引用本文: 王青, 尤慶生, 張天一, 朱昌來, 田磊. 細菌纖維素補片修復重建兔頸段氣管部分缺損的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(6): 748-753. doi: 10.7507/1002-1892.20160153 復制
臨床上因先天性畸形、腫瘤或創傷等導致氣管大范圍受損或嚴重狹窄而影響其功能時,需行氣管切除治療。研究表明,當氣管切除長度達6 cm以上時不能直接吻合[1],必須修復重建。國內外學者嘗試了不同氣管修復重建方法,但均存在缺血壞死、局部感染、吻合口裂開、肉芽組織形成以及氣管移位等并發癥[2-9]。因此,氣管修復重建材料和方法成為研究熱點。細菌纖維素作為一種新型生物活性材料,具有良好生物相容性[10]、可降解性、適應性以及獨特的物理、化學和機械性能。本實驗通過建立兔頸段氣管缺損模型,采用細菌纖維素補片修復重建后,觀察移植補片處氣管腔內黏膜層上皮細胞再生、炎癥及黏膜下層血管再生情況,并結合實驗動物存活情況,評估細菌纖維素作為人造氣管材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年普通級封閉群大耳白兔30只,雌雄不拘,體質量2.5~3.5 kg,由南通大學醫學院實驗動物中心提供。膜狀細菌纖維素補片由南通大學神經再生重點實驗室提供。戊巴比妥鈉(泰興市醫藥化工廠);鋨酸、環氧丙烷、環氧樹脂812(Sigma公司,美國)。光學顯微鏡(Olympus公司,日本);S-3400N掃描電鏡(Hitachi公司,日本);游標卡尺(精確度0.01 mm;上海卓量精密儀器有限公司)。
1.2 實驗分組及方法
取大耳白兔30只,以耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)聯合肌肉注射0.05 mg阿托品麻醉后,取仰臥位固定。作頸前正中切口,長約5?cm,逐層分離頸部肌群,充分暴露氣管,以眼科剪剪除橢圓形管腔壁,制備頸段氣管前壁、側壁全層缺損模型(圖 1a),缺損面積約為1.0 cm×0.6 cm(2~3個氣管環)。氣管缺損模型制備后,依據修復材料不同,隨機分為實驗組及對照組(n=15),分別以直徑約為1.2 cm的細菌纖維素補片(6層重疊)以及自體頸部淺筋膜修復重建,4-0醫用無損傷線由左、右兩側連續吻合12針(圖 1b c )。術畢,慶大霉素8萬U噴灑于創面,縫合氣管筋膜,逐層縫合切口。術后72?h內分3次肌肉注射青霉素80萬U抗感染治療,常規飼養。

1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察兩組實驗動物存活、活動及呼吸情況,有無切口感染及皮下氣腫等并發癥發生。
1.3.2 大體觀察
術后4、8、12 周,兩組分別取5只動物同上法麻醉后,沿原切口入路,暴露頸部氣管,觀察重建區域有無粘連、塌陷,管腔有無狹窄、肉芽組織增生及分泌物潴留。采用游標卡尺分別測量氣管內、外徑,按照以下公式計算氣管狹窄度,公式為:(氣管外徑-氣管內徑)/氣管外徑×100%;分為0、0~10%、10%~25%、25%~50%、50%~100%共5個等級。
1.3.3 組織學觀察
各時間點大體觀察后,耳緣靜脈注射20 mL空氣處死動物,以重建區域為中心切取包含重建區域近、遠側2~3個正常氣管環的標本。標本等分為2份,1份置于4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片,片厚5 μm,常規HE染色。鏡下觀察補片及吻合口處黏膜細胞生長情況,黏膜下炎性細胞浸潤情況,以及細胞形態。于100倍鏡下,每張切片隨機取5個不同視野計數新生毛細血管,取均值。
1.3.4 掃描電鏡觀察
各組另1份標本以2.5%磷酸戊二醛固定24 h,修剪標本為1.0 cm×0.5 cm大小,80%、90%、95%、100%乙醇逐級脫水4 h。掃描電鏡下,以重建區域中心為掃描對象,觀察上皮覆蓋情況及纖毛生長情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用t檢驗;等級資料采用秩和檢驗;檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后實驗組及對照組各3只實驗動物死亡,實驗組動物分別死于術后第17、28、31天,對照組為第13、21、26天。尸檢發現6只動物氣管管腔狹窄接近100%,炎性滲出及組織增生明顯。其余24只實驗動物均存活至實驗完成,切口愈合良好,飲食、活動正常。各時間點各組取4只動物進行觀測。
2.2 大體觀察
隨時間延長,兩組氣管管腔均有不同程度狹窄,肉芽組織增生及分泌物潴留。重建氣管變硬,與周圍組織粘連緊密,移植補片處氣管外結締組織包裹,并見類似滋養血管的小血管;剖開重建氣管,見移 植補片處氣管管腔內由膜狀物均勻、致密生 長覆蓋。見圖 2。各時間點,實驗組氣管狹窄程度與對照組比較,差異無統計學意義(P > 0.05)。見 表 1。

2.3 組織學觀察
實驗組:術后4周,移植補片處氣管可見新的黏膜下層形成,且分布均勻,膠原纖維增生,少量黏膜上皮細胞生長。8周時,吻合口處可見新生黏膜下層表面覆蓋不連續的黏膜上皮細胞,細胞形態成熟,膠原纖維增生更致密;補片中段可見不成熟的黏膜上皮細胞成簇生長,黏膜下層結構較吻合口處疏松,其間炎性細胞浸潤較吻合口少;自吻合口向補片中段可見黏膜上皮細胞成熟度逐漸遞減。12周時,吻合口附近及補片中段新生黏膜下層表面均可見連續的黏膜上皮細胞生長,細胞形態成熟。
對照組:術后4周,移植補片處氣管可見膠原纖維增生,黏膜下層形成少且不均勻。8周時,吻合口處膠原纖維更致密,可見均勻的新生黏膜下層,表面見少量黏膜上皮細胞生長,細胞形態欠成熟;補片中段可見不成熟的黏膜上皮細胞,分布稀疏;黏膜下層炎性細胞浸潤;自吻合口向補片中段可見黏膜上皮細胞成熟度逐漸遞減。12周時,吻合口附近及補片中段新生黏膜下層表面均可見連續的黏膜上皮細胞生長,細胞形態成熟,但越靠近補片中段,細胞排列越稀疏。見圖 3。
術后4、8、12周實驗組新生毛細血管數分別為(31.4±2.3)、(39.4±3.4)、(40.2±3.7)個/視野,均多于對照組(14.4±5.0)、(20.2±1.9)、(23.0±3.7)個/視野,比較差異均有統計學意義(t=6.872,P=0.001;t=11.085,P=0.000;t=7.308,P=0.000)。
2.4 掃描電鏡觀察
實驗組:術后4周,吻合口處氣管內表面被膜狀物覆蓋,管腔內面吻合口消失,并見少量半球形細胞,細胞形態、大小與正常氣管黏膜上皮細胞相似。8周時,吻合口附近管腔內壁更光滑、平整,黏膜上皮細胞連續生長,排列規則;上皮細胞由吻合口開始向移植補片中段爬行,并覆蓋吻合口。12周時,自吻合口開始即可見較致密的連續上皮細胞生長,并向補片中段連續爬行,同時于補片中段可見許多類似半球形細胞,幾乎遍及全部重建氣管。
對照組:術后4周,吻合口處氣管內表面被膜狀物覆蓋,管腔內面吻合口消失,半球形細胞較實驗組少見。8周時,吻合口附近管腔內壁黏膜上皮細胞連續生長,排列規則;上皮細胞由吻合口開始向移植補片中段爬行,但較實驗組稀疏,且數量較少。12周時,自吻合口開始即可見較致密的連續上皮樣細胞生長,并向補片中段連續爬行,補片中段可見稀疏的類似半球形細胞。見圖 4。

3 討論
Neville等[1]認為要成功地替代氣管,移植物應該具有以下特點:① 管腔不漏氣;② 易彎曲成形,但不致塌陷;③ 良好的組織相容性;④ 炎性反應小,無致癌性;⑤ 內壁光滑,防止成纖維細胞和細菌侵入;⑥ 利于呼吸道黏膜上皮細胞沿管腔生長。細菌纖維素作為敷料,已成功用于皮膚潰瘍、燒傷等方面的治療。目前也有研究成功將其作為鼻背、鼓膜及血管替代物等[11-16]。陸松華等[17]應用細菌纖維素補片修補兔頸段食管缺損,術后8周食管缺損處黏膜覆蓋完全,內膜增厚,管腔無明顯狹窄,表明細菌纖維素組織相容性較好,是具有良好應用前景的人工食管替代物材料。黃濤等[18]將氧化細菌纖維素與蠶絲蛋白形成復合物,再制成人工小口徑血管,體外實驗證實其具有低血小板黏附和蛋白吸附性,且不引起溶血,細胞毒性實驗表明復合物生物相容性良好。徐晨等[19]應用細菌纖維素修復兔硬腦膜缺損,結果表明其不易與腦組織形成粘連且早期炎性反應輕,可能成為理想的硬腦膜替代材料。以上研究均提示,細菌纖維素具有作為人工氣管材料的可能性。
本實驗結果表明,細菌纖維素補片具有良好的生物相容性和穩定性,用其修復兔頸段氣管缺損可行,新黏膜形成早且完整,并可見黏膜上皮細胞生長,12周內自然上皮化相對滿意。其主要具有以下特點:① 抗感染能力,實驗組動物炎性反應較對照組輕,切口均愈合良好;② 良好的生物相容性,實驗組未發現明顯的排斥反應,無移植物變薄、變脆或被降解;③ 再生能力,實驗組移植物管腔內壁可見新生黏膜形成,外壁可見大量膠原纖維和毛細血管生長,說明在愈合過程中隨著支架作用的消失,其本身有一定再生能力。
本實驗動物模型氣管缺損相對較小,吻合口新生血管生長速度足以滿足移植物部位的血液供應,故未出現缺血壞死情況。盡管如此,如吻合口附近黏膜上皮化進展緩慢,甚至不能完成上皮化,即使新生血管生長迅速,最終也只能形成瘢痕組織,造成吻合口狹窄。另外,模型制備時注意將氣管筋膜修剪、剝離徹底,可防止吻合口纖維組織增生;采用間斷縫合,可減少吻合口黏膜增生;術中及術后按時足量給予抗生素,均可降低吻合口狹窄發生率。
綜上述,細菌纖維素補片可修復重建兔氣管缺損,但實驗所取樣本例數相對較少,觀察時間不夠長,結論有待進一步研究驗證。
臨床上因先天性畸形、腫瘤或創傷等導致氣管大范圍受損或嚴重狹窄而影響其功能時,需行氣管切除治療。研究表明,當氣管切除長度達6 cm以上時不能直接吻合[1],必須修復重建。國內外學者嘗試了不同氣管修復重建方法,但均存在缺血壞死、局部感染、吻合口裂開、肉芽組織形成以及氣管移位等并發癥[2-9]。因此,氣管修復重建材料和方法成為研究熱點。細菌纖維素作為一種新型生物活性材料,具有良好生物相容性[10]、可降解性、適應性以及獨特的物理、化學和機械性能。本實驗通過建立兔頸段氣管缺損模型,采用細菌纖維素補片修復重建后,觀察移植補片處氣管腔內黏膜層上皮細胞再生、炎癥及黏膜下層血管再生情況,并結合實驗動物存活情況,評估細菌纖維素作為人造氣管材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年普通級封閉群大耳白兔30只,雌雄不拘,體質量2.5~3.5 kg,由南通大學醫學院實驗動物中心提供。膜狀細菌纖維素補片由南通大學神經再生重點實驗室提供。戊巴比妥鈉(泰興市醫藥化工廠);鋨酸、環氧丙烷、環氧樹脂812(Sigma公司,美國)。光學顯微鏡(Olympus公司,日本);S-3400N掃描電鏡(Hitachi公司,日本);游標卡尺(精確度0.01 mm;上海卓量精密儀器有限公司)。
1.2 實驗分組及方法
取大耳白兔30只,以耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)聯合肌肉注射0.05 mg阿托品麻醉后,取仰臥位固定。作頸前正中切口,長約5?cm,逐層分離頸部肌群,充分暴露氣管,以眼科剪剪除橢圓形管腔壁,制備頸段氣管前壁、側壁全層缺損模型(圖 1a),缺損面積約為1.0 cm×0.6 cm(2~3個氣管環)。氣管缺損模型制備后,依據修復材料不同,隨機分為實驗組及對照組(n=15),分別以直徑約為1.2 cm的細菌纖維素補片(6層重疊)以及自體頸部淺筋膜修復重建,4-0醫用無損傷線由左、右兩側連續吻合12針(圖 1b c )。術畢,慶大霉素8萬U噴灑于創面,縫合氣管筋膜,逐層縫合切口。術后72?h內分3次肌肉注射青霉素80萬U抗感染治療,常規飼養。

1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察兩組實驗動物存活、活動及呼吸情況,有無切口感染及皮下氣腫等并發癥發生。
1.3.2 大體觀察
術后4、8、12 周,兩組分別取5只動物同上法麻醉后,沿原切口入路,暴露頸部氣管,觀察重建區域有無粘連、塌陷,管腔有無狹窄、肉芽組織增生及分泌物潴留。采用游標卡尺分別測量氣管內、外徑,按照以下公式計算氣管狹窄度,公式為:(氣管外徑-氣管內徑)/氣管外徑×100%;分為0、0~10%、10%~25%、25%~50%、50%~100%共5個等級。
1.3.3 組織學觀察
各時間點大體觀察后,耳緣靜脈注射20 mL空氣處死動物,以重建區域為中心切取包含重建區域近、遠側2~3個正常氣管環的標本。標本等分為2份,1份置于4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片,片厚5 μm,常規HE染色。鏡下觀察補片及吻合口處黏膜細胞生長情況,黏膜下炎性細胞浸潤情況,以及細胞形態。于100倍鏡下,每張切片隨機取5個不同視野計數新生毛細血管,取均值。
1.3.4 掃描電鏡觀察
各組另1份標本以2.5%磷酸戊二醛固定24 h,修剪標本為1.0 cm×0.5 cm大小,80%、90%、95%、100%乙醇逐級脫水4 h。掃描電鏡下,以重建區域中心為掃描對象,觀察上皮覆蓋情況及纖毛生長情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用t檢驗;等級資料采用秩和檢驗;檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后實驗組及對照組各3只實驗動物死亡,實驗組動物分別死于術后第17、28、31天,對照組為第13、21、26天。尸檢發現6只動物氣管管腔狹窄接近100%,炎性滲出及組織增生明顯。其余24只實驗動物均存活至實驗完成,切口愈合良好,飲食、活動正常。各時間點各組取4只動物進行觀測。
2.2 大體觀察
隨時間延長,兩組氣管管腔均有不同程度狹窄,肉芽組織增生及分泌物潴留。重建氣管變硬,與周圍組織粘連緊密,移植補片處氣管外結締組織包裹,并見類似滋養血管的小血管;剖開重建氣管,見移 植補片處氣管管腔內由膜狀物均勻、致密生 長覆蓋。見圖 2。各時間點,實驗組氣管狹窄程度與對照組比較,差異無統計學意義(P > 0.05)。見 表 1。

2.3 組織學觀察
實驗組:術后4周,移植補片處氣管可見新的黏膜下層形成,且分布均勻,膠原纖維增生,少量黏膜上皮細胞生長。8周時,吻合口處可見新生黏膜下層表面覆蓋不連續的黏膜上皮細胞,細胞形態成熟,膠原纖維增生更致密;補片中段可見不成熟的黏膜上皮細胞成簇生長,黏膜下層結構較吻合口處疏松,其間炎性細胞浸潤較吻合口少;自吻合口向補片中段可見黏膜上皮細胞成熟度逐漸遞減。12周時,吻合口附近及補片中段新生黏膜下層表面均可見連續的黏膜上皮細胞生長,細胞形態成熟。
對照組:術后4周,移植補片處氣管可見膠原纖維增生,黏膜下層形成少且不均勻。8周時,吻合口處膠原纖維更致密,可見均勻的新生黏膜下層,表面見少量黏膜上皮細胞生長,細胞形態欠成熟;補片中段可見不成熟的黏膜上皮細胞,分布稀疏;黏膜下層炎性細胞浸潤;自吻合口向補片中段可見黏膜上皮細胞成熟度逐漸遞減。12周時,吻合口附近及補片中段新生黏膜下層表面均可見連續的黏膜上皮細胞生長,細胞形態成熟,但越靠近補片中段,細胞排列越稀疏。見圖 3。
術后4、8、12周實驗組新生毛細血管數分別為(31.4±2.3)、(39.4±3.4)、(40.2±3.7)個/視野,均多于對照組(14.4±5.0)、(20.2±1.9)、(23.0±3.7)個/視野,比較差異均有統計學意義(t=6.872,P=0.001;t=11.085,P=0.000;t=7.308,P=0.000)。
2.4 掃描電鏡觀察
實驗組:術后4周,吻合口處氣管內表面被膜狀物覆蓋,管腔內面吻合口消失,并見少量半球形細胞,細胞形態、大小與正常氣管黏膜上皮細胞相似。8周時,吻合口附近管腔內壁更光滑、平整,黏膜上皮細胞連續生長,排列規則;上皮細胞由吻合口開始向移植補片中段爬行,并覆蓋吻合口。12周時,自吻合口開始即可見較致密的連續上皮細胞生長,并向補片中段連續爬行,同時于補片中段可見許多類似半球形細胞,幾乎遍及全部重建氣管。
對照組:術后4周,吻合口處氣管內表面被膜狀物覆蓋,管腔內面吻合口消失,半球形細胞較實驗組少見。8周時,吻合口附近管腔內壁黏膜上皮細胞連續生長,排列規則;上皮細胞由吻合口開始向移植補片中段爬行,但較實驗組稀疏,且數量較少。12周時,自吻合口開始即可見較致密的連續上皮樣細胞生長,并向補片中段連續爬行,補片中段可見稀疏的類似半球形細胞。見圖 4。

3 討論
Neville等[1]認為要成功地替代氣管,移植物應該具有以下特點:① 管腔不漏氣;② 易彎曲成形,但不致塌陷;③ 良好的組織相容性;④ 炎性反應小,無致癌性;⑤ 內壁光滑,防止成纖維細胞和細菌侵入;⑥ 利于呼吸道黏膜上皮細胞沿管腔生長。細菌纖維素作為敷料,已成功用于皮膚潰瘍、燒傷等方面的治療。目前也有研究成功將其作為鼻背、鼓膜及血管替代物等[11-16]。陸松華等[17]應用細菌纖維素補片修補兔頸段食管缺損,術后8周食管缺損處黏膜覆蓋完全,內膜增厚,管腔無明顯狹窄,表明細菌纖維素組織相容性較好,是具有良好應用前景的人工食管替代物材料。黃濤等[18]將氧化細菌纖維素與蠶絲蛋白形成復合物,再制成人工小口徑血管,體外實驗證實其具有低血小板黏附和蛋白吸附性,且不引起溶血,細胞毒性實驗表明復合物生物相容性良好。徐晨等[19]應用細菌纖維素修復兔硬腦膜缺損,結果表明其不易與腦組織形成粘連且早期炎性反應輕,可能成為理想的硬腦膜替代材料。以上研究均提示,細菌纖維素具有作為人工氣管材料的可能性。
本實驗結果表明,細菌纖維素補片具有良好的生物相容性和穩定性,用其修復兔頸段氣管缺損可行,新黏膜形成早且完整,并可見黏膜上皮細胞生長,12周內自然上皮化相對滿意。其主要具有以下特點:① 抗感染能力,實驗組動物炎性反應較對照組輕,切口均愈合良好;② 良好的生物相容性,實驗組未發現明顯的排斥反應,無移植物變薄、變脆或被降解;③ 再生能力,實驗組移植物管腔內壁可見新生黏膜形成,外壁可見大量膠原纖維和毛細血管生長,說明在愈合過程中隨著支架作用的消失,其本身有一定再生能力。
本實驗動物模型氣管缺損相對較小,吻合口新生血管生長速度足以滿足移植物部位的血液供應,故未出現缺血壞死情況。盡管如此,如吻合口附近黏膜上皮化進展緩慢,甚至不能完成上皮化,即使新生血管生長迅速,最終也只能形成瘢痕組織,造成吻合口狹窄。另外,模型制備時注意將氣管筋膜修剪、剝離徹底,可防止吻合口纖維組織增生;采用間斷縫合,可減少吻合口黏膜增生;術中及術后按時足量給予抗生素,均可降低吻合口狹窄發生率。
綜上述,細菌纖維素補片可修復重建兔氣管缺損,但實驗所取樣本例數相對較少,觀察時間不夠長,結論有待進一步研究驗證。