氧化物體內。它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的H2O2，從而使細胞免于遭受H2O2的損害，是過氧化物酶體的標志酶，是生物防御體系的關鍵酶之一。GSH也是機體內一種重要的抗氧化酶，可催化H2O2分解，其表達水平可間接反映機體清除氧自由基的能力。Kalayci等[14]研究發現SCI后脊髓組織內MDA水平明顯上升，SOD、GSH、CAT活性則明顯下降。本實驗發現，與A組正常脊髓組織相比，SCI后氧化應激反應因子MDA水平提高，而CAT、SOD、GSH活性明顯下調，而芒果苷可明顯逆轉這些氧化應激反應因子的表達，并且低、中、高濃度組氧化應激反應抑制效果逐漸增強（P < 0.05），呈現劑量依賴關系，與Kalayci等[14]的實驗研究結果一致。說明芒果苷能抑制SCI后脂質過氧化，增加活性氧的清除，從而發揮神經保護作用。
NF-κB家族作為早期轉錄因子，是調控炎性反應的重要環節。NF-κB可迅速對有害細胞的刺激做出反應，參與炎性反應，很多炎性因子受NF-κB的調控，包括本實驗研究的TNF-α、IL-1β、IL-6[15]。此外，NF-κB也可以被炎性因子、生長因子或趨化因子等激活。常見的炎性因子如IL-1β和TNF-α等，都能激活轉錄因子NF-κB[16]。本實驗發現，B組中NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6表達較A組明顯提高（P < 0.05），加重了脊髓的損傷程度；當加入芒果苷治療后，NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性得到有效抑制（P < 0.05）。提示芒果苷可抑制SCI后炎性反應，從而發揮神經保護作用。
Caspase-3、9是Caspase家族中2種重要的凋亡蛋白，控制著細胞凋亡啟動，被稱為凋亡的“分子開關”[17-18]。因此，Caspase-3、9蛋白表達水平從某種程度上可反映SCI部位的細胞凋亡情況。本實驗發現，與A組相比，B組SCI后Caspase-3、9蛋白活性及其蛋白表達明顯提高（P < 0.05），而芒果苷可明顯抑制Caspase-3、9蛋白活性（P < 0.05），并且低、中、高濃度組抑制效果逐漸增強（P < 0.05），呈劑量依賴關系，從而發揮抗凋亡作用。
神經細胞的凋亡和壞死是SCI最嚴重繼發性損傷。繼發性細胞凋亡主要是神經元及神經膠質細胞發生的程序性死亡，常見于脊髓缺血或擠壓傷。Bax蛋白存在于胞質線粒體內，SCI刺激可激活Bax蛋白，使線粒體膜通透性改變，從而誘發神經細胞凋亡[19]。去除Bax基因的小鼠制備SCI模型后，少突膠質細胞凋亡情況明顯下降[20]。而Bcl-2是一種細胞質蛋白，在神經細胞中表達水平較高，并且隨著神經系統的逐漸完善，其表達水平維持在較低水平。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，可抑制SCI后各種途徑引起的細胞凋亡[21]。此外，Bcl-2是一種可誘導基因，可通過轉基因方式使動物高表達Bcl-2，從而減輕脊髓神經損傷，提高脊髓組織抗凋亡的能力，有效阻止神經細胞凋亡，促進損傷中樞神經系統組織修復[22]。Fan等[23]的實驗證明Bcl-2與Bax的表達直接影響脊髓神經細胞凋亡，且凋亡程度與Bcl-2/Bax成正相關。本實驗中與A組相比，B組SCI模型凋亡蛋白Bax表達水平提高，而Bcl-2表達明顯下調（P < 0.05），而芒果苷可明顯逆轉這些凋亡的表達，并且低、中、高濃度組Bax和Bcl-2逆轉效果逐漸增強（P < 0.05），呈現劑量依賴關系。說明芒果苷在SCI后可抑制細胞的凋亡來發揮其神經保護作用。
綜上述，芒果苷可抑制大鼠SCI早期發生的脊髓水腫情況，并通過逆轉氧化應激反應，下調炎性反應進程，以及通過上調Bcl-2表達和抑制Bax表達抗細胞凋亡，從而發揮神經保護的作用。
