引用本文： 閆成, 薛改, 張偉, 韓曉磊, 劉建芳, 侯艷寧. 肝纖維化大鼠血液微環境對人臍帶MSCs向肝細胞分化的影響及機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(6): 754-760. doi: 10.7507/1002-1892.20160154 復制
目前，肝纖維化發病率和死亡率較高，已成為重要公共衛生問題，藥物治療效果不佳[1-2]。近年來以干細胞技術為代表的再生醫學，為肝纖維化的治療提供了新選擇[3-4]。人臍帶MSCs（human umbilical cord MSCs，HUCMSCs）無倫理道德爭議，是具有應用前景的組織工程種子細胞。研究顯示，HUCMSCs經靜脈移植后能隨血液流向受損肝臟并定植，分化為具有部分肝細胞功能的肝樣細胞，通過細胞修復發揮替代治療作用[5-6]。然而，HUCMSCs入血后何時、如何被激活以及向肝臟遷移、向肝細胞分化這一過程的具體機制仍不清楚。Chen等[7]研究表明，在肝損傷條件下，肝臟可能會產生并釋放一些“信號分子”。血清中這些“信號分子”可以激活外源性干細胞，使其向肝臟遷移。但是，上述“信號分子”對干細胞向肝細胞分化的影響尚不明確。本實驗在既往研究基礎上，應用肝纖維化大鼠血清體外模擬肝纖維化大鼠血液微環境，觀察其對HUCMSCs分化的影響，探討這一過程中MAPK/ERK信號通路的變化，并對肝纖維化大鼠血清中激活HUCMSCs分化的可能成分進行初步研究，為明確移植干細胞在體內的生物學行為提供新的研究思路和實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
實驗用HUCMSCs由本實驗室應用組織塊培養法分離培養并傳代[8]。成年清潔級雄性SD大鼠18只，體質量（200±20）g，購于河北醫科大學實驗動物中心。DMEM/F12培養基、FBS（HyClone公司，美國）；硫代乙酰胺（Sigma公司，美國）；甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）兔多克隆抗體、細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）兔多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；山羊抗兔IgG/Alexa Fluor?488 （北京中杉金橋生物科技有限公司）；山羊血清、Triton-X 100（北京索萊寶科技有限公司）；白蛋白（albumin，ALB）、色氨酸2，3-雙加氧酶（tryptophan 2，3-dioxygenase，TPH2）兔多克隆抗體（上海生工生物工程股份有限公司）；CYP3A4兔多克隆抗體（天津美諾路生物技術有限公司）；β-actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG （Proteintech公司，美國）；P-ERK、T-ERK兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測試盒（南京建成生物工程研究所）；EGF、bFGF、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、抑瘤素（oncostatin M，OSM）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 肝纖維化大鼠血清制備及檢測
參照文獻[9]方法，采用硫代乙酰胺制備肝纖維化大鼠模型。取12只SD大鼠，腹腔注射硫代乙酰胺，每次給藥劑量200 mg/kg，每周2次，共4周。4 周后處死全部大鼠，取肝組織行HE染色觀察。明確肝纖維化模型制備成功后，取大鼠全血室溫靜置30?min后，以離心半徑7 cm、4?000?r/min離心10?min，取血清。另取6只正常大鼠全血同法制備血清。參照試劑盒說明書，采用ELISA法測定兩種血清中EGF、HGF、bFGF、OSM含量。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為3組，分別為肝纖維化血清組（A組）、正常血清組（B組）及對照組（C組）。取第3代HUCMSCs，以1×105個/mL密度接種于6孔板，每孔1.5 mL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，待細胞生長至約80%匯合時，棄培養液，進行分組處理。A、B組分別以含5 mL/L肝纖維化大鼠血清、正常大鼠血清的DMEM/F12培養基（含10%FBS）繼續培養；C組以DMEM/F12培養基（含10%FBS）繼續培養。各組均隔日全量換液，共培養7?d。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞形態學觀察
培養期間于倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態學變化。
1.4.2 細胞免疫熒光檢測肝細胞表面標志物
培養7 d時收集各組細胞，棄培養液后PBS洗3遍，每次5?min。4%多聚甲醛溶液固定15 min。PBS洗3遍后加入AFP（1:100）、CK18（1:100）一抗，4℃過夜。PBS洗3遍后加入熒光二抗（1:400），37℃避光孵育1 h。PBS洗3遍后應用Hoechst33258暗室染核5?min。抗淬滅劑封片后于熒光顯微鏡下觀察，各標志物為綠色熒光表達。
1.4.3 Western blot檢測肝細胞功能蛋白及MAPK/ERK信號通路蛋白表達
培養7?d時收集各組細胞，提取總蛋白。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉至聚偏氟乙烯膜，室溫封閉2 h，分別加入肝細胞功能蛋白ALB （1:500）、TPH2 （1:500）、CYP3A4 （1:1?000）以及MAPK/ERK信號通路蛋白P-ERK（1:1?000）一抗，4℃孵育過夜。PBS洗膜后加入對應辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG二抗（1:2 000），室溫孵育2 h。聚偏氟乙烯膜沖洗后置于暗盒中，顯影，曝光。肝細胞功能蛋白及MAPK/ERK信號通路蛋白分別以β-actin、T-ERK作為內參。應用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以ALB、TPH2、CYP3A4與β-actin灰度值比值以及P-ERK與T-ERK灰度值比值作為其相對表達量。重復測量3 次，取均值。
1.4.4 二乙酰肟法檢測尿素合成功能
培養7 d時收集各組細胞，棄培養液，每孔加入含5?mmol/L 氯化銨的DMEM/F12培養液1.5 mL，孵育24 h。參照試劑盒說明書采用二乙酰肟法測定細胞上清液中BUN含量。重復測量6次，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠肝纖維化模型組織學觀察
鏡下見，注射硫代乙酰胺后，SD大鼠肝小葉結構破壞，膠原纖維增生明顯；細胞排列雜亂無序，可見炎性細胞浸潤；部分肝細胞的細胞核固縮，胞體溶解或壞死。提示大鼠肝纖維化模型制備成功。見 圖 1。
圖1
肝纖維化大鼠肝組織HE染色觀察 ? ×100 ? ×400 圖 2 各組培養各時間點細胞形態學觀察（倒置顯微鏡×100） ? A組3?d ? B組3 d ? C組3 d ? A組7 d ? B組7 d ? C組7 d 圖 3 各組細胞AFP免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100） 從左至右分別為AFP熒光表達、Hoechst33258熒光表達、兩者重合 ? A組 ? B組 ? C組
Figure1.
HE staining of liver tissue from rats with hepatic fibrosis ? ×100 ? ×400 Fig. 2 Morphological observation of HUCMSCs in each group after culture (Inverted microscope×100) ? Group A at 3 days ? Group B at 3 days ? Group C at 3 days ? Group A at 7?days ? Group B at 7 days ? Group C at 7 days Fig. 3 The expression of AFP in cells of each group by immunofluorescence (Fluoresc ence microscpoe×100) From left to right for AFP, Hoechst33258, and merged, respectively ? Group A ? Group B ? Group C
2.2 大鼠血清EGF、HGF、bFGF及OSM含量測定
正常大鼠血清EGF、OSM含量分別為（21.42± 0.32）、（129.96±0.65）pg/mL，均高于纖維化大鼠的（17.57±0.31）、（98.44±1.32） pg/mL，比較差異有統計學意義（t=14.989，P=0.000；t=37.172，P=0.000）。肝纖維化大鼠血清中HGF含量為（1.03±0.12）ng/mL，正常大鼠血清中未檢出。兩種血清中均未檢出bFGF。
2.3 肝纖維化大鼠血清對HUCMSCs向肝細胞分化的影響
2.3.1 細胞形態學觀察
倒置顯微鏡下觀察，在7 d培養期內各組細胞均呈密集排列的長梭形，未見明顯形態學變化，且組間無明顯差異。見圖 2。
2.3.2 細胞免疫熒光檢測
培養7 d時，A組細胞可見AFP、CK18綠色熒光，主要分布于細胞質；B、C組細胞AFP、CK18染色均為陰性。見圖 3、4。
圖4
各組細胞CK18免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100） 從左至右分別為CK18熒光表達、Hoechst33258熒光表達、兩者重合 ? A組 ? B組 ? C組 圖 5 Western blot檢測各組細胞ALB、TPH2、CYP3A4蛋白表達 1：C組 2：B組 3：A組 圖 6 Western blot檢測各組細胞P-ERK蛋白表達 1：C組 2：B組 3：A組
Figure4.
The expression of CK18 in cells of each group by immunofluorescence (Fluorescence microscope×100) From left to right for CK18, Hoechst33258, and merged, respectively ? Group A ? Group B ? Group C Fig. 5 The expression levels of ALB, TPH2, and CYP3A4 proteins in cells of each group by Western blot 1: Group C 2: Group B 3: Group A Fig. 6 The expression level of P-ERK protein in cells of each group by Western blot 1: Group C 2: Group B 3: Group A
2.3.3 Western blot檢測
A組細胞可表達肝細胞功能蛋白ALB、TPH2及CYP3A4，相對表達量分別為0.66±0.04、0.80±0.05、0.87±0.06。B、C組細胞均未見上述蛋白表達。見圖 5。
各組細胞均可表達MAPK/ERK信號通路蛋白P-ERK。其中，A組P-ERK蛋白相對表達量為0.71±0.04，顯著高于B組（0.44±0.02）、C組（0.43±0.02），比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 6。
2.3.4 尿素合成功能檢測
A組細胞上清液中BUN含量為（0.74±0.07）mmol/L，顯著高于B組（0.40±0.04） mmol/L與C組（0.38±0.04）mmol/L，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
3 討論
近年來，干細胞技術已逐漸應用于肝病治療領域，但對于干細胞如何促進肝臟再生及其向肝細胞分化機制等問題的認識仍十分有限，制約了該技術的臨床應用。因此，明確干細胞在體內的生物學行為及分化機制，對于提高干細胞移植的治療效果、建立標準化的功能性肝細胞培育方法有著重要意義。目前認為，干細胞的分化會受到其所處微環境的影響[10]。研究這一過程最直觀的方法是通過體外建模來模擬體內微環境，為此本研究應用DMEM/F12培養基聯合大鼠血清模擬肝纖維化及正常條件下的血液微環境。
關于肝纖維化造模藥物的選擇，目前大量研究認為硫代乙酰胺誘導的肝纖維化動物模型在血流動力學、組織病理學以及生化代謝改變等方面與人類肝纖維化的發生發展最相似[11-12]，所以本研究選擇該造模藥物。預實驗發現當血清濃度較低時，培養7?d甚至更長時間仍觀察不到誘導效果；血清濃度較高時，培養2 d內即可見大量細胞凋亡。當血清濃度為5 mL/L時，既可以保證干細胞的存活，又可以觀察到誘導效果，故最終選擇該實驗濃度。通過預實驗觀察提示，肝纖維化大鼠血清模擬的病理血液微環境可以促進HUCMSCs向肝細胞分化；同時，肝損傷時產生的內毒素、致炎因子等有害物質可能對干細胞有一定的損傷作用。
對于干細胞分化狀態的鑒定，我們沿用了前期的實驗方法[9]，包括肝細胞表面標志物AFP、CK18的檢測，肝細胞功能蛋白ALB、CYP3A4、TPH2的表達，以及BUN合成功能的測定。AFP是一種由肝前體細胞分泌的胞漿蛋白；CK18是肝細胞的相對特異性標志物；CYP3A4、TPH2分別對應肝細胞藥物代謝和分解氨基酸的能力；ALB是最常用、最可靠的肝細胞功能檢測指標。利用氯化銨合成BUN的功能檢測也被廣泛用于干細胞向肝細胞分化狀態的鑒定[13-14]。本研究經肝纖維化大鼠血清誘導培養7?d后，HUCM SCs已具備肝細胞表面標志物，并能表達部分肝細胞功能蛋白，擁有了肝細胞的部分功能。表明HUCMSCs在肝纖維化大鼠血液微環境下可以向肝細胞分化，提示應用HUCMSCs移植治療肝病時，分化過程可能在其入血后即開始，而不是遷移至受損肝組織后。
本實驗室前期研究表明，利用肝纖維化大鼠肝組織勻漿上清液模擬肝纖維化組織微環境可以誘導HUCMSCs向肝細胞分化[9]。本實驗使用同一動物模型，對比肝纖維化組織微環境與血液微環境的誘導效果發現：① 形態方面，在肝纖維化組織微環境下，HUCM SCs培養24?h即出現形態變化，7?d時已由誘導前的長梭形轉變成了類似肝細胞的不規則形。而在血液微環境下，HUCMSCs培養7 d仍未出現形態變化。② 功能方面，在肝纖維化組織微環境下作用7?d，HUC MSCs合成尿素能力顯著提高，未誘導細胞BUN含量為（0.43± 0.07） mmol/L，誘導后為（2.52±0.20）mmol/ L；而在血液微環境下作用7?d，細胞合成尿素的能力提高程度低于肝纖維化組織微環境下，未誘導細胞BUN含量為（0.38±0.04） mmol/ L，誘導后為（0.74±0.07）mmol/ L。上述結果說明，肝纖維化組織微環境較血液微環境更有利于HUCMSCs向肝細胞分化。目前認為，當肝損傷導致內源性干細胞不能代償肝細胞的損失時，形成的組織微環境會支持外源性干細胞的活性，即可使干細胞歸巢至肝臟并向肝細胞分化，通過組織修復發揮替代治療作用[15-17]。這一過程的機制是：當肝損傷發生時，內在的Kupffer細胞、肝星狀細胞及浸潤炎性細胞可分泌一系列趨化因子、生長因子和細胞因子，形成利于肝細胞再生的組織微環境，同時血液中會形成EGF、HGF等調節因子的趨化梯度。移植入血的干細胞可在上述因素作用下向肝臟歸巢并向肝細胞分化[18-19]，這也就導致了肝纖維化組織微環境比血液微環境更有利于干細胞向肝細胞的分化。
MAPK/ERK信號通路是一個以三級磷酸化級聯反應為主體、介導細胞信號由外到內的傳導通路，主要調節細胞的增殖、分化、遷移和凋亡[20-21]。Yan等[22]的研究表明，ERK磷酸化在HUCMSCs向肝細胞分化的過程中起著重要作用，阻斷ERK的激活可以阻止這一分化過程。本研究結果表明，在肝纖維化大鼠血液微環境作用下MAPK/ERK信號通路被激活，ERK磷酸化增加，HUCMSCs開始向肝細胞分化。據報道MAPK/ERK信號通路可以被HGF、bFGF等多種生長因子、細胞因子激活[22-23]，且HUC MSCs向肝細胞的分化可通過在細胞培養液中添加HGF、EGF、OSM、bFGF等因子來實現[24-25]。本研究結果顯示肝纖維化大鼠血清對干細胞分化有誘導作用，而正常大鼠血清為陰性結果。為明確造成這一現象的原因，我們對比分析了兩種血清中上述4種因子的含量差異。結果顯示兩組血清中HGF、EGF、OSM的含量差異均有統計學意義，bFGF均未檢出；提示在肝纖維化條件下，大鼠血液中的HGF、EGF、OSM等因子水平會發生變化，形成的血液微環境會激活MAPK/ERK信號通路，促使HUCMSCs向肝細胞分化。因HGF、EGF、OSM等因子價格昂貴，而肝損傷動物的血清易于獲取，所以建立均一、穩定的動物模型，分析血清中的因子成分并進行合適配比，可能建立一種廉價高效的干細胞分化體系，有利于干細胞來源肝細胞的大量獲取。
目前，肝細胞移植和生物人工肝作為原位肝移植的補充治療手段，逐漸成為研究熱點[26-27]，而體外培養干細胞并創造條件使之分化為肝細胞，可作為肝細胞移植及構建生物人工肝的重要種子細胞來源。本次研究結果提示了肝纖維化大鼠血液微環境對HUCMSCs向肝細胞分化的誘導作用，下一步將繼續明確機體微環境對干細胞分化的影響，以利于體外誘導HUCMSCs向肝實質細胞分化最適微環境的建立。
目前，肝纖維化發病率和死亡率較高，已成為重要公共衛生問題，藥物治療效果不佳[1-2]。近年來以干細胞技術為代表的再生醫學，為肝纖維化的治療提供了新選擇[3-4]。人臍帶MSCs（human umbilical cord MSCs，HUCMSCs）無倫理道德爭議，是具有應用前景的組織工程種子細胞。研究顯示，HUCMSCs經靜脈移植后能隨血液流向受損肝臟并定植，分化為具有部分肝細胞功能的肝樣細胞，通過細胞修復發揮替代治療作用[5-6]。然而，HUCMSCs入血后何時、如何被激活以及向肝臟遷移、向肝細胞分化這一過程的具體機制仍不清楚。Chen等[7]研究表明，在肝損傷條件下，肝臟可能會產生并釋放一些“信號分子”。血清中這些“信號分子”可以激活外源性干細胞，使其向肝臟遷移。但是，上述“信號分子”對干細胞向肝細胞分化的影響尚不明確。本實驗在既往研究基礎上，應用肝纖維化大鼠血清體外模擬肝纖維化大鼠血液微環境，觀察其對HUCMSCs分化的影響，探討這一過程中MAPK/ERK信號通路的變化，并對肝纖維化大鼠血清中激活HUCMSCs分化的可能成分進行初步研究，為明確移植干細胞在體內的生物學行為提供新的研究思路和實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
實驗用HUCMSCs由本實驗室應用組織塊培養法分離培養并傳代[8]。成年清潔級雄性SD大鼠18只，體質量（200±20）g，購于河北醫科大學實驗動物中心。DMEM/F12培養基、FBS（HyClone公司，美國）；硫代乙酰胺（Sigma公司，美國）；甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）兔多克隆抗體、細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）兔多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；山羊抗兔IgG/Alexa Fluor?488 （北京中杉金橋生物科技有限公司）；山羊血清、Triton-X 100（北京索萊寶科技有限公司）；白蛋白（albumin，ALB）、色氨酸2，3-雙加氧酶（tryptophan 2，3-dioxygenase，TPH2）兔多克隆抗體（上海生工生物工程股份有限公司）；CYP3A4兔多克隆抗體（天津美諾路生物技術有限公司）；β-actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG （Proteintech公司，美國）；P-ERK、T-ERK兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測試盒（南京建成生物工程研究所）；EGF、bFGF、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、抑瘤素（oncostatin M，OSM）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 肝纖維化大鼠血清制備及檢測
參照文獻[9]方法，采用硫代乙酰胺制備肝纖維化大鼠模型。取12只SD大鼠，腹腔注射硫代乙酰胺，每次給藥劑量200 mg/kg，每周2次，共4周。4 周后處死全部大鼠，取肝組織行HE染色觀察。明確肝纖維化模型制備成功后，取大鼠全血室溫靜置30?min后，以離心半徑7 cm、4?000?r/min離心10?min，取血清。另取6只正常大鼠全血同法制備血清。參照試劑盒說明書，采用ELISA法測定兩種血清中EGF、HGF、bFGF、OSM含量。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為3組，分別為肝纖維化血清組（A組）、正常血清組（B組）及對照組（C組）。取第3代HUCMSCs，以1×105個/mL密度接種于6孔板，每孔1.5 mL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，待細胞生長至約80%匯合時，棄培養液，進行分組處理。A、B組分別以含5 mL/L肝纖維化大鼠血清、正常大鼠血清的DMEM/F12培養基（含10%FBS）繼續培養；C組以DMEM/F12培養基（含10%FBS）繼續培養。各組均隔日全量換液，共培養7?d。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞形態學觀察
培養期間于倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態學變化。
1.4.2 細胞免疫熒光檢測肝細胞表面標志物
培養7 d時收集各組細胞，棄培養液后PBS洗3遍，每次5?min。4%多聚甲醛溶液固定15 min。PBS洗3遍后加入AFP（1:100）、CK18（1:100）一抗，4℃過夜。PBS洗3遍后加入熒光二抗（1:400），37℃避光孵育1 h。PBS洗3遍后應用Hoechst33258暗室染核5?min。抗淬滅劑封片后于熒光顯微鏡下觀察，各標志物為綠色熒光表達。
1.4.3 Western blot檢測肝細胞功能蛋白及MAPK/ERK信號通路蛋白表達
培養7?d時收集各組細胞，提取總蛋白。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉至聚偏氟乙烯膜，室溫封閉2 h，分別加入肝細胞功能蛋白ALB （1:500）、TPH2 （1:500）、CYP3A4 （1:1?000）以及MAPK/ERK信號通路蛋白P-ERK（1:1?000）一抗，4℃孵育過夜。PBS洗膜后加入對應辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG二抗（1:2 000），室溫孵育2 h。聚偏氟乙烯膜沖洗后置于暗盒中，顯影，曝光。肝細胞功能蛋白及MAPK/ERK信號通路蛋白分別以β-actin、T-ERK作為內參。應用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以ALB、TPH2、CYP3A4與β-actin灰度值比值以及P-ERK與T-ERK灰度值比值作為其相對表達量。重復測量3 次，取均值。
1.4.4 二乙酰肟法檢測尿素合成功能
培養7 d時收集各組細胞，棄培養液，每孔加入含5?mmol/L 氯化銨的DMEM/F12培養液1.5 mL，孵育24 h。參照試劑盒說明書采用二乙酰肟法測定細胞上清液中BUN含量。重復測量6次，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠肝纖維化模型組織學觀察
鏡下見，注射硫代乙酰胺后，SD大鼠肝小葉結構破壞，膠原纖維增生明顯；細胞排列雜亂無序，可見炎性細胞浸潤；部分肝細胞的細胞核固縮，胞體溶解或壞死。提示大鼠肝纖維化模型制備成功。見 圖 1。
圖1
肝纖維化大鼠肝組織HE染色觀察 ? ×100 ? ×400 圖 2 各組培養各時間點細胞形態學觀察（倒置顯微鏡×100） ? A組3?d ? B組3 d ? C組3 d ? A組7 d ? B組7 d ? C組7 d 圖 3 各組細胞AFP免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100） 從左至右分別為AFP熒光表達、Hoechst33258熒光表達、兩者重合 ? A組 ? B組 ? C組
Figure1.
HE staining of liver tissue from rats with hepatic fibrosis ? ×100 ? ×400 Fig. 2 Morphological observation of HUCMSCs in each group after culture (Inverted microscope×100) ? Group A at 3 days ? Group B at 3 days ? Group C at 3 days ? Group A at 7?days ? Group B at 7 days ? Group C at 7 days Fig. 3 The expression of AFP in cells of each group by immunofluorescence (Fluoresc ence microscpoe×100) From left to right for AFP, Hoechst33258, and merged, respectively ? Group A ? Group B ? Group C
2.2 大鼠血清EGF、HGF、bFGF及OSM含量測定
正常大鼠血清EGF、OSM含量分別為（21.42± 0.32）、（129.96±0.65）pg/mL，均高于纖維化大鼠的（17.57±0.31）、（98.44±1.32） pg/mL，比較差異有統計學意義（t=14.989，P=0.000；t=37.172，P=0.000）。肝纖維化大鼠血清中HGF含量為（1.03±0.12）ng/mL，正常大鼠血清中未檢出。兩種血清中均未檢出bFGF。
2.3 肝纖維化大鼠血清對HUCMSCs向肝細胞分化的影響
2.3.1 細胞形態學觀察
倒置顯微鏡下觀察，在7 d培養期內各組細胞均呈密集排列的長梭形，未見明顯形態學變化，且組間無明顯差異。見圖 2。
2.3.2 細胞免疫熒光檢測
培養7 d時，A組細胞可見AFP、CK18綠色熒光，主要分布于細胞質；B、C組細胞AFP、CK18染色均為陰性。見圖 3、4。
圖4
各組細胞CK18免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100） 從左至右分別為CK18熒光表達、Hoechst33258熒光表達、兩者重合 ? A組 ? B組 ? C組 圖 5 Western blot檢測各組細胞ALB、TPH2、CYP3A4蛋白表達 1：C組 2：B組 3：A組 圖 6 Western blot檢測各組細胞P-ERK蛋白表達 1：C組 2：B組 3：A組
Figure4.
The expression of CK18 in cells of each group by immunofluorescence (Fluorescence microscope×100) From left to right for CK18, Hoechst33258, and merged, respectively ? Group A ? Group B ? Group C Fig. 5 The expression levels of ALB, TPH2, and CYP3A4 proteins in cells of each group by Western blot 1: Group C 2: Group B 3: Group A Fig. 6 The expression level of P-ERK protein in cells of each group by Western blot 1: Group C 2: Group B 3: Group A
2.3.3 Western blot檢測
A組細胞可表達肝細胞功能蛋白ALB、TPH2及CYP3A4，相對表達量分別為0.66±0.04、0.80±0.05、0.87±0.06。B、C組細胞均未見上述蛋白表達。見圖 5。
各組細胞均可表達MAPK/ERK信號通路蛋白P-ERK。其中，A組P-ERK蛋白相對表達量為0.71±0.04，顯著高于B組（0.44±0.02）、C組（0.43±0.02），比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 6。
2.3.4 尿素合成功能檢測
A組細胞上清液中BUN含量為（0.74±0.07）mmol/L，顯著高于B組（0.40±0.04） mmol/L與C組（0.38±0.04）mmol/L，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
3 討論
近年來，干細胞技術已逐漸應用于肝病治療領域，但對于干細胞如何促進肝臟再生及其向肝細胞分化機制等問題的認識仍十分有限，制約了該技術的臨床應用。因此，明確干細胞在體內的生物學行為及分化機制，對于提高干細胞移植的治療效果、建立標準化的功能性肝細胞培育方法有著重要意義。目前認為，干細胞的分化會受到其所處微環境的影響[10]。研究這一過程最直觀的方法是通過體外建模來模擬體內微環境，為此本研究應用DMEM/F12培養基聯合大鼠血清模擬肝纖維化及正常條件下的血液微環境。
關于肝纖維化造模藥物的選擇，目前大量研究認為硫代乙酰胺誘導的肝纖維化動物模型在血流動力學、組織病理學以及生化代謝改變等方面與人類肝纖維化的發生發展最相似[11-12]，所以本研究選擇該造模藥物。預實驗發現當血清濃度較低時，培養7?d甚至更長時間仍觀察不到誘導效果；血清濃度較高時，培養2 d內即可見大量細胞凋亡。當血清濃度為5 mL/L時，既可以保證干細胞的存活，又可以觀察到誘導效果，故最終選擇該實驗濃度。通過預實驗觀察提示，肝纖維化大鼠血清模擬的病理血液微環境可以促進HUCMSCs向肝細胞分化；同時，肝損傷時產生的內毒素、致炎因子等有害物質可能對干細胞有一定的損傷作用。
對于干細胞分化狀態的鑒定，我們沿用了前期的實驗方法[9]，包括肝細胞表面標志物AFP、CK18的檢測，肝細胞功能蛋白ALB、CYP3A4、TPH2的表達，以及BUN合成功能的測定。AFP是一種由肝前體細胞分泌的胞漿蛋白；CK18是肝細胞的相對特異性標志物；CYP3A4、TPH2分別對應肝細胞藥物代謝和分解氨基酸的能力；ALB是最常用、最可靠的肝細胞功能檢測指標。利用氯化銨合成BUN的功能檢測也被廣泛用于干細胞向肝細胞分化狀態的鑒定[13-14]。本研究經肝纖維化大鼠血清誘導培養7?d后，HUCM SCs已具備肝細胞表面標志物，并能表達部分肝細胞功能蛋白，擁有了肝細胞的部分功能。表明HUCMSCs在肝纖維化大鼠血液微環境下可以向肝細胞分化，提示應用HUCMSCs移植治療肝病時，分化過程可能在其入血后即開始，而不是遷移至受損肝組織后。
本實驗室前期研究表明，利用肝纖維化大鼠肝組織勻漿上清液模擬肝纖維化組織微環境可以誘導HUCMSCs向肝細胞分化[9]。本實驗使用同一動物模型，對比肝纖維化組織微環境與血液微環境的誘導效果發現：① 形態方面，在肝纖維化組織微環境下，HUCM SCs培養24?h即出現形態變化，7?d時已由誘導前的長梭形轉變成了類似肝細胞的不規則形。而在血液微環境下，HUCMSCs培養7 d仍未出現形態變化。② 功能方面，在肝纖維化組織微環境下作用7?d，HUC MSCs合成尿素能力顯著提高，未誘導細胞BUN含量為（0.43± 0.07） mmol/L，誘導后為（2.52±0.20）mmol/ L；而在血液微環境下作用7?d，細胞合成尿素的能力提高程度低于肝纖維化組織微環境下，未誘導細胞BUN含量為（0.38±0.04） mmol/ L，誘導后為（0.74±0.07）mmol/ L。上述結果說明，肝纖維化組織微環境較血液微環境更有利于HUCMSCs向肝細胞分化。目前認為，當肝損傷導致內源性干細胞不能代償肝細胞的損失時，形成的組織微環境會支持外源性干細胞的活性，即可使干細胞歸巢至肝臟并向肝細胞分化，通過組織修復發揮替代治療作用[15-17]。這一過程的機制是：當肝損傷發生時，內在的Kupffer細胞、肝星狀細胞及浸潤炎性細胞可分泌一系列趨化因子、生長因子和細胞因子，形成利于肝細胞再生的組織微環境，同時血液中會形成EGF、HGF等調節因子的趨化梯度。移植入血的干細胞可在上述因素作用下向肝臟歸巢并向肝細胞分化[18-19]，這也就導致了肝纖維化組織微環境比血液微環境更有利于干細胞向肝細胞的分化。
MAPK/ERK信號通路是一個以三級磷酸化級聯反應為主體、介導細胞信號由外到內的傳導通路，主要調節細胞的增殖、分化、遷移和凋亡[20-21]。Yan等[22]的研究表明，ERK磷酸化在HUCMSCs向肝細胞分化的過程中起著重要作用，阻斷ERK的激活可以阻止這一分化過程。本研究結果表明，在肝纖維化大鼠血液微環境作用下MAPK/ERK信號通路被激活，ERK磷酸化增加，HUCMSCs開始向肝細胞分化。據報道MAPK/ERK信號通路可以被HGF、bFGF等多種生長因子、細胞因子激活[22-23]，且HUC MSCs向肝細胞的分化可通過在細胞培養液中添加HGF、EGF、OSM、bFGF等因子來實現[24-25]。本研究結果顯示肝纖維化大鼠血清對干細胞分化有誘導作用，而正常大鼠血清為陰性結果。為明確造成這一現象的原因，我們對比分析了兩種血清中上述4種因子的含量差異。結果顯示兩組血清中HGF、EGF、OSM的含量差異均有統計學意義，bFGF均未檢出；提示在肝纖維化條件下，大鼠血液中的HGF、EGF、OSM等因子水平會發生變化，形成的血液微環境會激活MAPK/ERK信號通路，促使HUCMSCs向肝細胞分化。因HGF、EGF、OSM等因子價格昂貴，而肝損傷動物的血清易于獲取，所以建立均一、穩定的動物模型，分析血清中的因子成分并進行合適配比，可能建立一種廉價高效的干細胞分化體系，有利于干細胞來源肝細胞的大量獲取。
目前，肝細胞移植和生物人工肝作為原位肝移植的補充治療手段，逐漸成為研究熱點[26-27]，而體外培養干細胞并創造條件使之分化為肝細胞，可作為肝細胞移植及構建生物人工肝的重要種子細胞來源。本次研究結果提示了肝纖維化大鼠血液微環境對HUCMSCs向肝細胞分化的誘導作用，下一步將繼續明確機體微環境對干細胞分化的影響，以利于體外誘導HUCMSCs向肝實質細胞分化最適微環境的建立。
