引用本文： 任莉榮, 徐永清, 王海, 何曉清, 宋慕國, 陳學秋. 金黃色葡萄球菌肽聚糖對破骨細胞分化的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(8): 1006-1010. doi: 10.7507/1002-1892.20160203 復制
骨髓炎是一種急性或慢性骨組織感染，以化膿性炎癥、異常骨重建、難控性骨吸收為特征[1]，常導致感染性骨不連，是骨科難治疾病之一。金黃色葡萄球菌是臨床最常見的骨髓炎致病菌，但其引起感染性骨不連的機制目前尚未明了。金黃色葡萄球菌肽聚糖（Staphylococcal peptidoglycan，PGN-sa）是金黃色葡萄球菌細胞壁上的重要毒力成分，研究表明其能激發機體炎性反應及免疫反應，導致化膿性關節炎[2]。但對于PGN-sa是否促進破骨細胞形成、導致骨溶解增加尚存在爭議。本研究以不同濃度PGN-sa對raw264.7細胞進行誘導培養，以明確其是否具有促進破骨細胞分化形成的作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
raw264.7細胞由昆明動物研究所提供。H-DMEM（HyClone公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；PGN-sa（Invitrogen公司，美國）；NF-κB受體活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL；R & D Systems公司，美國）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（Sigma公司，美國）。
酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；D90型倒置相差顯微鏡（南京江南光電股份有限公司）；Image-Pro Plus 6.0軟件（Media Cybernetics公司，美國）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；24孔COAS板（Life Sciences公司，美國）。
1.2 實驗分組
根據培養條件不同，實驗分為5組，分別為100 ng/mL PGN-sa組、200 ng/mL PGN-sa組、400 ng/ mL PGN-sa組、陽性對照組（100 ng/mL RANKL）以及空白對照組（PBS）。
1.3 觀測指標
1.3.1 TRAP染色觀察
將raw264.7細胞接種于96孔板，每孔5×103個，加入含15%FBS及1%青、鏈霉素的H-DMEM培養基培養24 h后，更換培養基。將細胞分為5組，每組設5個復孔，分別加入對應濃度的PGN-sa、RANKL及PBS，每3天換液1次。于添加處理因素后第5天按TRAP試劑盒說明書進行染色。具體步驟：用丙酮、枸櫞酸、甲醛混合制成的固定液，37℃固定細胞30 s；去離子水清洗3遍，加入TRAP染液，37℃避光染色1 h；去離子水清洗3遍，蘇木素染色1 min；堿性自來水漂洗3～4遍。倒置相差顯微鏡下觀察，細胞質內見酒石紅色酸性磷酸酶活性顆粒為TRAP染色陽性細胞。將TRAP染色陽性且細胞核≥3個的細胞判斷為破骨樣細胞[3]，于200倍鏡下計數每孔破骨樣細胞。
1.3.2 骨吸收凹陷檢測
將raw264.7細胞接種于24孔COAS板，每孔2×104個，加入含15%FBS及1%青、鏈霉素的H-DMEM培養基培養24 h后，更換培養基。將細胞分為5組，每組設4個復孔，分別加入對應濃度的PGN-sa、RANKL及PBS，每3天換液1次。于添加處理因素后第5天吸棄培養基，PBS漂洗2遍，每孔加入5%次氯酸鈉溶液1 mL，室溫放置5 min，吸棄次氯酸鈉溶液，去離子水漂洗培養板3遍，室溫下放置4 h。光鏡下觀察骨吸收凹陷形成情況，于200倍鏡下照相后，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量骨吸收凹陷面積，并計算每個視野下骨吸收凹陷面積與該視野面積的比值。
1.3.3 MTT檢測
將raw264.7細胞接種于96孔板，每孔5×103個，加入含15%FBS及1%青、鏈霉素的H-DMEM培養基培養24 h后，更換培養基。將細胞分為4組，分別為100 ng/mL PGN-sa組、200 ng/ mL PGN-sa組、400 ng/mL PGN-sa組及空白對照組，每組設10個復孔。按實驗分組分別加入對應濃度PGN-sa及PBS，每3天換液1次。于添加處理因素后第5天行MTT檢測。具體步驟：每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL；避光條件下，于37℃細胞培養箱中繼續培養4 h后，吸棄培養液；每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩10 min，于酶標儀檢測波長570 nm處吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TRAP染色觀察破骨樣細胞形成情況
鏡下見，除空白對照組外，各濃度PGN-sa組及陽性對照組均有破骨樣細胞形成。見圖 1。100 ng/ mL PGN-sa組、200 ng/mL PGN-sa組、400 ng/ mL PGN-sa組以及陽性對照組、空白對照組破骨樣細胞數分別為（107.54±13.23）、（226.77±8.11）、（297.85±9.01）、（580.85±12.14）、（21.23±4.19）個/孔。其中，各濃度PGN-sa組破骨樣細胞數均高于空白對照組，但均低于陽性對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；各濃度PGN-sa組破骨樣細胞隨PGN-sa濃度增加而增多，組間比較差異亦有統計學意義（P < 0.05）。
圖1
各組TRAP染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）???100 ng/mL PGN-sa組??? 200?ng/mL PGN-sa組???400 ng/mL PGN-sa組???陽性對照組???空白對照組圖 2各組骨吸收凹陷觀察（×200）???100 ng/mL PGN-sa組???200 ng/mL PGN-sa組???400 ng/mL PGN-sa組???陽性對照組???空白對照組
Figure1.
TRAP staining observation in every group (Inverted phase contrast microscopy× 200)???100 ng/mL PGN-sa group???200 ng/mL PGN-sa group???400 ng/mL PGN-sa group???Positive control group???Blank control group Fig.2 Bone resorption observation in every group (×200)???100 ng/mL PGN-sa group???200 ng/mL PGN-sa group???400 ng/mL PGN-sa group???Positive control grou???Blank control group
2.2 骨吸收凹陷檢測
除空白對照組外，各濃度PGN-sa組及陽性對照組均見明顯骨吸收凹陷形成。見圖 2。100 ng/mL PGN-sa組、200 ng/mL PGN-sa組、400 ng/mL PGN-sa組骨吸收凹陷面積比值分別為0.002 904±0.000 107、0.004 476±0.000 143、0.005 333±0.000 202，顯著低于陽性對照組的0.009 595±0.001 017，高于空白對照組的0.000 167±0.000 122，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；各濃度PGN-sa組骨吸收凹陷面積比值隨PGN-sa濃度增加也逐漸增大，組間比較差異亦有統計學意義（P < 0.05）。
2.3 MTT檢測
100 ng/mL PGN-sa組、200 ng/mL PGN-sa組、400 ng/mL PGN-sa組A值分別為0.981±0.051、0.984±0.051、0.979±0.049，與空白對照組（0.986±0.047）比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；各濃度PGN-sa組間比較，差異亦無統計學意義（P > 0.05）。
3 討論
感染性骨不連是骨髓炎的治療難點之一，隨著骨科手術假體使用的增多及開放性骨折發生率的增加，感染性骨不連發生率也隨之上升，據報道5%～10%的骨折會發展為骨不連[4]。此外，骨髓炎最為常見的致病菌金黃色葡萄球菌耐藥性及侵襲性增加，使得骨髓炎治療更困難[5-6]。目前，國內外學者主要從成骨分化[7]及骨形成方面[8-9]研究感染條件下感染性骨不連的發生機制，而致病菌對破骨細胞的分化形成及其對破骨細胞活性的影響方面研究較少。
金黃色葡萄球菌可產生多種細胞外及細胞相關的毒力因子，導致機體損傷[10]。PGN-sa是金黃色葡萄球菌細胞壁上的重要組成成分，本研究發現經PGN-sa培養后，raw264.7細胞在形態上形成了TRAP染色陽性且多核的破骨樣細胞，破骨樣細胞形成數目與PGN-sa濃度存在一定劑量關系；骨吸收凹陷實驗可見骨吸收凹陷的形成，從功能上驗證了所形成的破骨樣細胞具有骨吸收活性，表明PGN-sa具有促進破骨細胞分化形成的作用。這一結果與Kishimoto等[11]及Kim等[12]的研究結果相同，但與Takami等[13]的研究結果存在不同之處，其研究得出PGN-sa抑制了所誘導的破骨細胞分化形成。究其原因，可能與所采用的破骨細胞前體細胞不同有關。Kobayashi等[14]用骨髓誘導方法，采用巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）及RANKL誘導骨髓遠祖細胞獲得破骨細胞前體細胞，由于實驗開始于骨髓遠祖細胞，破骨細胞前體細胞的形成率及細胞所處分化時期，明顯受M-CSF及RANKL的濃度及作用時間影響，而且誘導獲得的破骨細胞前體細胞為多種細胞的混合體，對觀測結果產生一定影響。而本研究采用已成系的破骨細胞前體細胞raw264.7[15]，該細胞株處于分化晚期[16]，采用RANKL即可促進其分化形成成熟的破骨細胞[17]，甚至在無RANKL的情況下，LIGHT、IL-6、IL-8、TNF-α等也可誘導其分化為成熟的破骨細胞[18]。因此本實驗選擇raw264.7細胞作為研究對象，使結果更可靠。
此外，在體外實驗方面，有學者對金黃色葡萄球菌及其表面相關蛋白及物質進行研究，發現其能誘導破骨細胞分化形成及激活[19-20]。Kim等[12]的研究也發現，細菌脂類蛋白通過誘導破骨細胞分化形成及激活，進而在骨破壞過程中起重要作用。在體內實驗方面，Liu等[2]將PGN-sa注射至小鼠關節內，發現其引起了化膿性關節炎及骨、軟骨的破壞。本研究發現PGN-sa能促進破骨細胞的分化形成，與上述研究結果一致。但是，PGN-sa雖然為金黃色葡萄球菌細胞壁上一毒性因子，在本研究實驗濃度下，其對raw264.7細胞的增殖活性無顯著影響，提示在慢性低毒性感染條件下，PGN-sa更多的體現其免疫原性而非毒性。但PGN-sa只是金黃色葡萄球菌眾多毒性因子的一部分，在感染情況下金黃色葡萄球菌作為一種活菌，除了細胞壁的毒性因子外，還能合成分泌一些毒性因子，其作為一個整體對破骨細胞的誘導分化作用需要進一步研究及驗證，而PGN-sa通過何種信號通路促進破骨細胞分化也需進一步研究。
綜上述，體外實驗提示PGN-sa可促進破骨細胞的分化形成，而破骨細胞分化形成的增多，可導致溶骨活性的增強，進而成為感染性骨不連的一個重要原因。由此也提示，金黃色葡萄球菌骨髓炎中感染性骨不連的成因，除了感染導致的成骨不全外，還存在感染導致的破骨活性增加。因此，從成骨不全及破骨增加兩方面，對感染性骨不連進行深入研究，探討其機制，有望對骨髓炎的治療提供理論依據及策略。
骨髓炎是一種急性或慢性骨組織感染，以化膿性炎癥、異常骨重建、難控性骨吸收為特征[1]，常導致感染性骨不連，是骨科難治疾病之一。金黃色葡萄球菌是臨床最常見的骨髓炎致病菌，但其引起感染性骨不連的機制目前尚未明了。金黃色葡萄球菌肽聚糖（Staphylococcal peptidoglycan，PGN-sa）是金黃色葡萄球菌細胞壁上的重要毒力成分，研究表明其能激發機體炎性反應及免疫反應，導致化膿性關節炎[2]。但對于PGN-sa是否促進破骨細胞形成、導致骨溶解增加尚存在爭議。本研究以不同濃度PGN-sa對raw264.7細胞進行誘導培養，以明確其是否具有促進破骨細胞分化形成的作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
raw264.7細胞由昆明動物研究所提供。H-DMEM（HyClone公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；PGN-sa（Invitrogen公司，美國）；NF-κB受體活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL；R & D Systems公司，美國）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（Sigma公司，美國）。
酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；D90型倒置相差顯微鏡（南京江南光電股份有限公司）；Image-Pro Plus 6.0軟件（Media Cybernetics公司，美國）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；24孔COAS板（Life Sciences公司，美國）。
1.2 實驗分組
根據培養條件不同，實驗分為5組，分別為100 ng/mL PGN-sa組、200 ng/mL PGN-sa組、400 ng/ mL PGN-sa組、陽性對照組（100 ng/mL RANKL）以及空白對照組（PBS）。
1.3 觀測指標
1.3.1 TRAP染色觀察
將raw264.7細胞接種于96孔板，每孔5×103個，加入含15%FBS及1%青、鏈霉素的H-DMEM培養基培養24 h后，更換培養基。將細胞分為5組，每組設5個復孔，分別加入對應濃度的PGN-sa、RANKL及PBS，每3天換液1次。于添加處理因素后第5天按TRAP試劑盒說明書進行染色。具體步驟：用丙酮、枸櫞酸、甲醛混合制成的固定液，37℃固定細胞30 s；去離子水清洗3遍，加入TRAP染液，37℃避光染色1 h；去離子水清洗3遍，蘇木素染色1 min；堿性自來水漂洗3～4遍。倒置相差顯微鏡下觀察，細胞質內見酒石紅色酸性磷酸酶活性顆粒為TRAP染色陽性細胞。將TRAP染色陽性且細胞核≥3個的細胞判斷為破骨樣細胞[3]，于200倍鏡下計數每孔破骨樣細胞。
1.3.2 骨吸收凹陷檢測
將raw264.7細胞接種于24孔COAS板，每孔2×104個，加入含15%FBS及1%青、鏈霉素的H-DMEM培養基培養24 h后，更換培養基。將細胞分為5組，每組設4個復孔，分別加入對應濃度的PGN-sa、RANKL及PBS，每3天換液1次。于添加處理因素后第5天吸棄培養基，PBS漂洗2遍，每孔加入5%次氯酸鈉溶液1 mL，室溫放置5 min，吸棄次氯酸鈉溶液，去離子水漂洗培養板3遍，室溫下放置4 h。光鏡下觀察骨吸收凹陷形成情況，于200倍鏡下照相后，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量骨吸收凹陷面積，并計算每個視野下骨吸收凹陷面積與該視野面積的比值。
1.3.3 MTT檢測
將raw264.7細胞接種于96孔板，每孔5×103個，加入含15%FBS及1%青、鏈霉素的H-DMEM培養基培養24 h后，更換培養基。將細胞分為4組，分別為100 ng/mL PGN-sa組、200 ng/ mL PGN-sa組、400 ng/mL PGN-sa組及空白對照組，每組設10個復孔。按實驗分組分別加入對應濃度PGN-sa及PBS，每3天換液1次。于添加處理因素后第5天行MTT檢測。具體步驟：每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL；避光條件下，于37℃細胞培養箱中繼續培養4 h后，吸棄培養液；每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩10 min，于酶標儀檢測波長570 nm處吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TRAP染色觀察破骨樣細胞形成情況
鏡下見，除空白對照組外，各濃度PGN-sa組及陽性對照組均有破骨樣細胞形成。見圖 1。100 ng/ mL PGN-sa組、200 ng/mL PGN-sa組、400 ng/ mL PGN-sa組以及陽性對照組、空白對照組破骨樣細胞數分別為（107.54±13.23）、（226.77±8.11）、（297.85±9.01）、（580.85±12.14）、（21.23±4.19）個/孔。其中，各濃度PGN-sa組破骨樣細胞數均高于空白對照組，但均低于陽性對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；各濃度PGN-sa組破骨樣細胞隨PGN-sa濃度增加而增多，組間比較差異亦有統計學意義（P < 0.05）。
圖1
各組TRAP染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）???100 ng/mL PGN-sa組??? 200?ng/mL PGN-sa組???400 ng/mL PGN-sa組???陽性對照組???空白對照組圖 2各組骨吸收凹陷觀察（×200）???100 ng/mL PGN-sa組???200 ng/mL PGN-sa組???400 ng/mL PGN-sa組???陽性對照組???空白對照組
Figure1.
TRAP staining observation in every group (Inverted phase contrast microscopy× 200)???100 ng/mL PGN-sa group???200 ng/mL PGN-sa group???400 ng/mL PGN-sa group???Positive control group???Blank control group Fig.2 Bone resorption observation in every group (×200)???100 ng/mL PGN-sa group???200 ng/mL PGN-sa group???400 ng/mL PGN-sa group???Positive control grou???Blank control group
2.2 骨吸收凹陷檢測
除空白對照組外，各濃度PGN-sa組及陽性對照組均見明顯骨吸收凹陷形成。見圖 2。100 ng/mL PGN-sa組、200 ng/mL PGN-sa組、400 ng/mL PGN-sa組骨吸收凹陷面積比值分別為0.002 904±0.000 107、0.004 476±0.000 143、0.005 333±0.000 202，顯著低于陽性對照組的0.009 595±0.001 017，高于空白對照組的0.000 167±0.000 122，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；各濃度PGN-sa組骨吸收凹陷面積比值隨PGN-sa濃度增加也逐漸增大，組間比較差異亦有統計學意義（P < 0.05）。
2.3 MTT檢測
100 ng/mL PGN-sa組、200 ng/mL PGN-sa組、400 ng/mL PGN-sa組A值分別為0.981±0.051、0.984±0.051、0.979±0.049，與空白對照組（0.986±0.047）比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；各濃度PGN-sa組間比較，差異亦無統計學意義（P > 0.05）。
3 討論
感染性骨不連是骨髓炎的治療難點之一，隨著骨科手術假體使用的增多及開放性骨折發生率的增加，感染性骨不連發生率也隨之上升，據報道5%～10%的骨折會發展為骨不連[4]。此外，骨髓炎最為常見的致病菌金黃色葡萄球菌耐藥性及侵襲性增加，使得骨髓炎治療更困難[5-6]。目前，國內外學者主要從成骨分化[7]及骨形成方面[8-9]研究感染條件下感染性骨不連的發生機制，而致病菌對破骨細胞的分化形成及其對破骨細胞活性的影響方面研究較少。
金黃色葡萄球菌可產生多種細胞外及細胞相關的毒力因子，導致機體損傷[10]。PGN-sa是金黃色葡萄球菌細胞壁上的重要組成成分，本研究發現經PGN-sa培養后，raw264.7細胞在形態上形成了TRAP染色陽性且多核的破骨樣細胞，破骨樣細胞形成數目與PGN-sa濃度存在一定劑量關系；骨吸收凹陷實驗可見骨吸收凹陷的形成，從功能上驗證了所形成的破骨樣細胞具有骨吸收活性，表明PGN-sa具有促進破骨細胞分化形成的作用。這一結果與Kishimoto等[11]及Kim等[12]的研究結果相同，但與Takami等[13]的研究結果存在不同之處，其研究得出PGN-sa抑制了所誘導的破骨細胞分化形成。究其原因，可能與所采用的破骨細胞前體細胞不同有關。Kobayashi等[14]用骨髓誘導方法，采用巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）及RANKL誘導骨髓遠祖細胞獲得破骨細胞前體細胞，由于實驗開始于骨髓遠祖細胞，破骨細胞前體細胞的形成率及細胞所處分化時期，明顯受M-CSF及RANKL的濃度及作用時間影響，而且誘導獲得的破骨細胞前體細胞為多種細胞的混合體，對觀測結果產生一定影響。而本研究采用已成系的破骨細胞前體細胞raw264.7[15]，該細胞株處于分化晚期[16]，采用RANKL即可促進其分化形成成熟的破骨細胞[17]，甚至在無RANKL的情況下，LIGHT、IL-6、IL-8、TNF-α等也可誘導其分化為成熟的破骨細胞[18]。因此本實驗選擇raw264.7細胞作為研究對象，使結果更可靠。
此外，在體外實驗方面，有學者對金黃色葡萄球菌及其表面相關蛋白及物質進行研究，發現其能誘導破骨細胞分化形成及激活[19-20]。Kim等[12]的研究也發現，細菌脂類蛋白通過誘導破骨細胞分化形成及激活，進而在骨破壞過程中起重要作用。在體內實驗方面，Liu等[2]將PGN-sa注射至小鼠關節內，發現其引起了化膿性關節炎及骨、軟骨的破壞。本研究發現PGN-sa能促進破骨細胞的分化形成，與上述研究結果一致。但是，PGN-sa雖然為金黃色葡萄球菌細胞壁上一毒性因子，在本研究實驗濃度下，其對raw264.7細胞的增殖活性無顯著影響，提示在慢性低毒性感染條件下，PGN-sa更多的體現其免疫原性而非毒性。但PGN-sa只是金黃色葡萄球菌眾多毒性因子的一部分，在感染情況下金黃色葡萄球菌作為一種活菌，除了細胞壁的毒性因子外，還能合成分泌一些毒性因子，其作為一個整體對破骨細胞的誘導分化作用需要進一步研究及驗證，而PGN-sa通過何種信號通路促進破骨細胞分化也需進一步研究。
綜上述，體外實驗提示PGN-sa可促進破骨細胞的分化形成，而破骨細胞分化形成的增多，可導致溶骨活性的增強，進而成為感染性骨不連的一個重要原因。由此也提示，金黃色葡萄球菌骨髓炎中感染性骨不連的成因，除了感染導致的成骨不全外，還存在感染導致的破骨活性增加。因此，從成骨不全及破骨增加兩方面，對感染性骨不連進行深入研究，探討其機制，有望對骨髓炎的治療提供理論依據及策略。
