引用本文： 唐彬秩, 王德健, 吳青, 李茂軍, 陽倩, 陳昌輝. 胞外信號相關蛋白激酶1/2信號通路與人參皂苷Rg1抗新生鼠缺氧缺血性腦損傷后神經元凋亡. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(8): 1011-1018. doi: 10.7507/1002-1892.20160204 復制
圍生期窒息引起的缺氧缺血性腦損傷（hypoxia ischemia brain damage，HIBD）是導致新生兒死亡及傷殘的重要原因之一，目前我國新生兒死亡原因中出生窒息死亡占28.6%，位居首位[1]。盡管近年來HIBD的死亡率及神經系統后遺癥的發生率較以往有所降低[1]，但新生兒HIBD仍沒有安全有效的治療方法[2]。因此，深入研究HIBD的發病機制，探索干預HIBD損傷的新靶點，對于臨床預防和治療HIBD具有重要意義。
本課題組既往研究已證實人參皂苷Rg1可通過增強并穩定缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）信號途徑，抑制半胱天冬氨酸酶3（Caspase-3）的活化，在新生鼠HIBD中發揮抗凋亡的神經保護作用[3]。但該作用過程中，有哪些信號通路參與及相關分子機制尚不清楚。本次研究通過建立新生鼠HIBD模型并給予不同干預藥物，觀察人參皂苷Rg1對HIF-1α信號軸有關的激酶、核轉錄因子、凋亡相關蛋白等效應分子在HIBD損傷及修復中的作用及相互關系，以期探明人參皂苷Rg1抗HIBD損傷的可能作用機制，為Rg1用于臨床新生兒HIBD的治療提供藥理學理論依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10日齡SPF級SD大鼠48只，雌雄不拘，體質量17～21 g，由四川省人民醫院動物實驗中心提供。
人參皂甙Rg1（純度 > 98%，南京澤郎醫藥科技有限公司）；兔抗大鼠胞外信號相關蛋白激酶1/2（extracellular signal-related protein kinase 1/2，Erk1/2）多克隆抗體（1：1 000）、兔抗大鼠磷酸化Erk1/2（phospho-Erk1/2，p-Erk1/2）多克隆抗體（1：1 000）、兔抗大鼠活化Caspase-3（cleaved Caspase-3，CC3）多抗（Cell Signaling公司，美國）；兔抗大鼠HIF-1α多抗（Santa Cruz公司，美國）；U0126小鼠抗大鼠β-actin單抗（Sigma公司，美國）；山羊抗兔/山羊抗小鼠SP免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體、BCA蛋白定量試劑盒（Bio-Rad公司，美國）；ECL化學發光顯色試劑盒（Millipore公司，美國）；DAB顯色試劑盒（KPL公司，美國）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司，美國）。顯微鏡及圖象采集與分析系統（Leica公司，德國）；凝膠成像儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將48只大鼠隨機分為4組（n=12）：假手術組、模型組（HI組）、模型+人參皂甙Rg1組（HI+ Rg1組）、模型+人參皂甙Rg1+U0126干預組（HI+Rg1+U0126組）。
HI組、HI+Rg1組、HI+Rg1+U0126組大鼠按照文獻[3]方法制備HIBD模型。大鼠乙醚麻醉后仰臥位固定，作頸正中切口，分離并結扎右側頸總動脈，縫合皮膚切口。30 min后放入缺氧容器，92% N2及8% O2的低氧混合氣通氣2.5 h，制備HIBD模型。假手術組僅分離右側頸總動脈后關閉切口，不結扎，不進行低氧通氣。HI+Rg1+U0126組于造模前1 h右側腦室注射給藥，具體步驟：乙醚麻醉后俯臥位固定，對耳線前緣作頭皮正中切口，暴露前囟，于前囟向后1 mm、矢狀縫向右1.5 mm處，以與顱骨切線90°的方向進針，進針深度3 mm；注射U0126，給藥劑量為25 μg/kg，溶于5 μL PBS（含2% DMSO），注射時間控制在10 min左右，注射完畢原位保持3 min，然后緩緩將注射器拔出，縫合皮膚。為消除側腦室注射及溶劑本身的影響，除HI+Rg1+U0126組外的其余3組同法注射相同體積溶劑，其中假手術組于分離右側頸總動脈前1 h注射5 μL PBS（含2% DMSO），HI組及HI+Rg1組于造模前1 h注射5 μL PBS（含2% DMSO）。HI+Rg1組及HI+Rg1+U0126組于術后即刻腹腔內注射0.1 mL含Rg1（40 mg/ kg）的生理鹽水；HI組和假手術組于相同時間點腹腔內注射0.1 mL生理鹽水。
1.3 觀測指標
1.3.1 Western blot檢測Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表達
各組術后4、24 h取3只實驗動物，距離側腦室注射部位前、后各3 mm，冠狀切取右側半球皮層和海馬腦組織，用含有磷酸酶抑制劑的預冷RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，上樣量均為100 μg/孔。8%SDS-PAGE（Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和β-actin蛋白）電泳及12%SDS-PAGE（CC3蛋白）電泳，濕法轉膜至聚偏氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白封閉，一抗室溫孵育1 h，4℃過夜（抗體稀釋濃度分別為HIF-1α 1：200，Erk1/2、p-Erk1/2、CC3均為1：1 000，β-actin 1：3 000），二抗室溫孵育1 h（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/山羊抗鼠IgG，1：3 000），含0.1% Tween20的TBS洗膜后ECL化學發光試劑盒曝光顯影，凝膠成像儀獲取圖像，用成像儀自帶分析軟件測定條帶積分吸光度（IA）值，計算目的蛋白和β-actin的IA比值作為目的蛋白相對表達量。
1.3.2 免疫組織化學染色檢測Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α、CC3蛋白表達
各組術后4、24 h另取3只實驗動物，距離側腦室注射部位前、后各1 mm，冠狀切取右側半球皮層和海馬腦組織，用預冷4%多聚甲醛灌注固定，石蠟包埋，脫蠟至水，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，抗原熱修復后山羊血清封閉30 min，滴加HIF-1α抗體（1：50）或Erk1/2、p-Erk1/2、CC3抗體（1：200），PBS代替一抗作為陰性對照。37℃孵育1 h，4℃孵育過夜。后續步驟參照文獻[3]方法進行。光鏡下觀察陽性細胞顯色為棕黃色或棕褐色，每個標本于400倍鏡下觀察2個視野，圖像分析軟件測定陽性染色IA值，取均值。
1.3.3 TUNEL染色檢測原位神經元凋亡
取1.3.2中制備的部分切片，按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，DAB顯色。結果判定：胞核為棕黃色或棕褐色的細胞為凋亡細胞。每個標本于400倍鏡下隨機觀察2個視野，計數陽性細胞數和細胞總數，取均值；并根據以下公式計算凋亡指數（apoptotic index，AI），AI=陽性細胞數/細胞總數×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Western blot檢測
各時間點各組均有Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α、CC3蛋白表達（圖 1）。術后4、24 h各組Erk1/2蛋白表達比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。術后4、24 h，HI組HIF-1α、CC3蛋白表達均較假手術組明顯增加（P < 0.05）；術后4 h，HI組p-Erk1/2蛋白表達較假手術組明顯增加（P < 0.05），24 h時差異無統計學意義（P > 0.05）。術后4、24 h，HI+Rg1組p-Erk1/2及HIF-1α蛋白表達較HI組明顯上調（P < 0.05），而CC3蛋白表達明顯下調（P < 0.05）。術后4、24 h，HI+Rg1+U0126組p-Erk1/2及HIF-1α蛋白表達較HI+Rg1組明顯下調（P < 0.05），而CC3蛋白表達則明顯上調（P < 0.05）。見表 1。
圖1
Western blot檢測各組Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表達??1：假手術組4 h ??2：HI組4 h ??3：HI+Rg1組4 h ??4：HI+ Rg1+U0126組4 h ??5：假手術組24 h ??6：HI組24 h ??7：HI+Rg1組24 h ??8：HI+Rg1+U0126組24 h
Figure1.
Expressions of Erk1/2, p-Erk1/2, HIF-1α, and CC3 proteins by Western blot ??1: Sham group at 4 hours ??2: HI group at 4 hours ??3: HI+Rg1 group at 4 hours ??4: HI+Rg1+U0126 group at 4 hours ??5: Sham group at 24 hours ??6: HI group at 24 hours ??7: HI+Rg1 group at 24 hours 8: HI+Rg1+U0126 group at 24 hours
表1
術后4、24 h各組Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白表達比較（n=3，2.2 免疫組織化學染色觀察
鏡下各組均可見Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白陽性染色。其中，Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表達主要分布于腦皮層和海馬區等，亞細胞定位主要集中在細胞質（圖 2、3）；HIF-1α蛋白表達主要分布于大腦皮層、海馬區、齒狀回及灰質核，亞細胞定位主要集中在細胞核及細胞質（圖 4）；CC3蛋白主要分布于皮層及海馬區等，亞細胞定位于細胞核和細胞質（圖 5）。
圖2
免疫組織化學染色觀察術后24 h各組Erk1/2蛋白表達（SABC×400）???假手術組???HI組???HI+Rg1組???HI+Rg1+ U0126組??圖 3?免疫組織化學染色觀察術后24 h各組p-Erk1/2蛋白表達（SABC×400）???假手術組???HI組???HI+Rg1組???HI+Rg1+U0126組??圖 4?免疫組織化學染色觀察術后24 h各組HIF-1α蛋白表達（SABC×400）???假手術組???HI組???HI+Rg1組???HI+Rg1+U0126組
Figure2.
Expression of Erk1/2 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400)???Sham group???HI group???HI+Rg1 group???HI+Rg1+U0126 group ?Fig. 3 Expression of p-Erk1/2 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400)???Sham group???HI group???HI+Rg1 group???HI+Rg1+U0126 group ?Fig. 4 Expression of HIF-1αprotein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400)???Sham group???HI group???HI+Rg1 group???HI+Rg1+U0126 group
圖5
免疫組織化學染色觀察術后24 h各組CC3蛋白表達（SABC×400）???假手術組???HI組???HI+Rg1組???HI+Rg1+U0126組圖 6 TUNEL染色觀察術后24 h各組神經元凋亡情況（×400）???假手術組???HI組???HI+Rg1組???HI+Rg1+U0126組
Figure5.
Expression of CC3 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400)???Sham group???HI group???HI+Rg1 group???HI+Rg1+U0126 group Fig. 6 Apoptosis of neuron in each group at 24 hours by TUNEL staining (×400)???Sham group???HI group???HI+Rg1 group???HI+Rg1+U0126 group
圖像分析軟件測定示，術后4 h，HI組p-Erk1/2蛋白陽性染色IA值與假手術組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；24 h時兩組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。術后4、24 h，HI+Rg1組p-Erk1/2蛋白陽性染色IA值較HI組升高，HI+Rg1+U0126組較HI+Rg1組明顯降低，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
術后4、24 h，HI組HIF-1α蛋白陽性染色IA值較假手術組升高，HI+Rg1組亦較HI組升高，但HI+Rg1+U0126組HIF-1α蛋白陽性染色IA值較HI+Rg1組明顯降低，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
術后4、24 h，HI組CC3蛋白陽性染色IA值較假手術組升高，HI+Rg1組較HI組降低，但HI+Rg1+U0126組較HI+Rg1組明顯升高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
術后4、24 h，各組Erk1/2蛋白陽性染色IA值比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
術后4、24 h各組Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白陽性染色IA值比較（n=3，2.3 TUNEL染色結果
各時間點各組均見陽性細胞，TUNEL陽性細胞主要分布于腦皮層及海馬區，細胞核呈典型棕黃色至棕褐色顆粒（圖 6）。假手術組有少量細胞凋亡；HI組術后凋亡細胞持續增加；HI+Rg1組術后4 h凋亡細胞較多，24 h時較前減少。HI+Rg1+U0126組凋亡細胞多于同一時間點HI+Rg1組。
HI組術后4、24 h AI與假手術組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。術后4 h，HI組、HI+Rg1組以及HI+Rg1+U0126組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后24 h，HI+Rg1組AI較HI組明顯降低，HI+Rg1+U0126組較HI+Rg1組明顯升高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 3。
表3
術后4、24 h各組AI比較（n=3，%，3 討論
新生兒HIBD時缺氧缺血引起的一系列分子信號通路和能量代謝異常，會導致線粒體功能損傷，細胞凋亡信號過度激活，打破了細胞原有的凋亡/抗凋亡通路平衡，啟動細胞凋亡程序[4-5]。而神經元凋亡程度直接決定著HIBD的轉歸及預后，因此如何增強神經元對HIBD損傷的應激能力，減少其凋亡，成為HIBD損傷后腦組織修復研究的關鍵。
HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于人類和哺乳動物細胞內的一種核轉錄因子，是由HIF-1α和HIF-1β亞基構成的異二聚體，HIF-1α是其調節亞基和功能亞基。我們既往研究已證實包括HIBD在內的許多缺氧缺血相關性病理生理過程中有HIF-1α參與[2-3, 5-8]。
局灶性腦缺血所引起的供血障礙可使局部腦組織發生缺血、缺氧，其細胞損害主要表現為凋亡和死亡兩種形式，在發育期腦損傷中以凋亡多見[3, 9]。HIBD損傷引起細胞線粒體膜通透性增高最終會導致Caspase-3活化，Caspase-3是Caspase家族激聯激活后的共同通路和誘導凋亡的關鍵因子，在細胞凋亡進程中處于中心地位，Caspase-3活化形式CC3的出現是神經元凋亡的特征之一[3-4]。其中在缺血半暗帶，即缺血側大腦半球皮層及海馬區域，是細胞凋亡的集中表現區域。因此，本研究中我們選擇上述區域腦組織進行免疫組織化學染色和TUNEL染色分析及Western blot檢測。結果表明，TUNEL陽性細胞率與CC3蛋白表達變化趨勢基本一致，而HIF-1α與CC3蛋白表達呈不同的變化趨勢，這與前期研究結果一致[3, 9]。
近年來研究表明，從五加科植物人參的根莖中提取的活性單體成分——人參皂甙Rg1，具有廣泛的藥理學活性，尤其對神經的保護作用日益受到人們重視[10]。盡管迄今為止尚無人參或人參皂甙Rg1在新生兒臨床應用的報道，但目前所有證據均表明人參成分的毒性與不良反應通常較輕微[11]，提示其具有用于新生兒的可能性。
早期研究發現，人參活性提取物成分可有效減少新生鼠HIBD中海馬神經元的凋亡，從而提高HIBD損傷后新生鼠的存活率[12]。隨后在模擬缺氧缺血環境的體外實驗中發現，人參抗神經元凋亡的保護作用可能與人參皂苷Rg1穩定細胞生物膜功能[13]，刺激腦源性神經營養因子表達[14]以及抑制凋亡相關分子Caspase-3的活化有關[3]，且這一過程伴隨著HIF-1α蛋白表達升高和維持較長時間高表達[3]。這與既往有關中藥復方制劑參麥注射液有助于增強HIBD后HIF-1α表達，從而減少海馬神經元的凋亡[15]，以及在心血管系統中觀察到Rg1對HIF-1α及其下游促血管生成因子的誘導表達一致[16-17]。然而目前尚不清楚人參皂苷Rg1是通過何種信號轉導途徑實現對HIF-1α及其下游凋亡相關效應分子的表達或活性的調控。
Erk1/2屬于絲裂原激活蛋白激酶信號通路，既往研究已明確發育期缺氧缺血鼠腦組織Erk1/2信號通路參與了HIF-1α及其靶基因VEGF的表達調節[18]。最新發表的兩項研究表明，Rg1延緩阿爾茨海默病發生、發展及促進鼠胚胎干細胞向神經元分化的效應可被Erk1/2信號通路的抑制劑阻斷，提示Rg1的上述生物學效應依賴于Erk1/2信號通路的活化[19-20]。那么Erk1/2是否也參與了新生鼠HIBD后Rg1對HIF-1α及其下游凋亡相關效應分子的表達調控，我們進行了相關研究。
本研究結果顯示，假手術組p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表達處于較低水平，HI組造模術后4 h，Erk1/2磷酸化水平較假手術組顯著增加，但24 h后Erk1/2的磷酸化已降至與假手術組相當的水平；術后4、24 h，HI組HIF-1α蛋白表達水平均較假手術組增加。經腹腔注射Rg1后，HI+Rg1組術后4、24 h Erk1/2磷酸化水平和HIF-1α蛋白表達水平均較HI組上調。與p-Erk1/2、HIF-1α類似，HI組CC3蛋白表達在缺血缺氧后也較假手術組顯著增加；而與腹內注射Rg1導致HIBD后p-Erk1/2和HIF-1α表達上調相反，腹內注射Rg1導致HIBD后CC3蛋白表達水平均較同一時間點HI組明顯降低，并在HIBD后24 h觀察到神經元AI下降。
U0126是目前公認的Erk1/2信號通路抑制劑之一，可在體內外針對Erk1/2信號通路發揮高度特異和高親和度的抑制作用[18]。我們通過使用U0126干預Erk1/2信號通路后，發現上述Rg1對p-Erk1/2、HIF-1α蛋白的表達上調和CC3蛋白的表達抑制，以及減少后續神經元凋亡的藥理學效應明顯減弱，即HI+Rg1+U0126組p-Erk1/2、HIF-1α蛋白表達水平較同一時間點HI+Rg1組降低，而CC3蛋白表達水平和HIBD后24 h神經元凋亡水平較同一時間點HI+Rg1組升高。值得注意的是，缺氧缺血應激誘導的Erk1/2磷酸化水平維持時間較短，在HIBD后24 h HIF-1α蛋白表達仍維持在較高水平時Erk1/2已出現去磷酸化改變，提示缺氧缺血刺激Erk1/2磷酸化的高峰可能出現在HIF-1α之前，即缺氧缺血刺激先誘導一過性的Erk1/2磷酸化，以及后續HIF-1α的持續表達；其次，我們發現Rg1可增強并維持缺氧缺血誘導的Erk1/2磷酸化和HIF-1α的持續表達，并抑制Caspase-3活化及后續的神經元凋亡，而用U0126干預后，可抑制Rg1誘導的Erk1/2磷酸化和HIF-1α持續表達，增強Caspase-3的活化并伴隨后續神經元凋亡增加。結合既往研究結果[3, 18]，我們認為Rg1通過Erk1/2信號通路增強缺氧缺血刺激對HIF-1α的誘導表達，從而抑制Caspase-3的活化并最終增強神經元的存活能力，可能是新生鼠HIBD損傷后修復的機制之一。
圍生期窒息引起的缺氧缺血性腦損傷（hypoxia ischemia brain damage，HIBD）是導致新生兒死亡及傷殘的重要原因之一，目前我國新生兒死亡原因中出生窒息死亡占28.6%，位居首位[1]。盡管近年來HIBD的死亡率及神經系統后遺癥的發生率較以往有所降低[1]，但新生兒HIBD仍沒有安全有效的治療方法[2]。因此，深入研究HIBD的發病機制，探索干預HIBD損傷的新靶點，對于臨床預防和治療HIBD具有重要意義。
本課題組既往研究已證實人參皂苷Rg1可通過增強并穩定缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）信號途徑，抑制半胱天冬氨酸酶3（Caspase-3）的活化，在新生鼠HIBD中發揮抗凋亡的神經保護作用[3]。但該作用過程中，有哪些信號通路參與及相關分子機制尚不清楚。本次研究通過建立新生鼠HIBD模型并給予不同干預藥物，觀察人參皂苷Rg1對HIF-1α信號軸有關的激酶、核轉錄因子、凋亡相關蛋白等效應分子在HIBD損傷及修復中的作用及相互關系，以期探明人參皂苷Rg1抗HIBD損傷的可能作用機制，為Rg1用于臨床新生兒HIBD的治療提供藥理學理論依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10日齡SPF級SD大鼠48只，雌雄不拘，體質量17～21 g，由四川省人民醫院動物實驗中心提供。
人參皂甙Rg1（純度 > 98%，南京澤郎醫藥科技有限公司）；兔抗大鼠胞外信號相關蛋白激酶1/2（extracellular signal-related protein kinase 1/2，Erk1/2）多克隆抗體（1：1 000）、兔抗大鼠磷酸化Erk1/2（phospho-Erk1/2，p-Erk1/2）多克隆抗體（1：1 000）、兔抗大鼠活化Caspase-3（cleaved Caspase-3，CC3）多抗（Cell Signaling公司，美國）；兔抗大鼠HIF-1α多抗（Santa Cruz公司，美國）；U0126小鼠抗大鼠β-actin單抗（Sigma公司，美國）；山羊抗兔/山羊抗小鼠SP免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體、BCA蛋白定量試劑盒（Bio-Rad公司，美國）；ECL化學發光顯色試劑盒（Millipore公司，美國）；DAB顯色試劑盒（KPL公司，美國）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司，美國）。顯微鏡及圖象采集與分析系統（Leica公司，德國）；凝膠成像儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將48只大鼠隨機分為4組（n=12）：假手術組、模型組（HI組）、模型+人參皂甙Rg1組（HI+ Rg1組）、模型+人參皂甙Rg1+U0126干預組（HI+Rg1+U0126組）。
HI組、HI+Rg1組、HI+Rg1+U0126組大鼠按照文獻[3]方法制備HIBD模型。大鼠乙醚麻醉后仰臥位固定，作頸正中切口，分離并結扎右側頸總動脈，縫合皮膚切口。30 min后放入缺氧容器，92% N2及8% O2的低氧混合氣通氣2.5 h，制備HIBD模型。假手術組僅分離右側頸總動脈后關閉切口，不結扎，不進行低氧通氣。HI+Rg1+U0126組于造模前1 h右側腦室注射給藥，具體步驟：乙醚麻醉后俯臥位固定，對耳線前緣作頭皮正中切口，暴露前囟，于前囟向后1 mm、矢狀縫向右1.5 mm處，以與顱骨切線90°的方向進針，進針深度3 mm；注射U0126，給藥劑量為25 μg/kg，溶于5 μL PBS（含2% DMSO），注射時間控制在10 min左右，注射完畢原位保持3 min，然后緩緩將注射器拔出，縫合皮膚。為消除側腦室注射及溶劑本身的影響，除HI+Rg1+U0126組外的其余3組同法注射相同體積溶劑，其中假手術組于分離右側頸總動脈前1 h注射5 μL PBS（含2% DMSO），HI組及HI+Rg1組于造模前1 h注射5 μL PBS（含2% DMSO）。HI+Rg1組及HI+Rg1+U0126組于術后即刻腹腔內注射0.1 mL含Rg1（40 mg/ kg）的生理鹽水；HI組和假手術組于相同時間點腹腔內注射0.1 mL生理鹽水。
1.3 觀測指標
1.3.1 Western blot檢測Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表達
各組術后4、24 h取3只實驗動物，距離側腦室注射部位前、后各3 mm，冠狀切取右側半球皮層和海馬腦組織，用含有磷酸酶抑制劑的預冷RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，上樣量均為100 μg/孔。8%SDS-PAGE（Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和β-actin蛋白）電泳及12%SDS-PAGE（CC3蛋白）電泳，濕法轉膜至聚偏氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白封閉，一抗室溫孵育1 h，4℃過夜（抗體稀釋濃度分別為HIF-1α 1：200，Erk1/2、p-Erk1/2、CC3均為1：1 000，β-actin 1：3 000），二抗室溫孵育1 h（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/山羊抗鼠IgG，1：3 000），含0.1% Tween20的TBS洗膜后ECL化學發光試劑盒曝光顯影，凝膠成像儀獲取圖像，用成像儀自帶分析軟件測定條帶積分吸光度（IA）值，計算目的蛋白和β-actin的IA比值作為目的蛋白相對表達量。
1.3.2 免疫組織化學染色檢測Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α、CC3蛋白表達
各組術后4、24 h另取3只實驗動物，距離側腦室注射部位前、后各1 mm，冠狀切取右側半球皮層和海馬腦組織，用預冷4%多聚甲醛灌注固定，石蠟包埋，脫蠟至水，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，抗原熱修復后山羊血清封閉30 min，滴加HIF-1α抗體（1：50）或Erk1/2、p-Erk1/2、CC3抗體（1：200），PBS代替一抗作為陰性對照。37℃孵育1 h，4℃孵育過夜。后續步驟參照文獻[3]方法進行。光鏡下觀察陽性細胞顯色為棕黃色或棕褐色，每個標本于400倍鏡下觀察2個視野，圖像分析軟件測定陽性染色IA值，取均值。
1.3.3 TUNEL染色檢測原位神經元凋亡
取1.3.2中制備的部分切片，按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，DAB顯色。結果判定：胞核為棕黃色或棕褐色的細胞為凋亡細胞。每個標本于400倍鏡下隨機觀察2個視野，計數陽性細胞數和細胞總數，取均值；并根據以下公式計算凋亡指數（apoptotic index，AI），AI=陽性細胞數/細胞總數×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Western blot檢測
各時間點各組均有Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α、CC3蛋白表達（圖 1）。術后4、24 h各組Erk1/2蛋白表達比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。術后4、24 h，HI組HIF-1α、CC3蛋白表達均較假手術組明顯增加（P < 0.05）；術后4 h，HI組p-Erk1/2蛋白表達較假手術組明顯增加（P < 0.05），24 h時差異無統計學意義（P > 0.05）。術后4、24 h，HI+Rg1組p-Erk1/2及HIF-1α蛋白表達較HI組明顯上調（P < 0.05），而CC3蛋白表達明顯下調（P < 0.05）。術后4、24 h，HI+Rg1+U0126組p-Erk1/2及HIF-1α蛋白表達較HI+Rg1組明顯下調（P < 0.05），而CC3蛋白表達則明顯上調（P < 0.05）。見表 1。
圖1
Western blot檢測各組Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表達??1：假手術組4 h ??2：HI組4 h ??3：HI+Rg1組4 h ??4：HI+ Rg1+U0126組4 h ??5：假手術組24 h ??6：HI組24 h ??7：HI+Rg1組24 h ??8：HI+Rg1+U0126組24 h
Figure1.
Expressions of Erk1/2, p-Erk1/2, HIF-1α, and CC3 proteins by Western blot ??1: Sham group at 4 hours ??2: HI group at 4 hours ??3: HI+Rg1 group at 4 hours ??4: HI+Rg1+U0126 group at 4 hours ??5: Sham group at 24 hours ??6: HI group at 24 hours ??7: HI+Rg1 group at 24 hours 8: HI+Rg1+U0126 group at 24 hours
表1
術后4、24 h各組Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白表達比較（n=3，2.2 免疫組織化學染色觀察
鏡下各組均可見Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白陽性染色。其中，Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表達主要分布于腦皮層和海馬區等，亞細胞定位主要集中在細胞質（圖 2、3）；HIF-1α蛋白表達主要分布于大腦皮層、海馬區、齒狀回及灰質核，亞細胞定位主要集中在細胞核及細胞質（圖 4）；CC3蛋白主要分布于皮層及海馬區等，亞細胞定位于細胞核和細胞質（圖 5）。
圖2
免疫組織化學染色觀察術后24 h各組Erk1/2蛋白表達（SABC×400）???假手術組???HI組???HI+Rg1組???HI+Rg1+ U0126組??圖 3?免疫組織化學染色觀察術后24 h各組p-Erk1/2蛋白表達（SABC×400）???假手術組???HI組???HI+Rg1組???HI+Rg1+U0126組??圖 4?免疫組織化學染色觀察術后24 h各組HIF-1α蛋白表達（SABC×400）???假手術組???HI組???HI+Rg1組???HI+Rg1+U0126組
Figure2.
Expression of Erk1/2 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400)???Sham group???HI group???HI+Rg1 group???HI+Rg1+U0126 group ?Fig. 3 Expression of p-Erk1/2 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400)???Sham group???HI group???HI+Rg1 group???HI+Rg1+U0126 group ?Fig. 4 Expression of HIF-1αprotein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400)???Sham group???HI group???HI+Rg1 group???HI+Rg1+U0126 group
圖5
免疫組織化學染色觀察術后24 h各組CC3蛋白表達（SABC×400）???假手術組???HI組???HI+Rg1組???HI+Rg1+U0126組圖 6 TUNEL染色觀察術后24 h各組神經元凋亡情況（×400）???假手術組???HI組???HI+Rg1組???HI+Rg1+U0126組
Figure5.
Expression of CC3 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400)???Sham group???HI group???HI+Rg1 group???HI+Rg1+U0126 group Fig. 6 Apoptosis of neuron in each group at 24 hours by TUNEL staining (×400)???Sham group???HI group???HI+Rg1 group???HI+Rg1+U0126 group
圖像分析軟件測定示，術后4 h，HI組p-Erk1/2蛋白陽性染色IA值與假手術組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；24 h時兩組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。術后4、24 h，HI+Rg1組p-Erk1/2蛋白陽性染色IA值較HI組升高，HI+Rg1+U0126組較HI+Rg1組明顯降低，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
術后4、24 h，HI組HIF-1α蛋白陽性染色IA值較假手術組升高，HI+Rg1組亦較HI組升高，但HI+Rg1+U0126組HIF-1α蛋白陽性染色IA值較HI+Rg1組明顯降低，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
術后4、24 h，HI組CC3蛋白陽性染色IA值較假手術組升高，HI+Rg1組較HI組降低，但HI+Rg1+U0126組較HI+Rg1組明顯升高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
術后4、24 h，各組Erk1/2蛋白陽性染色IA值比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
術后4、24 h各組Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白陽性染色IA值比較（n=3，2.3 TUNEL染色結果
各時間點各組均見陽性細胞，TUNEL陽性細胞主要分布于腦皮層及海馬區，細胞核呈典型棕黃色至棕褐色顆粒（圖 6）。假手術組有少量細胞凋亡；HI組術后凋亡細胞持續增加；HI+Rg1組術后4 h凋亡細胞較多，24 h時較前減少。HI+Rg1+U0126組凋亡細胞多于同一時間點HI+Rg1組。
HI組術后4、24 h AI與假手術組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。術后4 h，HI組、HI+Rg1組以及HI+Rg1+U0126組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后24 h，HI+Rg1組AI較HI組明顯降低，HI+Rg1+U0126組較HI+Rg1組明顯升高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 3。
表3
術后4、24 h各組AI比較（n=3，%，3 討論
新生兒HIBD時缺氧缺血引起的一系列分子信號通路和能量代謝異常，會導致線粒體功能損傷，細胞凋亡信號過度激活，打破了細胞原有的凋亡/抗凋亡通路平衡，啟動細胞凋亡程序[4-5]。而神經元凋亡程度直接決定著HIBD的轉歸及預后，因此如何增強神經元對HIBD損傷的應激能力，減少其凋亡，成為HIBD損傷后腦組織修復研究的關鍵。
HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于人類和哺乳動物細胞內的一種核轉錄因子，是由HIF-1α和HIF-1β亞基構成的異二聚體，HIF-1α是其調節亞基和功能亞基。我們既往研究已證實包括HIBD在內的許多缺氧缺血相關性病理生理過程中有HIF-1α參與[2-3, 5-8]。
局灶性腦缺血所引起的供血障礙可使局部腦組織發生缺血、缺氧，其細胞損害主要表現為凋亡和死亡兩種形式，在發育期腦損傷中以凋亡多見[3, 9]。HIBD損傷引起細胞線粒體膜通透性增高最終會導致Caspase-3活化，Caspase-3是Caspase家族激聯激活后的共同通路和誘導凋亡的關鍵因子，在細胞凋亡進程中處于中心地位，Caspase-3活化形式CC3的出現是神經元凋亡的特征之一[3-4]。其中在缺血半暗帶，即缺血側大腦半球皮層及海馬區域，是細胞凋亡的集中表現區域。因此，本研究中我們選擇上述區域腦組織進行免疫組織化學染色和TUNEL染色分析及Western blot檢測。結果表明，TUNEL陽性細胞率與CC3蛋白表達變化趨勢基本一致，而HIF-1α與CC3蛋白表達呈不同的變化趨勢，這與前期研究結果一致[3, 9]。
近年來研究表明，從五加科植物人參的根莖中提取的活性單體成分——人參皂甙Rg1，具有廣泛的藥理學活性，尤其對神經的保護作用日益受到人們重視[10]。盡管迄今為止尚無人參或人參皂甙Rg1在新生兒臨床應用的報道，但目前所有證據均表明人參成分的毒性與不良反應通常較輕微[11]，提示其具有用于新生兒的可能性。
早期研究發現，人參活性提取物成分可有效減少新生鼠HIBD中海馬神經元的凋亡，從而提高HIBD損傷后新生鼠的存活率[12]。隨后在模擬缺氧缺血環境的體外實驗中發現，人參抗神經元凋亡的保護作用可能與人參皂苷Rg1穩定細胞生物膜功能[13]，刺激腦源性神經營養因子表達[14]以及抑制凋亡相關分子Caspase-3的活化有關[3]，且這一過程伴隨著HIF-1α蛋白表達升高和維持較長時間高表達[3]。這與既往有關中藥復方制劑參麥注射液有助于增強HIBD后HIF-1α表達，從而減少海馬神經元的凋亡[15]，以及在心血管系統中觀察到Rg1對HIF-1α及其下游促血管生成因子的誘導表達一致[16-17]。然而目前尚不清楚人參皂苷Rg1是通過何種信號轉導途徑實現對HIF-1α及其下游凋亡相關效應分子的表達或活性的調控。
Erk1/2屬于絲裂原激活蛋白激酶信號通路，既往研究已明確發育期缺氧缺血鼠腦組織Erk1/2信號通路參與了HIF-1α及其靶基因VEGF的表達調節[18]。最新發表的兩項研究表明，Rg1延緩阿爾茨海默病發生、發展及促進鼠胚胎干細胞向神經元分化的效應可被Erk1/2信號通路的抑制劑阻斷，提示Rg1的上述生物學效應依賴于Erk1/2信號通路的活化[19-20]。那么Erk1/2是否也參與了新生鼠HIBD后Rg1對HIF-1α及其下游凋亡相關效應分子的表達調控，我們進行了相關研究。
本研究結果顯示，假手術組p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表達處于較低水平，HI組造模術后4 h，Erk1/2磷酸化水平較假手術組顯著增加，但24 h后Erk1/2的磷酸化已降至與假手術組相當的水平；術后4、24 h，HI組HIF-1α蛋白表達水平均較假手術組增加。經腹腔注射Rg1后，HI+Rg1組術后4、24 h Erk1/2磷酸化水平和HIF-1α蛋白表達水平均較HI組上調。與p-Erk1/2、HIF-1α類似，HI組CC3蛋白表達在缺血缺氧后也較假手術組顯著增加；而與腹內注射Rg1導致HIBD后p-Erk1/2和HIF-1α表達上調相反，腹內注射Rg1導致HIBD后CC3蛋白表達水平均較同一時間點HI組明顯降低，并在HIBD后24 h觀察到神經元AI下降。
U0126是目前公認的Erk1/2信號通路抑制劑之一，可在體內外針對Erk1/2信號通路發揮高度特異和高親和度的抑制作用[18]。我們通過使用U0126干預Erk1/2信號通路后，發現上述Rg1對p-Erk1/2、HIF-1α蛋白的表達上調和CC3蛋白的表達抑制，以及減少后續神經元凋亡的藥理學效應明顯減弱，即HI+Rg1+U0126組p-Erk1/2、HIF-1α蛋白表達水平較同一時間點HI+Rg1組降低，而CC3蛋白表達水平和HIBD后24 h神經元凋亡水平較同一時間點HI+Rg1組升高。值得注意的是，缺氧缺血應激誘導的Erk1/2磷酸化水平維持時間較短，在HIBD后24 h HIF-1α蛋白表達仍維持在較高水平時Erk1/2已出現去磷酸化改變，提示缺氧缺血刺激Erk1/2磷酸化的高峰可能出現在HIF-1α之前，即缺氧缺血刺激先誘導一過性的Erk1/2磷酸化，以及后續HIF-1α的持續表達；其次，我們發現Rg1可增強并維持缺氧缺血誘導的Erk1/2磷酸化和HIF-1α的持續表達，并抑制Caspase-3活化及后續的神經元凋亡，而用U0126干預后，可抑制Rg1誘導的Erk1/2磷酸化和HIF-1α持續表達，增強Caspase-3的活化并伴隨后續神經元凋亡增加。結合既往研究結果[3, 18]，我們認為Rg1通過Erk1/2信號通路增強缺氧缺血刺激對HIF-1α的誘導表達，從而抑制Caspase-3的活化并最終增強神經元的存活能力，可能是新生鼠HIBD損傷后修復的機制之一。
