引用本文： 陶勇, 黃秋, 歐云生, 尹航, 陳艷陽, 涂平華. 焦脫鎂葉綠酸-a甲酯介導的光動力療法誘導人骨肉瘤MG63細胞凋亡的研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(6): 669-674. doi: 10.7507/1002-1892.20160136 復制
骨肉瘤是臨床最常見的原發惡性骨腫瘤，其侵襲性強，預后差，主要發生在兒童和青少年[1-2]。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種治療腫瘤的新方法，具有選擇性好、副反應少等優點，目前已用于食管癌、肺癌、皮膚癌等多種惡性疾病的臨床治療[3-6]。該方法首先通過靜脈輸注或局部注射將光敏劑導入體內，由于腫瘤組織對光敏劑的代謝與正常組織不同，光敏劑會相對特異地富集在腫瘤組織內；然后利用相應波長的光對腫瘤組織進行局部照射，光敏劑在光的激發下與周圍環境中的氧發生光化學反應產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），由ROS破壞腫瘤細胞和組織[7-9]。早期PDT主要采用血卟啉類衍生物作為光敏劑，該類光敏劑體內代謝慢，導致患者治療后避光時間長，而且成分復雜、靶向性弱、皮膚光毒性強[10]。焦脫鎂葉綠酸-a甲酯（pyropheophorbide-a methyl ester，MPPa）屬于第2代光敏劑，其光敏性強，化學結構明確，成分單一，性質穩定，體內代謝快，是一種具有臨床應用前景的新型光敏劑 [11-12]。研究表明，MPPa介導的PDT（MPPa-PDT）對鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞具有抑制和殺傷作用[13-16]，但有關其用于骨肉瘤的研究報道較少。為此，我們對MPPa-PDT誘導人骨肉瘤MG63細胞凋亡及其可能機制進行了研究，以期為MPPa-PDT應用于骨肉瘤的臨床治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
人骨肉瘤MG63細胞（中國科學院上海細胞庫）；MPPa、Hoechst33258（Sigma公司，美國）；p-PERK抗體（Santa Cruz公司，美國）；活化半胱氨酸蛋白酶12（cleaved-Caspase-12）抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；內質網源性轉錄因子（C/EBP homologous protein，CHOP）抗體（CST公司，美國）；胰蛋白酶、DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術有限公司）；Annexin V-碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。光動力治療儀（重慶京渝激光生物研究所）；透射電鏡（Hitachi公司，日本）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；流式細胞儀（B&D Biosciences公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
實驗分為4組，分別為空白對照組（對照組）、單純MPPa藥物組（MPPa組）、單純光照組（LED組）以及MPPa-PDT實驗組（MPPa-PDT組）。將MG63細胞置于完全培養基（含90%DMEM培養基、10%FBS及50 μg/mL青、鏈霉素）中，于37℃、5%CO2孵箱中常規培養。取對數生長期細胞換液后，MPPa-PDT組和MPPa組于避光條件下加入MPPa（0.75?μmol/L）[17]，對照組及LED組于避光條件下加入等量完全培養基。各組置于37℃、5%CO2孵箱中避光孵育20 h，去培養液，PBS緩沖液洗2遍，加入完全培養基。LED組及MPPa-PDT組采用集成LED特種光源（波長630 nm、連續輸出方式、光功率密度為40 mW/cm2）照射120 s，使細胞接受光照劑量為4.8 J/cm2[17]。各組均于避光條件下繼續培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞形態學及細胞凋亡觀察
取對數生長期MG63細胞，按5×104個/孔接種于24孔培養板中培養20 h后，按照分組方法進行相應處理后，繼續避光培養12 h。棄培養基，PBS緩沖液洗2遍，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。然后加入Hoechst33258（10 μg/mL）染料 200 μL，避光孵育10?min，PBS緩沖液洗2遍，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。
1.3.2 流式細胞術檢測
取對數生長期MG63細胞，按1×105 個/孔接種于6孔培養板中培養20 h后，按照分組方法進行相應處理后，繼續避光培養12 h。收集各組細胞，PBS緩沖液洗2遍，Annexin V-PI雙染，流式細胞術檢測細胞凋亡率。每組取3孔。
1.3.3 透射電鏡觀察
取對數生長期 MG63細胞，接種于直徑為10 cm培養皿中，按照分組方法進行相應處理后，繼續避光培養6 h。收集各組細胞，經2.5%戊二醛和1%鋨酸固定后，行梯度乙醇和丙酮脫水，然后包埋、固化、切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察細胞超微結構。
1.3.4 細胞內鈣離子水平檢測
取對數生長期MG63細胞，按1×105 個/孔接種于6孔培養板中培養20 h后，按照分組方法進行相應處理后，繼續避光培養2 h。收集各組細胞，PBS緩沖液洗3遍，加入鈣離子熒光探針Fura-3/AM（5 μmol/L）避光孵育15?min，PBS緩沖液洗3遍，收集細胞制成單細胞懸液，然后采用流式細胞術檢測細胞內熒光強度，代表鈣離子水平。每組取3孔。
1.3.5 Western blot檢測
取對數生長期MG63細胞，接種于直徑為6 cm培養皿中，培養20 h后按分組方法進行相應處理后，繼續避光培養。MPPa-PDT組于培養1、3、6、12 h，對照組、MPPa組、LED組于12 h收集細胞，提取細胞總蛋白。經BCA測定蛋白濃度后，加細胞裂解液調整各組至同一濃度，加上樣緩沖液煮沸變性后，取等量上述蛋白樣品行SDS凝膠電泳，轉膜、室溫5%牛奶封閉后分別加入p-PERK、CHOP、cleaved-Caspase-12一抗，4℃孵育過夜，復溫30 min后TBST漂洗4次（10 min/次），再加入相應辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育2 h，再經TBST漂洗4次（10 min/次），ECL化學發光法顯影。以β-actin作為內參。用Quantity One軟件進行圖像分析，以目標蛋白與β-actin灰度值比值作為目標蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學及細胞凋亡觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，MPPa-PDT組細胞明顯回縮變圓；其他3組細胞形態無明顯影響，呈梭形（圖 1）。Hoechst33258染色見MPPa-PDT組細胞出現核染色質邊集或凝集，呈高亮藍色，以及核固縮、碎裂等細胞凋亡形態學改變，而其他3組未出現明顯的細胞凋亡形態改變（圖 2）。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態（×100） ? 對照組 ? MPPa組 ? LED組 ? MPPa-PDT組 圖 2 Hoechst33258染色觀察各組細胞凋亡（熒光顯微鏡×200） ? 對照組 ? MPPa組 ? LED組 ? MPPa-PDT組 圖 3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡 ? 對照組 ? MPPa組 ? LED組 ? MPPa-PDT組 圖 4 透射電鏡觀察各組細胞超微結構 ? 對照組（×4 000）? MPPa組（×12?k） ? LED組（×12 k） ? MPPa-PDT組（×5 000）
Figure1.
Morphological changes of cells under inverted phase contrast microscopy in each group (×100) ? Control group ? MPPa group? LED group ? MPPa-PDT group Fig. 2 Apoptosis in each group by Hoechst33258 staining (Fluorescence microscopy×200) ? Control group ? MPPa group ? LED group ? MPPa-PDT group Fig. 3 The apoptotic rate of MG63 cells in each group by flow cytometry ? Control group ? MPPa group ? LED group ? MPPa-PDT group Fig. 4 Ultrastructural changes of MG63 cells in each?group by transmission electron microscopy ? Control group (×4 000) ? MPPa group (×12 k) ? LED group (×12?k) ? MPPa-PDT group (×5 000)
2.2 流式細胞術檢測
MPPa-PDT組細胞凋亡率為48.76%±3.54%，明顯高于對照組5.04%±0.41%、MPPa組5.33%±0.38%及LED組6.48%±0.46%，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；對照組、MPPa組及LED組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 3。
2.3 透射電鏡觀察
透射電鏡下，MPPa-PDT組細胞內質網出現明顯腫脹，呈空泡狀；其他3組細胞內質網形態正常。見圖 4。
2.4 細胞內鈣離子水平檢測
MPPa-PDT組細胞內鈣離子水平為485.29± 58.77，顯著高于對照組（97.24±4.77）、MPPa組（97.95±6.30）、LED組（101.17±5.26），比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；對照組、MPPa組及LED組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 5。
圖5
流式細胞術檢測各組細胞內鈣離子水平 ? 對照組 ? MPPa組 ? LED組 ? MPPa-PDT組 圖 6 Western blot檢測各組p-PERK、CHOP、cleaved-Caspase-12的表達 Mr：相對分子質量 1：對照組 2：MPPa組 3：LED組 4： MPPa-PDT組1 h 5：MPPa-PDT組3 h 6：MPPa-PDT組6 h 7：MPPa-PDT組12 h 圖 7 各組p-PERK、CHOP、cleaved-Caspase-12蛋白相對表達量比較 1：對照組 2：MPPa組 3：LED組 4：MPPa-PDT組1 h 5：MPPa-PDT組3 h 6：MPPa-PDT組6 h 7：MPPa-PDT組12 h
Figure5.
The levels of Ca2+ in MG63 cells by flow cytometry ? Control group ? MPPa group ? LED group ? MPPa-PDT group Fig. 6 The expressions of p-PERK, CHOP, and cleaved-Caspase-12 by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Control group 2:MPPa group 3: LED group 4: MPPa-PDT group at 1 hour 5: MPPa-PDT group at 3 hours 6: MPPa-PDT group at 6 hours 7: MPPa-PDT group at 12 hours Fig. 7 Relative expressions of p-PERK, CHOP, and cleaved-Caspase-12 proteins in each group 1: Control group 2: MPPa group 3: LED group 4: MPPa-PDT group at 1 hour 5: MPPa-PDT group at 3 hours 6: MPPa-PDT group at 6 hours 7: MPPa-PDT group at 12 hours
2.5 Western blot檢測
培養12 h后，對照組、MPPa組、LED組p-PERK、CHOP、cleaved-Caspase-12相對表達量比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。MPPa-PDT組p-PERK、CHOP、cleaved-Caspase-12相對表達量隨時間延長呈總體增高趨勢，且均高于其他3組，其中培養1?h后p-PERK相對表達量、3 h后CHOP相對表達量以及6 h后cleaved-Caspase-12相對表達量明顯高于其他3組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點與其他3組比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 6、7。
3 討論
李悅等[18]研究發現血卟啉介導的PDT聯合手術治療胰腺癌安全有效，能明顯延長患者生存期。秦懷海等[19]發現手術聯合血卟啉單甲醚介導的PDT治療腦膠質瘤能明顯提高患者生存率和生活質量。同時在腫瘤動物模型研究中，與單純邊緣切除術相比，術中聯合PDT處理切緣可明顯降低腫瘤的復發率[20]。以上研究提示，手術聯合PDT是一種極具前景的腫瘤治療策略。本研究以體外培養的人骨肉瘤MG63細胞為研究對象，探討MPPa-PDT對人骨肉瘤細胞的影響及其可能機制。
研究發現MPPa-PDT能誘導前列腺癌細胞、乳腺癌細胞、對順鉑耐受的卵巢癌細胞凋亡[13-15]。本研究中，MPPa-PDT組人骨肉瘤MG63細胞經MPPa-PDT處理12 h后形態回縮變圓，而對照組、MPPa組、LED組細胞未受明顯影響，形態正常；Hoechst33258熒光染色觀察到細胞出現核固縮、碎裂等典型的凋亡形態學改變，同時流式細胞術檢測示細胞凋亡率明顯高于其他對照組（P < 0.05）。以上檢測結果表明MPPa-PDT能誘導人骨肉瘤MG63細胞發生凋亡。
內質網是一個成分與功能非常復雜的細胞器，具有蛋白合成及跨膜轉運、整合、翻譯后修飾、糖基化修飾、磷脂和膽固醇的合成、細胞內鈣離子穩態的控制等功能[21]。病理狀態下，內質網功能受到干擾，導致內質網應激。內質網應激會觸發未折疊蛋白反應和細胞內鈣離子穩態失衡，并通過激活內質網跨膜蛋白PERK、IRE1、ATF6使其磷酸化或表達增加，以誘導下游信號分子的激活或基因的表達，進而維持細胞穩態，對細胞生存至關重要[21]。然而持久或過強的內質網應激會促進內質網相關死亡蛋白的表達，誘導細胞凋亡[22-23]。透射電鏡觀察經MPPa-PDT處理6 h后的MG63細胞內質網明顯腫脹，流式細胞儀檢測也發現MPPa-PDT組細胞內鈣離子水平明顯高于其他對照組（P < 0.05），同時Western blot也提示MPPa-PDT處理1 h后，PERK的磷酸化水平逐漸升高，明顯高于其他對照組（P < 0.05）。以上結果表明MPPa-PDT能誘導人骨肉瘤MG63細胞發生內質網應激。
C/EBP轉錄因子家族成員CHOP是內質網應激特異轉錄因子，其表達增加會介導細胞凋亡[23]。Caspase家族成員Caspase-12位于內質網膜上，是介導內質網應激性凋亡的一個關鍵分子，只有在發生內質網應激相關性凋亡時，才被激活切割向cleaved-Caspase-12轉變，并進一步激活Caspase家族的Caspase-9等，介導細胞凋亡[24]。本研究中，在MPPa-PDT處理3 h后MG63細胞CHOP表達逐漸升高，明顯高于其他對照組（P < 0.05）；另外，MPPa-PDT處理6 h后，cleaved-Caspase-12表達也明顯高于其他對照組（P < 0.05）。以上結果表明內質網應激途徑參與了MPPa-PDT誘導MG63細胞凋亡的過程。
綜上述，本研究結果提示MPPa-PDT可誘導人骨肉瘤MG63細胞發生內質網應激，并上調內質網應激性凋亡介質CHOP、cleaved-Caspase-12的表達，進而激活內質網應激凋亡通路，最終誘導細胞凋亡。表明MPPa-PDT對骨肉瘤具有抗腫瘤作用，有望聯合手術應用于骨肉瘤的臨床治療。但本研究也存在不足之處：PDT誘導細胞凋亡過程復雜，線粒體凋亡途徑、死亡受體相關途徑和內質網應激性凋亡途徑均有報道[25]。在MPPa-PDT誘導骨肉瘤細胞凋亡過程中是否還存在其他死亡途徑及其與內質網應激性凋亡途徑的關系仍需進一步研究。
骨肉瘤是臨床最常見的原發惡性骨腫瘤，其侵襲性強，預后差，主要發生在兒童和青少年[1-2]。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種治療腫瘤的新方法，具有選擇性好、副反應少等優點，目前已用于食管癌、肺癌、皮膚癌等多種惡性疾病的臨床治療[3-6]。該方法首先通過靜脈輸注或局部注射將光敏劑導入體內，由于腫瘤組織對光敏劑的代謝與正常組織不同，光敏劑會相對特異地富集在腫瘤組織內；然后利用相應波長的光對腫瘤組織進行局部照射，光敏劑在光的激發下與周圍環境中的氧發生光化學反應產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），由ROS破壞腫瘤細胞和組織[7-9]。早期PDT主要采用血卟啉類衍生物作為光敏劑，該類光敏劑體內代謝慢，導致患者治療后避光時間長，而且成分復雜、靶向性弱、皮膚光毒性強[10]。焦脫鎂葉綠酸-a甲酯（pyropheophorbide-a methyl ester，MPPa）屬于第2代光敏劑，其光敏性強，化學結構明確，成分單一，性質穩定，體內代謝快，是一種具有臨床應用前景的新型光敏劑 [11-12]。研究表明，MPPa介導的PDT（MPPa-PDT）對鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞具有抑制和殺傷作用[13-16]，但有關其用于骨肉瘤的研究報道較少。為此，我們對MPPa-PDT誘導人骨肉瘤MG63細胞凋亡及其可能機制進行了研究，以期為MPPa-PDT應用于骨肉瘤的臨床治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
人骨肉瘤MG63細胞（中國科學院上海細胞庫）；MPPa、Hoechst33258（Sigma公司，美國）；p-PERK抗體（Santa Cruz公司，美國）；活化半胱氨酸蛋白酶12（cleaved-Caspase-12）抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；內質網源性轉錄因子（C/EBP homologous protein，CHOP）抗體（CST公司，美國）；胰蛋白酶、DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術有限公司）；Annexin V-碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。光動力治療儀（重慶京渝激光生物研究所）；透射電鏡（Hitachi公司，日本）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；流式細胞儀（B&D Biosciences公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
實驗分為4組，分別為空白對照組（對照組）、單純MPPa藥物組（MPPa組）、單純光照組（LED組）以及MPPa-PDT實驗組（MPPa-PDT組）。將MG63細胞置于完全培養基（含90%DMEM培養基、10%FBS及50 μg/mL青、鏈霉素）中，于37℃、5%CO2孵箱中常規培養。取對數生長期細胞換液后，MPPa-PDT組和MPPa組于避光條件下加入MPPa（0.75?μmol/L）[17]，對照組及LED組于避光條件下加入等量完全培養基。各組置于37℃、5%CO2孵箱中避光孵育20 h，去培養液，PBS緩沖液洗2遍，加入完全培養基。LED組及MPPa-PDT組采用集成LED特種光源（波長630 nm、連續輸出方式、光功率密度為40 mW/cm2）照射120 s，使細胞接受光照劑量為4.8 J/cm2[17]。各組均于避光條件下繼續培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞形態學及細胞凋亡觀察
取對數生長期MG63細胞，按5×104個/孔接種于24孔培養板中培養20 h后，按照分組方法進行相應處理后，繼續避光培養12 h。棄培養基，PBS緩沖液洗2遍，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。然后加入Hoechst33258（10 μg/mL）染料 200 μL，避光孵育10?min，PBS緩沖液洗2遍，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。
1.3.2 流式細胞術檢測
取對數生長期MG63細胞，按1×105 個/孔接種于6孔培養板中培養20 h后，按照分組方法進行相應處理后，繼續避光培養12 h。收集各組細胞，PBS緩沖液洗2遍，Annexin V-PI雙染，流式細胞術檢測細胞凋亡率。每組取3孔。
1.3.3 透射電鏡觀察
取對數生長期 MG63細胞，接種于直徑為10 cm培養皿中，按照分組方法進行相應處理后，繼續避光培養6 h。收集各組細胞，經2.5%戊二醛和1%鋨酸固定后，行梯度乙醇和丙酮脫水，然后包埋、固化、切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察細胞超微結構。
1.3.4 細胞內鈣離子水平檢測
取對數生長期MG63細胞，按1×105 個/孔接種于6孔培養板中培養20 h后，按照分組方法進行相應處理后，繼續避光培養2 h。收集各組細胞，PBS緩沖液洗3遍，加入鈣離子熒光探針Fura-3/AM（5 μmol/L）避光孵育15?min，PBS緩沖液洗3遍，收集細胞制成單細胞懸液，然后采用流式細胞術檢測細胞內熒光強度，代表鈣離子水平。每組取3孔。
1.3.5 Western blot檢測
取對數生長期MG63細胞，接種于直徑為6 cm培養皿中，培養20 h后按分組方法進行相應處理后，繼續避光培養。MPPa-PDT組于培養1、3、6、12 h，對照組、MPPa組、LED組于12 h收集細胞，提取細胞總蛋白。經BCA測定蛋白濃度后，加細胞裂解液調整各組至同一濃度，加上樣緩沖液煮沸變性后，取等量上述蛋白樣品行SDS凝膠電泳，轉膜、室溫5%牛奶封閉后分別加入p-PERK、CHOP、cleaved-Caspase-12一抗，4℃孵育過夜，復溫30 min后TBST漂洗4次（10 min/次），再加入相應辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育2 h，再經TBST漂洗4次（10 min/次），ECL化學發光法顯影。以β-actin作為內參。用Quantity One軟件進行圖像分析，以目標蛋白與β-actin灰度值比值作為目標蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學及細胞凋亡觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，MPPa-PDT組細胞明顯回縮變圓；其他3組細胞形態無明顯影響，呈梭形（圖 1）。Hoechst33258染色見MPPa-PDT組細胞出現核染色質邊集或凝集，呈高亮藍色，以及核固縮、碎裂等細胞凋亡形態學改變，而其他3組未出現明顯的細胞凋亡形態改變（圖 2）。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態（×100） ? 對照組 ? MPPa組 ? LED組 ? MPPa-PDT組 圖 2 Hoechst33258染色觀察各組細胞凋亡（熒光顯微鏡×200） ? 對照組 ? MPPa組 ? LED組 ? MPPa-PDT組 圖 3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡 ? 對照組 ? MPPa組 ? LED組 ? MPPa-PDT組 圖 4 透射電鏡觀察各組細胞超微結構 ? 對照組（×4 000）? MPPa組（×12?k） ? LED組（×12 k） ? MPPa-PDT組（×5 000）
Figure1.
Morphological changes of cells under inverted phase contrast microscopy in each group (×100) ? Control group ? MPPa group? LED group ? MPPa-PDT group Fig. 2 Apoptosis in each group by Hoechst33258 staining (Fluorescence microscopy×200) ? Control group ? MPPa group ? LED group ? MPPa-PDT group Fig. 3 The apoptotic rate of MG63 cells in each group by flow cytometry ? Control group ? MPPa group ? LED group ? MPPa-PDT group Fig. 4 Ultrastructural changes of MG63 cells in each?group by transmission electron microscopy ? Control group (×4 000) ? MPPa group (×12 k) ? LED group (×12?k) ? MPPa-PDT group (×5 000)
2.2 流式細胞術檢測
MPPa-PDT組細胞凋亡率為48.76%±3.54%，明顯高于對照組5.04%±0.41%、MPPa組5.33%±0.38%及LED組6.48%±0.46%，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；對照組、MPPa組及LED組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 3。
2.3 透射電鏡觀察
透射電鏡下，MPPa-PDT組細胞內質網出現明顯腫脹，呈空泡狀；其他3組細胞內質網形態正常。見圖 4。
2.4 細胞內鈣離子水平檢測
MPPa-PDT組細胞內鈣離子水平為485.29± 58.77，顯著高于對照組（97.24±4.77）、MPPa組（97.95±6.30）、LED組（101.17±5.26），比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；對照組、MPPa組及LED組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 5。
圖5
流式細胞術檢測各組細胞內鈣離子水平 ? 對照組 ? MPPa組 ? LED組 ? MPPa-PDT組 圖 6 Western blot檢測各組p-PERK、CHOP、cleaved-Caspase-12的表達 Mr：相對分子質量 1：對照組 2：MPPa組 3：LED組 4： MPPa-PDT組1 h 5：MPPa-PDT組3 h 6：MPPa-PDT組6 h 7：MPPa-PDT組12 h 圖 7 各組p-PERK、CHOP、cleaved-Caspase-12蛋白相對表達量比較 1：對照組 2：MPPa組 3：LED組 4：MPPa-PDT組1 h 5：MPPa-PDT組3 h 6：MPPa-PDT組6 h 7：MPPa-PDT組12 h
Figure5.
The levels of Ca2+ in MG63 cells by flow cytometry ? Control group ? MPPa group ? LED group ? MPPa-PDT group Fig. 6 The expressions of p-PERK, CHOP, and cleaved-Caspase-12 by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Control group 2:MPPa group 3: LED group 4: MPPa-PDT group at 1 hour 5: MPPa-PDT group at 3 hours 6: MPPa-PDT group at 6 hours 7: MPPa-PDT group at 12 hours Fig. 7 Relative expressions of p-PERK, CHOP, and cleaved-Caspase-12 proteins in each group 1: Control group 2: MPPa group 3: LED group 4: MPPa-PDT group at 1 hour 5: MPPa-PDT group at 3 hours 6: MPPa-PDT group at 6 hours 7: MPPa-PDT group at 12 hours
2.5 Western blot檢測
培養12 h后，對照組、MPPa組、LED組p-PERK、CHOP、cleaved-Caspase-12相對表達量比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。MPPa-PDT組p-PERK、CHOP、cleaved-Caspase-12相對表達量隨時間延長呈總體增高趨勢，且均高于其他3組，其中培養1?h后p-PERK相對表達量、3 h后CHOP相對表達量以及6 h后cleaved-Caspase-12相對表達量明顯高于其他3組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點與其他3組比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 6、7。
3 討論
李悅等[18]研究發現血卟啉介導的PDT聯合手術治療胰腺癌安全有效，能明顯延長患者生存期。秦懷海等[19]發現手術聯合血卟啉單甲醚介導的PDT治療腦膠質瘤能明顯提高患者生存率和生活質量。同時在腫瘤動物模型研究中，與單純邊緣切除術相比，術中聯合PDT處理切緣可明顯降低腫瘤的復發率[20]。以上研究提示，手術聯合PDT是一種極具前景的腫瘤治療策略。本研究以體外培養的人骨肉瘤MG63細胞為研究對象，探討MPPa-PDT對人骨肉瘤細胞的影響及其可能機制。
研究發現MPPa-PDT能誘導前列腺癌細胞、乳腺癌細胞、對順鉑耐受的卵巢癌細胞凋亡[13-15]。本研究中，MPPa-PDT組人骨肉瘤MG63細胞經MPPa-PDT處理12 h后形態回縮變圓，而對照組、MPPa組、LED組細胞未受明顯影響，形態正常；Hoechst33258熒光染色觀察到細胞出現核固縮、碎裂等典型的凋亡形態學改變，同時流式細胞術檢測示細胞凋亡率明顯高于其他對照組（P < 0.05）。以上檢測結果表明MPPa-PDT能誘導人骨肉瘤MG63細胞發生凋亡。
內質網是一個成分與功能非常復雜的細胞器，具有蛋白合成及跨膜轉運、整合、翻譯后修飾、糖基化修飾、磷脂和膽固醇的合成、細胞內鈣離子穩態的控制等功能[21]。病理狀態下，內質網功能受到干擾，導致內質網應激。內質網應激會觸發未折疊蛋白反應和細胞內鈣離子穩態失衡，并通過激活內質網跨膜蛋白PERK、IRE1、ATF6使其磷酸化或表達增加，以誘導下游信號分子的激活或基因的表達，進而維持細胞穩態，對細胞生存至關重要[21]。然而持久或過強的內質網應激會促進內質網相關死亡蛋白的表達，誘導細胞凋亡[22-23]。透射電鏡觀察經MPPa-PDT處理6 h后的MG63細胞內質網明顯腫脹，流式細胞儀檢測也發現MPPa-PDT組細胞內鈣離子水平明顯高于其他對照組（P < 0.05），同時Western blot也提示MPPa-PDT處理1 h后，PERK的磷酸化水平逐漸升高，明顯高于其他對照組（P < 0.05）。以上結果表明MPPa-PDT能誘導人骨肉瘤MG63細胞發生內質網應激。
C/EBP轉錄因子家族成員CHOP是內質網應激特異轉錄因子，其表達增加會介導細胞凋亡[23]。Caspase家族成員Caspase-12位于內質網膜上，是介導內質網應激性凋亡的一個關鍵分子，只有在發生內質網應激相關性凋亡時，才被激活切割向cleaved-Caspase-12轉變，并進一步激活Caspase家族的Caspase-9等，介導細胞凋亡[24]。本研究中，在MPPa-PDT處理3 h后MG63細胞CHOP表達逐漸升高，明顯高于其他對照組（P < 0.05）；另外，MPPa-PDT處理6 h后，cleaved-Caspase-12表達也明顯高于其他對照組（P < 0.05）。以上結果表明內質網應激途徑參與了MPPa-PDT誘導MG63細胞凋亡的過程。
綜上述，本研究結果提示MPPa-PDT可誘導人骨肉瘤MG63細胞發生內質網應激，并上調內質網應激性凋亡介質CHOP、cleaved-Caspase-12的表達，進而激活內質網應激凋亡通路，最終誘導細胞凋亡。表明MPPa-PDT對骨肉瘤具有抗腫瘤作用，有望聯合手術應用于骨肉瘤的臨床治療。但本研究也存在不足之處：PDT誘導細胞凋亡過程復雜，線粒體凋亡途徑、死亡受體相關途徑和內質網應激性凋亡途徑均有報道[25]。在MPPa-PDT誘導骨肉瘤細胞凋亡過程中是否還存在其他死亡途徑及其與內質網應激性凋亡途徑的關系仍需進一步研究。
