引用本文： 劉亦舒, 鄭志芳, 程飚. 鹽酸普萘洛爾乳膏對糖尿病小鼠創面愈合的影響及其機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(6): 742-747. doi: 10.7507/1002-1892.20160152 復制
糖尿病潰瘍是糖尿病嚴重慢性并發癥之一[1]，治療難度較大、病程長，普遍存在著上皮化緩慢、血管神經受損和感染等問題。普萘洛爾作為一種非選擇性的β受體阻滯劑，首先用于心血管疾病的治療[2]。近年研究發現，普萘洛爾可用于燒傷創面的治療。對小兒燒傷，普萘洛爾能減輕代謝亢進并逆轉肌肉蛋白質的分解代謝，促進燒傷創面愈合[3]。而普萘洛爾用于成人燒傷患者的安全性及有效性需要進一步觀察研究[4]。Romana-Souza等[5]研究發現口服普萘洛爾可有效減少局部炎性反應和改善后續修復過程，從而促進糖尿病大鼠皮膚創面愈合。Kunzi-Rapp[6]研究表明普萘洛爾可促進嬰幼兒血管瘤表面潰瘍愈合。本課題組前期研究亦表明口服普萘洛爾對嬰幼兒嚴重血管瘤具有良好療效[7]，并研發制作了鹽酸普萘洛爾乳膏（專利號：CN201310003911.5）[8]。目前，有關外用普萘洛爾能否促進糖尿病創面愈合罕見報道。本研究旨在觀察外用鹽酸普萘洛爾乳膏對糖尿病小鼠創面愈合的影響，分析其可能機制，為臨床應用奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8周齡雌性自發性BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju糖尿病小鼠18只，體質量35～40 g，購于南京大學-南京生物醫藥研究院。鹽酸普萘洛爾乳膏（2?000 g乳膏含20 g鹽酸普萘洛爾）、對照用乳膏（除不含鹽酸普萘洛爾外，其他成分與鹽酸普萘洛爾乳膏一致），均由廣州軍區廣州總醫院藥劑科提供。IL-1β、促血管生成素2 （angiogenin 2，Ang2） 抗體（Abcam公司，英國）。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國 ）；BX-51光學顯微鏡（Olympus公司，日本）；電泳儀、凝膠成像系統（Bio-Rad公司、美國）。
1.2 實驗分組及方法
18只小鼠適應性喂養1周后，按照隨機數字表法分為對照組及實驗組，每組9只。兩組小鼠腹腔注射0.6%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，在背部中線兩側（間距1 cm 以上） 用打孔器各制備直徑為0.6?cm的圓形全層皮膚缺損創面。無菌紗布壓迫止血后，實驗組及對照組分別涂抹鹽酸普萘洛爾乳膏和對照用乳膏，以完全覆蓋創面為準，外用無菌紗布包扎固定，單籠飼養。術后2、5、7、10、14、17 d換藥，換藥時擦掉創面未吸收的乳膏，重新涂抹相應乳膏。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后2、5、7、10、14、17、21 d，大體觀察創面愈合情況；照相后采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量創面面積，根據以下公式計算創面愈合率[9]：[1－（創面面積/創面初始面積）]×100%。
1.3.2 組織學觀察
術后2、5、7、10、14、17 d兩組隨機各取1只小鼠，21 d時取剩余3只小鼠，腹腔注射0.6%戊巴比妥（40 mg/kg） 麻醉，切取創緣外0.2 cm范圍內全層皮膚及創面組織，注射過量0.6%戊巴比妥處死小鼠。將創面標本分成兩部分，取一部分置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水、透明，石蠟包埋，切片，片厚4 μm。行HE、Masson及甲苯胺藍染色，鏡下分別觀察創面再上皮化、膠原纖維、肥大細胞情況。Masson染色膠原纖維呈藍色，甲苯胺藍染色肥大細胞顆粒呈紫紅色。
1.3.3 Western blot觀測
各時間點取另一部分創面標本，采用Western blot法檢測組織內IL-1β、Ang-2蛋白表達情況。取100 mg組織于研磨器內，加入500 μL?細胞裂解液，研磨后轉移至1.5 mL EP管內，冰上裂解30 min。4℃，14 000×g離心10 min，收集上清。取提取的蛋白溶液與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，煮沸10 min，恢復室溫，—?20℃保存，BCA法測定蛋白濃度。每種樣品50 μg，常規電泳、轉膜、漂洗后，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1?h。TBST洗膜10 min，1次；采用稀釋后一抗[IL-1β（1:1?000）、Ang2（1:3?000）]4℃孵育過夜；TBST洗膜10 min，4次；采用羊抗兔二抗（1:20?000）稀釋液37℃孵育1?h；TBST洗膜10?min，4次。X線片顯影，通過凝膠成像系統分析，以GAPDH作為內參，以目標蛋白與GAPDH吸光度（A）值比值作為目標蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
實驗組：術后2 d創面邊緣皮膚稍腫脹，基底蒼白；5～14 d創面逐漸縮小，基底紅潤，肉芽組織生長良好，無明顯滲出，邊緣可見新生上皮；17、21?d基本完成再上皮化。對照組：術后2、5 d創面邊緣皮膚腫脹明顯，基底蒼白，部分組織壞死，伴少許滲出；7、10 d創面逐漸縮小，基底稍紅潤，肉芽組織生長緩慢；14、17 d創面明顯縮小，邊緣可見新生上皮；21 d未完全完成再上皮化。術后2～17 d，實驗組創面愈合率均高于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；21 d，兩組創面愈合率比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 1、2。
圖1
兩組術后各時間點創面愈合率比較
Figure1.
Comparison of the wound healing rate between 2 groups at different time points
圖2
術后各時間點兩組創面大體觀察 ? ～? 實驗組術后即刻及5、14、21 d ? ～? 對照組術后即刻及5、14、21 d 圖 3 術后各時間點兩組HE染色觀察（×200） ? ～? 實驗組術后5、14、21 d ? ～? 對照組術后5、14、21 d
Figure2.
Gross observation of wounds healing at different time points ? -? Experimental group at immediate, 5, 14, and 21 days after operation ? -? Control group at immediate, 5, 14, and 21 days after operation Fig. 3 HE staining observation at different time points (×200) ? -? Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ? -? Control group at 5, 14, and 21 days after operation
2.2 組織學觀察
2.2.1 HE染色
術后2 d兩組創面以炎性反應為主，實驗組創緣開始出現表皮增厚，對照組未見明顯表皮增厚。5 d，對照組開始出現表皮增厚，實驗組創緣表皮增厚較明顯且較多炎性細胞浸潤。7～14?d，實驗組炎性細胞浸潤逐漸減少，基底毛細血管逐漸增多，可見角質形成細胞向創面中心爬行；而對照組仍存在較多炎性細胞浸潤，角質形成細胞爬行緩慢。21 d兩組大部分創面均已被上皮覆蓋，實驗組可見皮膚附屬器生成，對照組真皮乳頭層層次不明顯。見圖 3。
2.2.2 Masson染色
術后2 d兩組膠原纖維少；5～21 d實驗組膠原纖維范圍大于對照組，但兩組膠原纖維排列均較紊亂且粗細不均。見圖 4。
圖4
術后各時間點兩組Masson染色觀察（×200）? ～? 實驗組術后5、14、21 d ? ～? 對照組術后5、14、21 d 圖 5 術后各時間點兩組甲苯胺藍染色觀察（×200）? ～? 實驗組術后5、14、21 d ? ～? 對照組術后5、14、21 d 圖 6 Western blot觀察術后各時間點兩組IL-1β、Ang2蛋白表達 1： 2 d 2：5 d 3：7 d 4：10 d 5：14 d 6：17 d 7：21 d ? 實驗組 ? 對照組
Figure4.
Masson staining at different time points (×200) ? -? Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ? -? Control group at 5, 14, and 21 days after operation Fig. 5 Toluidine blue staining at different time points (×200) ? -? Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ? -? Control group at 5, 14, and 21 days after operation Fig. 6 Western blot results of IL-1 β and Ang2 in 2 groups 1: At 2 days 2 : At 5 days 3: At 7 days 4: At 10 days 5: At 14 days 6: At 17 days 7: At 21 days ? Experimental group ? Control group
2.2.3 甲苯胺藍染色
術后2～10 d兩組見少量陽性染色細胞；14、17 d兩組均未見陽性染色細胞；21?d對照組見少量陽性染色細胞，實驗組未見陽性染色細胞。見圖 5。
2.3 Western blot觀測
除術后10 d外，其余各時間點實驗組IL-1β蛋白相對表達量均低于對照組；術后各時間點實驗組Ang2蛋白相對表達量均低于對照組（圖 6）。術后2、5、7、10、14、17 d，實驗組IL-1β蛋白相對表達量分別為0.014、0.052、0.037、0.119、0.094、0.069，對照組分別為0.295、0.409、0.658、0.028、0.206、0.172；實驗組Ang2蛋白相對表達量分別為0.026、0.035、0.069、0.085、0.113、0.128，對照組分別為0.068、0.598、0.241、0.524、0.382、0.270。術后21 d，實驗組IL-1β及Ang2蛋白相對表達量分別為0.060±0.030、0.152±0.028，均低于對照組的0.170±0.105、0.212±0.069，但差異無統計學意義（t=1.759，P=0.153；t=1.387，P=0.238）。
3 討論
皮膚組織中分布著豐富的交感神經，交感神經節后纖維通過調節血管舒縮功能、立毛肌活動及腺體分泌維持皮膚微環境穩態，有研究表明交感神經在創面愈合中起重要作用[10]。此外，燒傷及創傷所致的應激狀態下高水平兒茶酚胺能抑制創面愈合，而口服高劑量普萘洛爾能拮抗該過程，從而促進創面愈合[11]。外用普萘洛爾是否也能改善交感神經功能尚未明確。Vestita等[12]報道局部外用普萘洛爾可治療足底較深慢性潰瘍。此外，與普萘洛爾類似的β受體阻滯劑噻嗎洛爾已用于慢性創面的治療[13]。Romana-Souza[6]報道口服普萘洛爾可促進糖尿病大鼠創面愈合，但該研究采用的是鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠。有研究報道自發突變的糖尿病小鼠更適合進行糖尿病慢性創面的研究[14]。為此本實驗選擇自發性糖尿病小鼠，觀察外用鹽酸普萘洛爾乳膏治療慢性創面的可行性，并探討其作用機制，為臨床應用提供理論依據。
創面愈合過程包括急性炎癥期、細胞增殖期和瘢痕形成期，角質形成細胞及成纖維細胞在創面愈合過程中發揮重要作用，其中表皮細胞作為一個獨立的神經內分泌器官參與了創面愈合過程[15]。再上皮化是定義創面成功愈合的一個重要標志性過程，所有慢性創面的再上皮化進程均受到抑制[15]。有研究發現，腎上腺素通過與β2受體結合抑制角質形成細胞遷移，從而延遲再上皮化[16]。本研究發現實驗組創面再上皮化快于對照組，因此加速上皮化可能是普萘洛爾促進糖尿病小鼠創面愈合的機制之一。這與Pullar等[17]報道的β受體阻滯劑可促進角質形成細胞增殖遷移一致。
IL-1β是一種具有多種生物活性的炎性細胞因子，能調節許多局部和系統的炎性反應。IL-1β由成纖維細胞產生，并對巨噬細胞、肥大細胞、成纖維細胞等產生生物學作用。研究表明，糖尿病足難治潰瘍組織內IL-1β顯著增高，進而抑制成纖維細胞的增殖[18]。本研究結果表明，普萘洛爾乳膏能促進創面愈合，術后10 d實驗組IL-1β 蛋白相對表達量高于對照組不排除是實驗誤差的可能，總體來看實驗組IL-1β蛋白相對表達量均低于對照組。膠原組織主要由成纖維細胞分泌產生，對創面愈合起到重要作用，普萘洛爾能抑制IL-1β的表達，減少其對成纖維細胞的抑制，從而使膠原增多，促進創面愈合，這可能也是外用普萘洛爾促進創面愈合的原因之一。
在糖尿病創面中，血管內皮細胞增殖活躍，但由于缺乏功能性的毛細血管，所以不能提供血供。這一機制可能與持續不正常的Ang表達和VEGF下調有關[19]。既往研究發現，Ang2主要由血管內皮細胞合成，通過自分泌作用，與自身細胞膜上的Tie2受體特異性結合，但不引起受體磷酸化和隨后的信號傳遞。Ang2的主要功能是競爭性抑制Ang1形成不穩定的血管。李小強等[20]報道負壓傷口療法可通過增強Ang1的表達，降低Ang2的表達，促進糖尿病大鼠傷口的血管發生。K?mpfer等[21]報道糖尿病小鼠創面Ang2的過度表達可降低VEGF含量，不利于血管形成。本研究表明，實驗組Ang2蛋白相對表達量較對照組減少，這可能是鹽酸普萘洛爾乳膏促進創面愈合的機制之一。也有研究表明普萘洛爾不能抑制視網膜病理性新血管形成，且不改變Ang2的表達[22]。因此普萘洛爾與Ang2關系還需進一步研究。
總之，局部外用鹽酸普萘洛爾乳膏可促進自發性糖尿病小鼠創面愈合，其機制涉及多個方面，包括表皮細胞的增殖、炎癥的抑制、血管的穩定等方面。此外，本研究觀察樣本量少，未對各時間點IL-1β及Ang2相對表達量進行統計學分析，且21 d時兩組差異無統計學意義，有關普萘洛爾促進慢性創面愈合的機制尚有待深入研究。
糖尿病潰瘍是糖尿病嚴重慢性并發癥之一[1]，治療難度較大、病程長，普遍存在著上皮化緩慢、血管神經受損和感染等問題。普萘洛爾作為一種非選擇性的β受體阻滯劑，首先用于心血管疾病的治療[2]。近年研究發現，普萘洛爾可用于燒傷創面的治療。對小兒燒傷，普萘洛爾能減輕代謝亢進并逆轉肌肉蛋白質的分解代謝，促進燒傷創面愈合[3]。而普萘洛爾用于成人燒傷患者的安全性及有效性需要進一步觀察研究[4]。Romana-Souza等[5]研究發現口服普萘洛爾可有效減少局部炎性反應和改善后續修復過程，從而促進糖尿病大鼠皮膚創面愈合。Kunzi-Rapp[6]研究表明普萘洛爾可促進嬰幼兒血管瘤表面潰瘍愈合。本課題組前期研究亦表明口服普萘洛爾對嬰幼兒嚴重血管瘤具有良好療效[7]，并研發制作了鹽酸普萘洛爾乳膏（專利號：CN201310003911.5）[8]。目前，有關外用普萘洛爾能否促進糖尿病創面愈合罕見報道。本研究旨在觀察外用鹽酸普萘洛爾乳膏對糖尿病小鼠創面愈合的影響，分析其可能機制，為臨床應用奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8周齡雌性自發性BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju糖尿病小鼠18只，體質量35～40 g，購于南京大學-南京生物醫藥研究院。鹽酸普萘洛爾乳膏（2?000 g乳膏含20 g鹽酸普萘洛爾）、對照用乳膏（除不含鹽酸普萘洛爾外，其他成分與鹽酸普萘洛爾乳膏一致），均由廣州軍區廣州總醫院藥劑科提供。IL-1β、促血管生成素2 （angiogenin 2，Ang2） 抗體（Abcam公司，英國）。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國 ）；BX-51光學顯微鏡（Olympus公司，日本）；電泳儀、凝膠成像系統（Bio-Rad公司、美國）。
1.2 實驗分組及方法
18只小鼠適應性喂養1周后，按照隨機數字表法分為對照組及實驗組，每組9只。兩組小鼠腹腔注射0.6%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，在背部中線兩側（間距1 cm 以上） 用打孔器各制備直徑為0.6?cm的圓形全層皮膚缺損創面。無菌紗布壓迫止血后，實驗組及對照組分別涂抹鹽酸普萘洛爾乳膏和對照用乳膏，以完全覆蓋創面為準，外用無菌紗布包扎固定，單籠飼養。術后2、5、7、10、14、17 d換藥，換藥時擦掉創面未吸收的乳膏，重新涂抹相應乳膏。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后2、5、7、10、14、17、21 d，大體觀察創面愈合情況；照相后采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量創面面積，根據以下公式計算創面愈合率[9]：[1－（創面面積/創面初始面積）]×100%。
1.3.2 組織學觀察
術后2、5、7、10、14、17 d兩組隨機各取1只小鼠，21 d時取剩余3只小鼠，腹腔注射0.6%戊巴比妥（40 mg/kg） 麻醉，切取創緣外0.2 cm范圍內全層皮膚及創面組織，注射過量0.6%戊巴比妥處死小鼠。將創面標本分成兩部分，取一部分置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水、透明，石蠟包埋，切片，片厚4 μm。行HE、Masson及甲苯胺藍染色，鏡下分別觀察創面再上皮化、膠原纖維、肥大細胞情況。Masson染色膠原纖維呈藍色，甲苯胺藍染色肥大細胞顆粒呈紫紅色。
1.3.3 Western blot觀測
各時間點取另一部分創面標本，采用Western blot法檢測組織內IL-1β、Ang-2蛋白表達情況。取100 mg組織于研磨器內，加入500 μL?細胞裂解液，研磨后轉移至1.5 mL EP管內，冰上裂解30 min。4℃，14 000×g離心10 min，收集上清。取提取的蛋白溶液與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，煮沸10 min，恢復室溫，—?20℃保存，BCA法測定蛋白濃度。每種樣品50 μg，常規電泳、轉膜、漂洗后，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1?h。TBST洗膜10 min，1次；采用稀釋后一抗[IL-1β（1:1?000）、Ang2（1:3?000）]4℃孵育過夜；TBST洗膜10 min，4次；采用羊抗兔二抗（1:20?000）稀釋液37℃孵育1?h；TBST洗膜10?min，4次。X線片顯影，通過凝膠成像系統分析，以GAPDH作為內參，以目標蛋白與GAPDH吸光度（A）值比值作為目標蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
實驗組：術后2 d創面邊緣皮膚稍腫脹，基底蒼白；5～14 d創面逐漸縮小，基底紅潤，肉芽組織生長良好，無明顯滲出，邊緣可見新生上皮；17、21?d基本完成再上皮化。對照組：術后2、5 d創面邊緣皮膚腫脹明顯，基底蒼白，部分組織壞死，伴少許滲出；7、10 d創面逐漸縮小，基底稍紅潤，肉芽組織生長緩慢；14、17 d創面明顯縮小，邊緣可見新生上皮；21 d未完全完成再上皮化。術后2～17 d，實驗組創面愈合率均高于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；21 d，兩組創面愈合率比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 1、2。
圖1
兩組術后各時間點創面愈合率比較
Figure1.
Comparison of the wound healing rate between 2 groups at different time points
圖2
術后各時間點兩組創面大體觀察 ? ～? 實驗組術后即刻及5、14、21 d ? ～? 對照組術后即刻及5、14、21 d 圖 3 術后各時間點兩組HE染色觀察（×200） ? ～? 實驗組術后5、14、21 d ? ～? 對照組術后5、14、21 d
Figure2.
Gross observation of wounds healing at different time points ? -? Experimental group at immediate, 5, 14, and 21 days after operation ? -? Control group at immediate, 5, 14, and 21 days after operation Fig. 3 HE staining observation at different time points (×200) ? -? Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ? -? Control group at 5, 14, and 21 days after operation
2.2 組織學觀察
2.2.1 HE染色
術后2 d兩組創面以炎性反應為主，實驗組創緣開始出現表皮增厚，對照組未見明顯表皮增厚。5 d，對照組開始出現表皮增厚，實驗組創緣表皮增厚較明顯且較多炎性細胞浸潤。7～14?d，實驗組炎性細胞浸潤逐漸減少，基底毛細血管逐漸增多，可見角質形成細胞向創面中心爬行；而對照組仍存在較多炎性細胞浸潤，角質形成細胞爬行緩慢。21 d兩組大部分創面均已被上皮覆蓋，實驗組可見皮膚附屬器生成，對照組真皮乳頭層層次不明顯。見圖 3。
2.2.2 Masson染色
術后2 d兩組膠原纖維少；5～21 d實驗組膠原纖維范圍大于對照組，但兩組膠原纖維排列均較紊亂且粗細不均。見圖 4。
圖4
術后各時間點兩組Masson染色觀察（×200）? ～? 實驗組術后5、14、21 d ? ～? 對照組術后5、14、21 d 圖 5 術后各時間點兩組甲苯胺藍染色觀察（×200）? ～? 實驗組術后5、14、21 d ? ～? 對照組術后5、14、21 d 圖 6 Western blot觀察術后各時間點兩組IL-1β、Ang2蛋白表達 1： 2 d 2：5 d 3：7 d 4：10 d 5：14 d 6：17 d 7：21 d ? 實驗組 ? 對照組
Figure4.
Masson staining at different time points (×200) ? -? Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ? -? Control group at 5, 14, and 21 days after operation Fig. 5 Toluidine blue staining at different time points (×200) ? -? Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ? -? Control group at 5, 14, and 21 days after operation Fig. 6 Western blot results of IL-1 β and Ang2 in 2 groups 1: At 2 days 2 : At 5 days 3: At 7 days 4: At 10 days 5: At 14 days 6: At 17 days 7: At 21 days ? Experimental group ? Control group
2.2.3 甲苯胺藍染色
術后2～10 d兩組見少量陽性染色細胞；14、17 d兩組均未見陽性染色細胞；21?d對照組見少量陽性染色細胞，實驗組未見陽性染色細胞。見圖 5。
2.3 Western blot觀測
除術后10 d外，其余各時間點實驗組IL-1β蛋白相對表達量均低于對照組；術后各時間點實驗組Ang2蛋白相對表達量均低于對照組（圖 6）。術后2、5、7、10、14、17 d，實驗組IL-1β蛋白相對表達量分別為0.014、0.052、0.037、0.119、0.094、0.069，對照組分別為0.295、0.409、0.658、0.028、0.206、0.172；實驗組Ang2蛋白相對表達量分別為0.026、0.035、0.069、0.085、0.113、0.128，對照組分別為0.068、0.598、0.241、0.524、0.382、0.270。術后21 d，實驗組IL-1β及Ang2蛋白相對表達量分別為0.060±0.030、0.152±0.028，均低于對照組的0.170±0.105、0.212±0.069，但差異無統計學意義（t=1.759，P=0.153；t=1.387，P=0.238）。
3 討論
皮膚組織中分布著豐富的交感神經，交感神經節后纖維通過調節血管舒縮功能、立毛肌活動及腺體分泌維持皮膚微環境穩態，有研究表明交感神經在創面愈合中起重要作用[10]。此外，燒傷及創傷所致的應激狀態下高水平兒茶酚胺能抑制創面愈合，而口服高劑量普萘洛爾能拮抗該過程，從而促進創面愈合[11]。外用普萘洛爾是否也能改善交感神經功能尚未明確。Vestita等[12]報道局部外用普萘洛爾可治療足底較深慢性潰瘍。此外，與普萘洛爾類似的β受體阻滯劑噻嗎洛爾已用于慢性創面的治療[13]。Romana-Souza[6]報道口服普萘洛爾可促進糖尿病大鼠創面愈合，但該研究采用的是鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠。有研究報道自發突變的糖尿病小鼠更適合進行糖尿病慢性創面的研究[14]。為此本實驗選擇自發性糖尿病小鼠，觀察外用鹽酸普萘洛爾乳膏治療慢性創面的可行性，并探討其作用機制，為臨床應用提供理論依據。
創面愈合過程包括急性炎癥期、細胞增殖期和瘢痕形成期，角質形成細胞及成纖維細胞在創面愈合過程中發揮重要作用，其中表皮細胞作為一個獨立的神經內分泌器官參與了創面愈合過程[15]。再上皮化是定義創面成功愈合的一個重要標志性過程，所有慢性創面的再上皮化進程均受到抑制[15]。有研究發現，腎上腺素通過與β2受體結合抑制角質形成細胞遷移，從而延遲再上皮化[16]。本研究發現實驗組創面再上皮化快于對照組，因此加速上皮化可能是普萘洛爾促進糖尿病小鼠創面愈合的機制之一。這與Pullar等[17]報道的β受體阻滯劑可促進角質形成細胞增殖遷移一致。
IL-1β是一種具有多種生物活性的炎性細胞因子，能調節許多局部和系統的炎性反應。IL-1β由成纖維細胞產生，并對巨噬細胞、肥大細胞、成纖維細胞等產生生物學作用。研究表明，糖尿病足難治潰瘍組織內IL-1β顯著增高，進而抑制成纖維細胞的增殖[18]。本研究結果表明，普萘洛爾乳膏能促進創面愈合，術后10 d實驗組IL-1β 蛋白相對表達量高于對照組不排除是實驗誤差的可能，總體來看實驗組IL-1β蛋白相對表達量均低于對照組。膠原組織主要由成纖維細胞分泌產生，對創面愈合起到重要作用，普萘洛爾能抑制IL-1β的表達，減少其對成纖維細胞的抑制，從而使膠原增多，促進創面愈合，這可能也是外用普萘洛爾促進創面愈合的原因之一。
在糖尿病創面中，血管內皮細胞增殖活躍，但由于缺乏功能性的毛細血管，所以不能提供血供。這一機制可能與持續不正常的Ang表達和VEGF下調有關[19]。既往研究發現，Ang2主要由血管內皮細胞合成，通過自分泌作用，與自身細胞膜上的Tie2受體特異性結合，但不引起受體磷酸化和隨后的信號傳遞。Ang2的主要功能是競爭性抑制Ang1形成不穩定的血管。李小強等[20]報道負壓傷口療法可通過增強Ang1的表達，降低Ang2的表達，促進糖尿病大鼠傷口的血管發生。K?mpfer等[21]報道糖尿病小鼠創面Ang2的過度表達可降低VEGF含量，不利于血管形成。本研究表明，實驗組Ang2蛋白相對表達量較對照組減少，這可能是鹽酸普萘洛爾乳膏促進創面愈合的機制之一。也有研究表明普萘洛爾不能抑制視網膜病理性新血管形成，且不改變Ang2的表達[22]。因此普萘洛爾與Ang2關系還需進一步研究。
總之，局部外用鹽酸普萘洛爾乳膏可促進自發性糖尿病小鼠創面愈合，其機制涉及多個方面，包括表皮細胞的增殖、炎癥的抑制、血管的穩定等方面。此外，本研究觀察樣本量少，未對各時間點IL-1β及Ang2相對表達量進行統計學分析，且21 d時兩組差異無統計學意義，有關普萘洛爾促進慢性創面愈合的機制尚有待深入研究。
