引用本文： 張輝, 王茜, 甘洪全, 史偉, 劉永慶, 張大鵬, 李琪佳, 王志強. 多孔鉭復合BMP-7修復兔軟骨及軟骨下骨缺損的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(7): 836-842. doi: 10.7507/1002-1892.20160171 復制
軟骨損傷和缺損是目前世界骨科領域面臨的難題之一，治療方法有骨移植、生物活性支架材料替代、人工假體置換等。骨移植是臨床上最常用方法，但自體骨來源有限且會對患者造成二次傷害，同種異體骨可能存在排斥反應和傳染疾病等問題。生物活性支架材料的微觀結構與松質骨相似，適合于骨的長入和礦化，但力學強度不足，在關節、脊柱等負重較大的部位應用常受到限制[1-2]；醫用金屬材料強度高、硬度高，韌性、抗疲勞性較好，但彈性模量遠高于正常骨，易引起應力遮擋，導致假體松動[3]。而多孔金屬鉭具有十二面體排列的空間立體微觀結構，在其內部具有縱橫交錯、相互連通的微孔結構，使其具有孔隙率高、彈性模量低及表面摩擦系數高等物理特性；同時，其具有生物相容性好、抗腐蝕能力強以及具備良好骨傳導性的生物學特性，使其成為理想的骨缺損修復材料[4]。BMP-7又稱成骨蛋白1，是BMP家族中的一員[5]。BMP-7具有很強的異位成骨作用，可在異位誘導新骨形成，在體外能促進軟骨細胞增殖，增強軟骨細胞外基質合成，促進蛋白聚糖和Ⅱ型膠原分泌，在骨缺損修復及軟骨分化過程中發揮重要作用[6-9]。有研究報道，應用腺病毒作為載體將BMP-7基因重組至兔軟骨細胞中，將細胞體外培養后植入兔關節軟骨缺損模型，發現其軟骨缺損修復明顯好于未植入細胞的兔關節軟骨缺損組[10]。我們的前期研究發現，BMP-7與多孔鉭復合后能促進體外軟骨細胞增殖及細胞外基質分泌，促進軟骨基因表達[11]。本研究進一步將多孔鉭與BMP-7復合后，植入兔股骨內髁軟骨缺損模型，通過大體觀察、組織學觀察、掃描電鏡、Micro-CT等方法，觀察復合物對兔關節軟骨及軟骨下骨缺損修復的情況，為多孔鉭的臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
成年新西蘭大耳白兔48只，雌雄不限，體質量2.5～3.0 kg，由華北理工大學實驗動物中心提供。
體內植入的多孔鉭件（重慶潤澤醫療器械有限公司），采用粉末澆注高溫煅燒技術制成直徑4 mm、長10 mm的圓柱體，分別按順序在蒸餾水、丙酮溶液及70%乙醇溶液中超聲清洗20 min，蒸餾水清洗、高壓蒸汽滅菌后備用。多孔鉭表面及斷面可見分布均勻的呈立體連通的蜂窩狀結構，孔徑400～600μm，孔隙率75%～85%。500倍掃描電鏡觀察可見分布均勻的直徑400～600μm的微孔結構，1 000倍掃描電鏡下可見微孔直徑為50～200μm，且微孔的孔隙間相互連通。見圖 1。
圖1
多孔鉭外觀及微觀結構觀察?多孔鉭外觀?掃描電鏡觀察（×500）?掃描電鏡觀察（×1 000）??圖 2術后各時間點各組軟骨修復情況大體觀察?A組4周?A組8周?A組12周?B組4周?B組8周?B組12周?C組4周?C組8周?C組12周
Figure1.
Appearance and microstructure observation of porous tantalum ?General observation ?SEM observation (×500) ?SEM observation (×1 000) ??Fig. 2 General observation of cartilage repair? after?operation ?Group A at 4 weeks ?Group A at 8 weeks ?Group A at 12 weeks ?Group B at 4 weeks ?Group B at 8 weeks ?Group B at 12 weeks ?Group C at 4 weeks ?Group C at 8?weeks ?Group C at 12 weeks
重組人BMP-7（recombinant human BMP-7，rhBMP-7；ProSpec公司，以色列）。JSM-6030LV掃描電鏡（電子株式會社，日本）；Leica1600硬組織切片機（Leica公司，德國）；SP2600銑片機、Minimet1000磨片機（Buehler公司，美國）；eXplore Locus SP型Micro-CT（GE公司，美國）。Advanced Bone Analysis軟件（GE Healthcare公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 復合BMP-7多孔鉭材料制備
取5 mg rhBMP-7溶入10 mL濃度為6 mol/L的尿素溶液，將多孔鉭材料浸入其中，4℃放置12 h，然后冰凍干燥處理，透析除水，氯仿蒸氣消毒后備用。
1.2.2 實驗分組及方法
取48只新西蘭大白兔隨機分為3組，分別為復合BMP-7多孔鉭組（A組）、多孔鉭組（B組）及對照組（C組），每組16只。實驗動物以5%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉后，取右側膝前正中切口，長約2 cm，沿髕骨內緣切開關節囊，將髕骨向外脫出后顯露股骨內髁，克氏針鉆孔后以直徑4 mm鉆頭沿股骨軸向鉆孔，深度約6 mm，制備兔股骨內髁軟骨缺損模型。生理鹽水沖洗傷口后，A、B組分別植入直徑4 mm、長約5 mm的復合BMP-7多孔鉭及多孔鉭，C組不植入材料。再次沖洗后逐層縫合傷口，術后單籠飼養，允許患肢負重；術后3?d每天用絡合碘消毒傷口并肌肉注射青霉素8萬U預防感染。每組分別于術后4、8、16周采用空氣栓塞法各處死5只實驗動物，取出術側股骨，于股骨髁上0.5 cm處切斷，保留帶有植入材料的髁部，進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 動物術后觀察
術后觀察動物存活、切口愈合及活動情況。
1.3.2 大體觀察
術后各時間點肉眼觀察3組軟骨缺損部位大體愈合情況，A、B組按軟骨缺損修復大體觀察評分標準[12-13]評價修復效果。
1.3.3 掃描電鏡觀察
術后各時間點取出A、B組植入材料，0.1%PBS清洗2遍，叔丁醇梯度脫水，—?10℃冰凍1 h，真空干燥機內干燥，將材料用導電膠固定于銅臺上，噴金，掃描電鏡觀察材料表面軟骨組織及骨組織生長情況。
1.3.4 組織學觀察
術后各時間點A、B組大體觀察后，將植入材料連同周圍0.5 cm組織取出，固定、脫水、滲透、包埋、切片，片厚20μm，甲苯胺藍染色，光鏡下觀察組織空隙內軟骨及骨長入情況和多孔鉭周圍成骨情況。
1.3.5 Micro-CT觀測
術后16周A、B組各隨機選取3只動物標本，對多孔鉭及周圍骨質進行Micro-CT掃描，行三維重建并行骨形態計量學分析，觀察并分析各組材料與組織接觸界面及周圍的骨質情況。取多孔鉭材料周圍直徑5 mm的圓柱狀區域為感興趣區域，設定重建閾值為1 000，采用Advanced Bone Analysis軟件分析。軟件自動生成的主要參數包括：骨小梁間隙（trabecular bone space，Tb.Sp）、組織骨密度（trabecular mineral density，TMD）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數目（trabecular number，Tb.N）、骨體積分數（bone volume fraction，BV/TV）。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 動物術后觀察
手術均順利完成，實驗動物均于術后3 h內自然蘇醒，自行飲水；2 d后進食情況同術前；3～5 d術側肢體可部分負重，2周后基本恢復正常步態；手術切口均Ⅰ期愈合，縫線自行脫落。共有5只動物（A組1只、B組2只、C組2只）因腹瀉死亡，后期均予以補齊。
2.2 大體觀察
A組術后4周可見缺損區域植入材料表面出現少量軟骨樣組織，8、16周缺損部位逐漸被新生軟骨組織完全覆蓋，表面平整光滑；B組術后4周缺損區域植入材料表面未見新生軟骨組織，8、16周缺損部位也逐漸覆蓋新生軟骨組織，但表面不平整，修復程度較A組差；C組術后4、8、16周缺損區均未修復，表面逐漸被纖維組織填充。見圖 2。除術后4周A、B組軟骨缺損修復大體觀察評分比較差異無統計學意義（P > 0.05）外，術后8、16周A組評分均高于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點A、B組軟骨缺損修復大體觀察評分比較（n=5，2.3 掃描電鏡觀察
術后4周，A、B組材料表面均可見少量鈣鹽沉積及新生軟骨和成骨細胞，成骨細胞通過偽足附著于多孔鉭表面，孔隙內有少量新生骨組織長入，但B組材料表面鈣鹽沉積及新生軟骨和成骨細胞較A組少。8、16周，A組材料表面逐漸出現較多鈣鹽沉積，新生軟骨及成骨細胞連接成片狀，細胞外基質逐漸覆蓋多孔鉭表面，孔隙內出現大量新生骨組織長入；B組材料表面鈣鹽沉積數量及細胞外基質覆蓋度均不及A組。見圖 3。
圖3
術后各時間點A、B組掃描電鏡觀察（×1 000）?A組4周?A組8周?A組12周?B組4周?B組8周?B組12周??圖 4術后各時間點A、B組組織學觀察（甲苯胺藍×200）?A組4周?A組8周?A組12周?B組4周?B組8周?B組12周
Figure3.
SEM observation of scaffolds in groups A and B after?operation (×1 000) ?Group A at 4 weeks ?Group A at 8 weeks ?Group A at 12 weeks ?Group B at 4 weeks δGroup B at 8 weeks ?Group B at 12 weeks ??Fig. 4 Histological observation?in groups A and B ?after?operation (Toluidine blue×200) ?Group A at 4 weeks ?Group A at 8 weeks ?Group A at 12 weeks ?Group B at 4 weeks ?Group B at 8 weeks ?Group B at 12 weeks
2.4 組織學觀察
甲苯胺藍染色示，術后4周，A、B組宿主骨斷端界面均可見少量新生軟骨和成骨細胞，多孔鉭表面成骨細胞附著較少，骨組織部分結合多孔鉭表面。8周，A、B組多孔鉭界面新生軟骨及骨組織均明顯增加，新生骨小梁出現并向多孔鉭孔隙內生長，兩組軟骨缺損區域已部分被新生軟骨樣組織覆蓋，新生軟骨組織與多孔鉭結合較為緊密。4、8周時，A組多孔鉭表面新生軟骨和成骨細胞較B組多。16周，A、B組多孔鉭表面緊密附著大量新生骨組織，無纖維包囊，較多骨小梁向多孔鉭孔隙內生長，并與周圍皮質骨相連；A組軟骨缺損區域已完全被新生軟骨組織覆蓋，新生軟骨組織與多孔鉭結合非常緊密，與周圍正常軟骨組織結合在一起，B組軟骨缺損區域大部分被新生軟骨組織覆蓋。見圖 4。
2.5 Micro-CT觀測
術后16周，A組TMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均高于B組，Tb.Sp低于B組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
術后16周A、B組材料骨形態計量學分析結果（n=5，3 討論
軟骨及軟骨下骨的損傷和缺損是骨科領域難題之一，骨移植材料替代是目前治療軟骨缺損的方法之一。適宜的骨移植材料不僅需要具有通透的空間結構、合適的力學特性，還需有一定的骨誘導性，即良好的骨長入特性；同時，軟骨缺損多伴有軟骨下骨損傷，因此適宜的軟骨缺損修復材料除具備上述性能外，還應為軟骨下骨缺損提供良好支撐，為軟骨損傷修復提供支撐平臺。
多孔鉭材料因具有良好的生物相容性、較高的孔隙率（75%～80%）、適合骨組織長入的孔徑大小（400～600μm）及與人體松質骨相似的彈性模量（0.2～0.5 GPa），也被稱作“金屬小梁”，其良好的空間三維立體結構利于骨組織長入，并可為細胞、血管、組織代謝產物及營養物質運輸提供有利的空間環境[14]。有研究發現多孔鉭具備良好的組織相容性及骨長入特性[15]，在國內外關節置換或翻修術后骨缺損、股骨頭缺血性壞死后骨缺損等中多有應用[16]。但多孔鉭作為金屬小梁，其金屬特性制約了骨誘導性。為改善多孔鉭的生物活性、加速骨長入時間，有研究者采用生物活性因子（如BMP系列因子）與材料相結合，可有效提高材料的生物活性，促進細胞成骨分化，如BMP-7可誘導未分化MSCs向軟骨細胞和成骨細胞方向分化，在骨缺損修復過程中發揮重要作用[6-7]。目前多為多孔材料復合生物活性因子對成骨方面的研究[17]，對軟骨缺損修復的報道較少見。鑒于此，本研究采用多孔鉭材料與BMP-7復合后植入兔股骨內髁軟骨缺損模型，通過大體觀察、組織學、掃描電鏡等方法，觀察多孔鉭與BMP-7復合后對兔關節軟骨及軟骨下骨缺損修復的情況。
本研究成功建立了兔股骨內髁軟骨缺損模型，軟骨缺損區域選擇股骨內髁負重區，因軟骨負重區是臨床疾病好發部位，選取股骨內髁負重區較符合臨床實驗研究特點。Shapiro等[18]認為缺損直徑< 3?mm，深度達不到軟骨下骨，6周后可自行部分或全部修復，故本研究中軟骨缺損區域直徑為4 mm；而兔軟骨厚度為1～2 mm，深度達3 mm才能損傷全層軟骨，因此造模深度設定為5 mm。結果顯示，對照組術后各時間點軟骨缺損區域均僅被纖維組織及纖維軟骨覆蓋，未得到自行修復，而多孔鉭復合BMP-7組和單純多孔鉭組均得到了不同程度修復，提示此模型建立成功，也提示軟骨下骨結構被破壞可導致軟骨生物力學性能改變，不利于表面軟骨缺損的修復[19]。
本研究大體觀察發現，隨時間增加，A、B組材料與宿主骨間結合逐漸緊密，在軟骨缺損區域逐漸出現新生軟骨組織并逐步覆蓋缺損區域，A組軟骨修復整體情況優于B組；C組缺損區均未修復，表面逐漸被纖維組織填充。提示多孔鉭植入后修復了軟骨下骨缺損，材料較高的孔徑及孔隙連通率利于BMP-7的滲透釋放及宿主骨產生的細胞因子向缺損區域轉移，可為軟骨修復提供有利條件，與相關研究結論一致[20]。同時本研究通過組織學和掃描電鏡觀察組織在材料內部的長入情況，結果顯示術后隨時間增加，多孔鉭與宿主骨界面上逐漸出現新生軟骨和成骨細胞，骨組織逐漸與多孔鉭緊密結合，軟骨缺損區域也逐漸被新生軟骨樣組織覆蓋，提示多孔鉭材料生物相容性好良好。同時我們通過Micro-CT對材料植入16周的樣本進行三維重建，行骨形態計量學分析，結果提示材料最終與周圍宿主骨形成了良好的整合，多孔鉭復合BMP-7組骨小梁數量及厚度明顯優于多孔鉭組，此結果與相關研究結果一致[21-22]。提示多孔鉭經BMP-7修飾后可提高材料的生物活性，促進細胞的分化，利于軟骨及軟骨下骨缺損的修復。
綜上述，本研究提示多孔鉭具有良好的組織相容性，與BMP-7復合后可與宿主形成穩定的連接與整合，對軟骨及軟骨下骨缺損修復起良好作用，驗證了多孔鉭作為組織工程支架材料的優越性，同時也為進一步軟骨及骨損傷的修復提供了新的實驗依據。
軟骨損傷和缺損是目前世界骨科領域面臨的難題之一，治療方法有骨移植、生物活性支架材料替代、人工假體置換等。骨移植是臨床上最常用方法，但自體骨來源有限且會對患者造成二次傷害，同種異體骨可能存在排斥反應和傳染疾病等問題。生物活性支架材料的微觀結構與松質骨相似，適合于骨的長入和礦化，但力學強度不足，在關節、脊柱等負重較大的部位應用常受到限制[1-2]；醫用金屬材料強度高、硬度高，韌性、抗疲勞性較好，但彈性模量遠高于正常骨，易引起應力遮擋，導致假體松動[3]。而多孔金屬鉭具有十二面體排列的空間立體微觀結構，在其內部具有縱橫交錯、相互連通的微孔結構，使其具有孔隙率高、彈性模量低及表面摩擦系數高等物理特性；同時，其具有生物相容性好、抗腐蝕能力強以及具備良好骨傳導性的生物學特性，使其成為理想的骨缺損修復材料[4]。BMP-7又稱成骨蛋白1，是BMP家族中的一員[5]。BMP-7具有很強的異位成骨作用，可在異位誘導新骨形成，在體外能促進軟骨細胞增殖，增強軟骨細胞外基質合成，促進蛋白聚糖和Ⅱ型膠原分泌，在骨缺損修復及軟骨分化過程中發揮重要作用[6-9]。有研究報道，應用腺病毒作為載體將BMP-7基因重組至兔軟骨細胞中，將細胞體外培養后植入兔關節軟骨缺損模型，發現其軟骨缺損修復明顯好于未植入細胞的兔關節軟骨缺損組[10]。我們的前期研究發現，BMP-7與多孔鉭復合后能促進體外軟骨細胞增殖及細胞外基質分泌，促進軟骨基因表達[11]。本研究進一步將多孔鉭與BMP-7復合后，植入兔股骨內髁軟骨缺損模型，通過大體觀察、組織學觀察、掃描電鏡、Micro-CT等方法，觀察復合物對兔關節軟骨及軟骨下骨缺損修復的情況，為多孔鉭的臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
成年新西蘭大耳白兔48只，雌雄不限，體質量2.5～3.0 kg，由華北理工大學實驗動物中心提供。
體內植入的多孔鉭件（重慶潤澤醫療器械有限公司），采用粉末澆注高溫煅燒技術制成直徑4 mm、長10 mm的圓柱體，分別按順序在蒸餾水、丙酮溶液及70%乙醇溶液中超聲清洗20 min，蒸餾水清洗、高壓蒸汽滅菌后備用。多孔鉭表面及斷面可見分布均勻的呈立體連通的蜂窩狀結構，孔徑400～600μm，孔隙率75%～85%。500倍掃描電鏡觀察可見分布均勻的直徑400～600μm的微孔結構，1 000倍掃描電鏡下可見微孔直徑為50～200μm，且微孔的孔隙間相互連通。見圖 1。
圖1
多孔鉭外觀及微觀結構觀察?多孔鉭外觀?掃描電鏡觀察（×500）?掃描電鏡觀察（×1 000）??圖 2術后各時間點各組軟骨修復情況大體觀察?A組4周?A組8周?A組12周?B組4周?B組8周?B組12周?C組4周?C組8周?C組12周
Figure1.
Appearance and microstructure observation of porous tantalum ?General observation ?SEM observation (×500) ?SEM observation (×1 000) ??Fig. 2 General observation of cartilage repair? after?operation ?Group A at 4 weeks ?Group A at 8 weeks ?Group A at 12 weeks ?Group B at 4 weeks ?Group B at 8 weeks ?Group B at 12 weeks ?Group C at 4 weeks ?Group C at 8?weeks ?Group C at 12 weeks
重組人BMP-7（recombinant human BMP-7，rhBMP-7；ProSpec公司，以色列）。JSM-6030LV掃描電鏡（電子株式會社，日本）；Leica1600硬組織切片機（Leica公司，德國）；SP2600銑片機、Minimet1000磨片機（Buehler公司，美國）；eXplore Locus SP型Micro-CT（GE公司，美國）。Advanced Bone Analysis軟件（GE Healthcare公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 復合BMP-7多孔鉭材料制備
取5 mg rhBMP-7溶入10 mL濃度為6 mol/L的尿素溶液，將多孔鉭材料浸入其中，4℃放置12 h，然后冰凍干燥處理，透析除水，氯仿蒸氣消毒后備用。
1.2.2 實驗分組及方法
取48只新西蘭大白兔隨機分為3組，分別為復合BMP-7多孔鉭組（A組）、多孔鉭組（B組）及對照組（C組），每組16只。實驗動物以5%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉后，取右側膝前正中切口，長約2 cm，沿髕骨內緣切開關節囊，將髕骨向外脫出后顯露股骨內髁，克氏針鉆孔后以直徑4 mm鉆頭沿股骨軸向鉆孔，深度約6 mm，制備兔股骨內髁軟骨缺損模型。生理鹽水沖洗傷口后，A、B組分別植入直徑4 mm、長約5 mm的復合BMP-7多孔鉭及多孔鉭，C組不植入材料。再次沖洗后逐層縫合傷口，術后單籠飼養，允許患肢負重；術后3?d每天用絡合碘消毒傷口并肌肉注射青霉素8萬U預防感染。每組分別于術后4、8、16周采用空氣栓塞法各處死5只實驗動物，取出術側股骨，于股骨髁上0.5 cm處切斷，保留帶有植入材料的髁部，進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 動物術后觀察
術后觀察動物存活、切口愈合及活動情況。
1.3.2 大體觀察
術后各時間點肉眼觀察3組軟骨缺損部位大體愈合情況，A、B組按軟骨缺損修復大體觀察評分標準[12-13]評價修復效果。
1.3.3 掃描電鏡觀察
術后各時間點取出A、B組植入材料，0.1%PBS清洗2遍，叔丁醇梯度脫水，—?10℃冰凍1 h，真空干燥機內干燥，將材料用導電膠固定于銅臺上，噴金，掃描電鏡觀察材料表面軟骨組織及骨組織生長情況。
1.3.4 組織學觀察
術后各時間點A、B組大體觀察后，將植入材料連同周圍0.5 cm組織取出，固定、脫水、滲透、包埋、切片，片厚20μm，甲苯胺藍染色，光鏡下觀察組織空隙內軟骨及骨長入情況和多孔鉭周圍成骨情況。
1.3.5 Micro-CT觀測
術后16周A、B組各隨機選取3只動物標本，對多孔鉭及周圍骨質進行Micro-CT掃描，行三維重建并行骨形態計量學分析，觀察并分析各組材料與組織接觸界面及周圍的骨質情況。取多孔鉭材料周圍直徑5 mm的圓柱狀區域為感興趣區域，設定重建閾值為1 000，采用Advanced Bone Analysis軟件分析。軟件自動生成的主要參數包括：骨小梁間隙（trabecular bone space，Tb.Sp）、組織骨密度（trabecular mineral density，TMD）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數目（trabecular number，Tb.N）、骨體積分數（bone volume fraction，BV/TV）。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 動物術后觀察
手術均順利完成，實驗動物均于術后3 h內自然蘇醒，自行飲水；2 d后進食情況同術前；3～5 d術側肢體可部分負重，2周后基本恢復正常步態；手術切口均Ⅰ期愈合，縫線自行脫落。共有5只動物（A組1只、B組2只、C組2只）因腹瀉死亡，后期均予以補齊。
2.2 大體觀察
A組術后4周可見缺損區域植入材料表面出現少量軟骨樣組織，8、16周缺損部位逐漸被新生軟骨組織完全覆蓋，表面平整光滑；B組術后4周缺損區域植入材料表面未見新生軟骨組織，8、16周缺損部位也逐漸覆蓋新生軟骨組織，但表面不平整，修復程度較A組差；C組術后4、8、16周缺損區均未修復，表面逐漸被纖維組織填充。見圖 2。除術后4周A、B組軟骨缺損修復大體觀察評分比較差異無統計學意義（P > 0.05）外，術后8、16周A組評分均高于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點A、B組軟骨缺損修復大體觀察評分比較（n=5，2.3 掃描電鏡觀察
術后4周，A、B組材料表面均可見少量鈣鹽沉積及新生軟骨和成骨細胞，成骨細胞通過偽足附著于多孔鉭表面，孔隙內有少量新生骨組織長入，但B組材料表面鈣鹽沉積及新生軟骨和成骨細胞較A組少。8、16周，A組材料表面逐漸出現較多鈣鹽沉積，新生軟骨及成骨細胞連接成片狀，細胞外基質逐漸覆蓋多孔鉭表面，孔隙內出現大量新生骨組織長入；B組材料表面鈣鹽沉積數量及細胞外基質覆蓋度均不及A組。見圖 3。
圖3
術后各時間點A、B組掃描電鏡觀察（×1 000）?A組4周?A組8周?A組12周?B組4周?B組8周?B組12周??圖 4術后各時間點A、B組組織學觀察（甲苯胺藍×200）?A組4周?A組8周?A組12周?B組4周?B組8周?B組12周
Figure3.
SEM observation of scaffolds in groups A and B after?operation (×1 000) ?Group A at 4 weeks ?Group A at 8 weeks ?Group A at 12 weeks ?Group B at 4 weeks δGroup B at 8 weeks ?Group B at 12 weeks ??Fig. 4 Histological observation?in groups A and B ?after?operation (Toluidine blue×200) ?Group A at 4 weeks ?Group A at 8 weeks ?Group A at 12 weeks ?Group B at 4 weeks ?Group B at 8 weeks ?Group B at 12 weeks
2.4 組織學觀察
甲苯胺藍染色示，術后4周，A、B組宿主骨斷端界面均可見少量新生軟骨和成骨細胞，多孔鉭表面成骨細胞附著較少，骨組織部分結合多孔鉭表面。8周，A、B組多孔鉭界面新生軟骨及骨組織均明顯增加，新生骨小梁出現并向多孔鉭孔隙內生長，兩組軟骨缺損區域已部分被新生軟骨樣組織覆蓋，新生軟骨組織與多孔鉭結合較為緊密。4、8周時，A組多孔鉭表面新生軟骨和成骨細胞較B組多。16周，A、B組多孔鉭表面緊密附著大量新生骨組織，無纖維包囊，較多骨小梁向多孔鉭孔隙內生長，并與周圍皮質骨相連；A組軟骨缺損區域已完全被新生軟骨組織覆蓋，新生軟骨組織與多孔鉭結合非常緊密，與周圍正常軟骨組織結合在一起，B組軟骨缺損區域大部分被新生軟骨組織覆蓋。見圖 4。
2.5 Micro-CT觀測
術后16周，A組TMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均高于B組，Tb.Sp低于B組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
術后16周A、B組材料骨形態計量學分析結果（n=5，3 討論
軟骨及軟骨下骨的損傷和缺損是骨科領域難題之一，骨移植材料替代是目前治療軟骨缺損的方法之一。適宜的骨移植材料不僅需要具有通透的空間結構、合適的力學特性，還需有一定的骨誘導性，即良好的骨長入特性；同時，軟骨缺損多伴有軟骨下骨損傷，因此適宜的軟骨缺損修復材料除具備上述性能外，還應為軟骨下骨缺損提供良好支撐，為軟骨損傷修復提供支撐平臺。
多孔鉭材料因具有良好的生物相容性、較高的孔隙率（75%～80%）、適合骨組織長入的孔徑大小（400～600μm）及與人體松質骨相似的彈性模量（0.2～0.5 GPa），也被稱作“金屬小梁”，其良好的空間三維立體結構利于骨組織長入，并可為細胞、血管、組織代謝產物及營養物質運輸提供有利的空間環境[14]。有研究發現多孔鉭具備良好的組織相容性及骨長入特性[15]，在國內外關節置換或翻修術后骨缺損、股骨頭缺血性壞死后骨缺損等中多有應用[16]。但多孔鉭作為金屬小梁，其金屬特性制約了骨誘導性。為改善多孔鉭的生物活性、加速骨長入時間，有研究者采用生物活性因子（如BMP系列因子）與材料相結合，可有效提高材料的生物活性，促進細胞成骨分化，如BMP-7可誘導未分化MSCs向軟骨細胞和成骨細胞方向分化，在骨缺損修復過程中發揮重要作用[6-7]。目前多為多孔材料復合生物活性因子對成骨方面的研究[17]，對軟骨缺損修復的報道較少見。鑒于此，本研究采用多孔鉭材料與BMP-7復合后植入兔股骨內髁軟骨缺損模型，通過大體觀察、組織學、掃描電鏡等方法，觀察多孔鉭與BMP-7復合后對兔關節軟骨及軟骨下骨缺損修復的情況。
本研究成功建立了兔股骨內髁軟骨缺損模型，軟骨缺損區域選擇股骨內髁負重區，因軟骨負重區是臨床疾病好發部位，選取股骨內髁負重區較符合臨床實驗研究特點。Shapiro等[18]認為缺損直徑< 3?mm，深度達不到軟骨下骨，6周后可自行部分或全部修復，故本研究中軟骨缺損區域直徑為4 mm；而兔軟骨厚度為1～2 mm，深度達3 mm才能損傷全層軟骨，因此造模深度設定為5 mm。結果顯示，對照組術后各時間點軟骨缺損區域均僅被纖維組織及纖維軟骨覆蓋，未得到自行修復，而多孔鉭復合BMP-7組和單純多孔鉭組均得到了不同程度修復，提示此模型建立成功，也提示軟骨下骨結構被破壞可導致軟骨生物力學性能改變，不利于表面軟骨缺損的修復[19]。
本研究大體觀察發現，隨時間增加，A、B組材料與宿主骨間結合逐漸緊密，在軟骨缺損區域逐漸出現新生軟骨組織并逐步覆蓋缺損區域，A組軟骨修復整體情況優于B組；C組缺損區均未修復，表面逐漸被纖維組織填充。提示多孔鉭植入后修復了軟骨下骨缺損，材料較高的孔徑及孔隙連通率利于BMP-7的滲透釋放及宿主骨產生的細胞因子向缺損區域轉移，可為軟骨修復提供有利條件，與相關研究結論一致[20]。同時本研究通過組織學和掃描電鏡觀察組織在材料內部的長入情況，結果顯示術后隨時間增加，多孔鉭與宿主骨界面上逐漸出現新生軟骨和成骨細胞，骨組織逐漸與多孔鉭緊密結合，軟骨缺損區域也逐漸被新生軟骨樣組織覆蓋，提示多孔鉭材料生物相容性好良好。同時我們通過Micro-CT對材料植入16周的樣本進行三維重建，行骨形態計量學分析，結果提示材料最終與周圍宿主骨形成了良好的整合，多孔鉭復合BMP-7組骨小梁數量及厚度明顯優于多孔鉭組，此結果與相關研究結果一致[21-22]。提示多孔鉭經BMP-7修飾后可提高材料的生物活性，促進細胞的分化，利于軟骨及軟骨下骨缺損的修復。
綜上述，本研究提示多孔鉭具有良好的組織相容性，與BMP-7復合后可與宿主形成穩定的連接與整合，對軟骨及軟骨下骨缺損修復起良好作用，驗證了多孔鉭作為組織工程支架材料的優越性，同時也為進一步軟骨及骨損傷的修復提供了新的實驗依據。
