引用本文： 張晨, 李苗, 馬駿, 張二洋, 班文瑞, 呂雷鋒, 黨曉謙, 王坤正. Wnt/β-catenin信號通路在大鼠早期激素性股骨頭缺血性壞死中的作用機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(6): 661-668. doi: 10.7507/1002-1892.20160135 復制
研究表明，激素性股骨頭缺血性壞死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）與成骨細胞和骨細胞的凋亡存在密切關系[1-4]。糖皮質激素促進骨細胞和成骨細胞凋亡，可能是導致SANFH發生的重要因素之一[5]。Wnt/β-catenin信號通路在多細胞動物中廣泛存在，參與調控一些凋亡因子與抗凋亡因子，即Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因，主要有c-Myc、cyclin D1基因等[6-7]。研究表明，Wnt信號通路參與了骨質形成[8]以及BMSCs分化[9-14]。目前共發現了5種Wnt/β-catenin信號通路的胞外拮抗分子，分泌型卷曲相關蛋白（secreted frizzled related proteins，SFRPs）是其中一種，由SFRP1～SFRP5組成，SFRP1能與受體競爭結合Wnt蛋白，有效阻斷Wnt信號通路[15]。本實驗應用SFRP1作為Wnt/β-catenin信號通路的阻斷劑，探討Wnt/β-catenin信號通路在SANFH中的作用以及在應用SFRP1之后骨壞死程度的改變，為SANFH的診治研究提供新的理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑
12月齡清潔級雄性SD大鼠72只，體質量200～230 g，由西安交通大學實驗動物中心提供，實驗前適應性喂養1周。脂多糖、人重組SFRP1蛋白、免疫組織化學檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒（Sigma公司，美國）；甲潑尼龍（Pfizer公司，美國）；氨芐青霉素（Genview公司，美國）；TUNEL凋亡試劑盒（Promega公司，美國）；兔抗鼠β-catenin、c-Myc抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（Santa Cruz公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
采用隨機數字表法將72只SD大鼠分為3組（n=24），分別為對照組（A組）、模型組（B組）和干預組（C組）。B、C組大鼠采用脂多糖聯合甲潑尼龍法制備SANFH模型[16-18]。具體方法：經尾靜脈注射脂多糖（10 μg/L），共3次，每次間隔24 h；脂多糖注射結束后開始肌肉注射甲潑尼龍（20 mg/kg），共7 次，每次間隔24 h。B組僅制備SANFH模型；C組在第1次注射甲潑尼龍時，開始在激素注射對側肢體肌肉注射人重組SFRP1蛋白[1 μg/（kg·d）]，持續30?d[19]。A組于B組各注射時間點同法給予等量生理鹽水。為防止感染發生，于第1次注射甲潑尼龍開始，每天肌肉注射10萬U青霉素，連續7 d；之后按照相等劑量每周注射2次。實驗期間動物均分籠飼養。于末次注射甲潑尼龍后2、4、8 周，各組隨機取8只動物，采取脊椎脫臼法處死，切取雙側股骨頭標本進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察B、C組動物造模期間以及造模后存活、飲食、活動等情況。
1.3.2 組織學觀察
取左側股骨頭PBS沖洗后，置于4%多聚甲醛固定3 d，EDTA緩沖液脫鈣，每2天更換1次脫鈣液，觀察骨標本表面顏色，應用物理法檢測脫鈣程度。待組織脫鈣完全后，逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，片厚 5 μm。取部分切片行HE染色，鏡下觀察骨髓細胞以及骨髓內脂肪細胞，骨小梁以及骨細胞。每個樣本取3張切片，于200倍鏡下隨機取10個視野，計數空骨陷窩以及總骨陷窩，并按照以下公式計算空骨陷窩率。空骨陷窩率=空骨陷窩數/總骨陷窩數×100%。取均值。
1.3.3 細胞凋亡染色觀察
取部分切片根據TUNEL凋亡試劑盒說明進行染色，鏡下觀察骨細胞中細胞核染色為棕黃色者為陽性細胞。每個樣本取3 張切片，于200倍鏡下隨機取10個視野，計數陽性細胞以及總細胞，并按照以下公式計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=陽性細胞數/總細胞數×100%。取均值。
1.3.4 免疫組織化學染色
取部分切片按照SP法行免疫組織化學染色，觀測股骨頭組織中活性β-catenin、c-Myc表達。鏡下觀察細胞膜、細胞質及細胞外基質中出現棕黃色反應產物判定為陽性。照相后采用FR-200紫外與可見光分析裝置圖像分析系統測量圖像積分吸光度（IA）值，作為活性β-catenin、c-Myc表達量。
1.3.5 Western blot 檢測
取右側股骨頭低溫研磨，應用RIPA裂解液低溫提取總蛋白，BCA法測定總蛋白量。經制膠、電泳、轉膜、封閉后，一抗孵育過夜，二抗孵育。取出聚偏氟乙烯膜，化學發光法獲得膠片后進行圖像采集，目標條帶A值采用 Quantity One 凝膠圖像軟件分析，以目標條帶與β-actin條帶 A值的比值作為活性β-catenin、c-Myc相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
B、C組造模期間共6只動物死亡，3只于注射脂多糖當天死于脂多糖引起的機體急性反應；另3 只分別于末次注射甲潑尼龍后第6、8、9天因感染死亡。同法對動物進行補充。其余動物均存活至實驗完成。
注射脂多糖第1、2天B、C組動物出現寒顫、蜷縮，飲食、活動均減少，精神較差；注射甲潑尼龍1周后，各組動物活動、飲食恢復正常，四肢負重未見明顯異常；6周后B、C組動物均出現輕度跛行，其余情況正常。
2.2 組織學觀察
A組：各時間點骨小梁結構正常，未見紊亂或斷裂，未發現空骨陷窩，其中骨陷窩中骨細胞大小、形態均正常，髓腔內造血組織與脂肪組織未見明顯變性或壞死。B組：2周時骨小梁出現骨質紊亂，并有部分小梁發生斷裂，骨小梁中出現少量空骨陷窩，髓腔內脂肪細胞體積增大，部分融合；4周時空骨陷窩較2周時明顯增多，骨髓腔內脂肪細胞增大、增多；8 周時出現壞死骨，骨小梁嚴重破壞，大量空骨陷窩，骨髓腔內正常造血組織消失。C組：2周時骨組織破壞程度較B組2周時更嚴重，骨小梁更紊亂，出現少量空骨陷窩；4周時可見較多空骨陷窩，髓腔內造血細胞減少以及脂肪細胞增大、增多；8周時出現嚴重骨壞死形成，髓腔內造血組織完全消失，并有大量空骨陷窩。見圖 1。各時間點C組空骨陷窩率均高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
圖1
各時間點各組組織學觀察（HE×200） 從左至右分別為A、B、C組 ? 2周 ? 4周 ? 8周 圖 2 各時間點各組TUNEL染色觀察（×200） 從左至右分別為A、B、C組 ? 2周 ? 4周 ? 8周
Figure1.
Histological observation in every group at each time point (HE×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ? At 2?weeks ? At 4 weeks ? At 8 weeks Fig.2 TUNEL staining in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ? At 2 weeks ? At 4 weeks ? At 8 weeks
表1
各時間點各組空骨陷窩率及細胞凋亡率比較（n=8，%，2.3 細胞凋亡染色觀察
A組各時間點未見凋亡細胞異常增多，B、C組隨時間延長凋亡細胞均逐漸增多（圖 2）。各時間點C組細胞凋亡率均高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
2.4 免疫組織化學染色觀察
隨時間延長，A組活性β-catenin、c-Myc表達未見顯著變化，B、C組活性β-catenin、c-Myc表達逐漸降低（圖 3、4）。各時間點C組活性β-catenin及c-Myc表達水平均低于A、B組，B組低于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 5、6。
圖3
各時間點各組活性β-catenin免疫組織化學染色觀察（×200） 從左至右分別為A、B、C組 ? 2周 ? 4周 ? 8周 圖 4 各時間點各組活性c-Myc免疫組織化學染色觀察（×200） 從左至右分別為A、B、C組 ? 2周 ? 4周 ? 8周
Figure3.
Immunohistochemical staining of activated β-catenin in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ? At 2 weeks ? At 4 weeks ? At 8 weeks Fig. 4 Immunohistochemical staining of activated c-Myc in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ? At 2 weeks ? At 4 weeks ? At 8 weeks
圖5
免疫組織化學染色檢測各時間點各組活性β-catenin表達量 圖 6 免疫組織化學染色檢測各時間點各組活性c-Myc表達量 圖 7 Western blot檢測各時間點各組活性β-catenin、c-Myc表達 1：A組 2：B組 3：C組 ? 2周 ? 4周 ? 8周 圖 8 各時間點各組活性β-catenin 相對表達量 圖 9 各時間點各組活性c-Myc 相對表達量
Figure5.
Comparison of expression of activated β-catenin between groups at each time point by immunohistochemical staining Fig. 6 Comparison of expression of activated c-Myc between groups at each time point by immunohistochemical staining Fig. 7 Expression of activated β-catenin and c-Myc in every group at each time point by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C ? At 2 weeks ? At 4 weeks ? At 8?weeks Fig. 8 Comparison of relative expression of activated β-catenin between groups at each time point Fig. 9 Comparison of relative expression of activated c-Myc between groups at each time point
2.5 Western blot 檢測
各時間點，A組均見活性β-catenin、c-Myc表達，且表達程度無明顯變化；B、C組隨時間延長活性β-catenin、c-Myc表達逐漸降低（圖 7）。各時間點C組活性β-catenin、c-Myc相對表達量均明顯低于A、B組，B組低于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05) 。見圖 8、9。
3 討論
目前，SANFH的發生機制尚未闡明，由此產生了相關學說，比如脂肪栓塞學說、血管內凝血學說、骨內高壓理論學說、骨質疏松學說、免疫因素紊亂學說等。Weinstein等[20]發現由激素所致的股骨頭壞死組織切片中出現了大量骨細胞凋亡，而其他因素所致的股骨頭壞死切片中未見或少見凋亡骨細胞。激素具有使細胞凋亡的潛在誘導作用，能促進骨細胞和成骨細胞凋亡，這可能是導致股骨頭發生壞死的重要因素之一[5]。本研究中，B、C組TUNEL染色顯示了明顯的細胞凋亡表現，提示股骨頭壞死發病過程中，細胞凋亡機制存在并產生一定作用。
Wnt/β-catenin信號通路在多細胞動物中廣泛存在，是一條非常保守的信號通路，參與了機體組織動態平衡的維持以及胚胎形成中許多發育過程，同時還能調控一些凋亡因子與抗凋亡因子。Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因主要有c-Myc、cyclin D1基因等[6-7]。Wnt蛋白的主要受體為卷曲蛋白（frizzled，Frz），是一種7次跨膜的受體蛋白，另外還存在一個輔助受體，即低密度脂蛋白受體相關蛋白（lowdensity lipoprotein receptor related protein，LRP）。上述受體與骨密度變化相關，敲除LRP5基因的小鼠骨質會減少，而過度表達LRP5可以增加骨量、減少成骨細胞的凋亡[21]。Wnt/β-catenin信號通路未被抑制時，Wnt能與Frz、LPR5/6結合，進而使β-catenin降解復合物的形成受到抑制，保持β-catenin細胞質濃度在較高水平，促使一部分β-catenin能夠順利轉入細胞核內，與TCF/LEF形成復合體，介導相關基因如Bcl-2、c-Myc、cyclin D1等的表達，抑制細胞凋亡，促進細胞增殖和活化[7]。Wnt不表達或其作用被拮抗劑抑制時，本被抑制的β-catenin降解復合物將被激活，使細胞質內的β-catenin發生降解，細胞凋亡增加。本研究結果顯示，隨時間延長B組活性β-catenin、c-Myc表達逐漸降低，各時間點均顯著低于A組。B組Wnt/β-catenin 信號通路相關信號分子表達異常，提示異常的Wnt/β-catenin 信號通路參與了早期股骨頭壞死的發生。
Wnt/β-catenin信號通路存在許多拮抗分子對其進行負性調節，本實驗使用的SFRP1是目前可以商業化購買的Wnt/β-catenin信號通路的細胞外拮抗分子。 SFRP蛋白屬于分泌性糖蛋白家族，位于染色體8p12-11.1[22-23]。SFRP 受體可以競爭性或直接抑制Wnt 蛋白，從而阻斷Wnt表達。腫瘤學研究表明，SFRP1表觀遺傳學的改變以及表達下調會導致Wnt信號轉導途徑失調，進而誘發腫瘤（如乳腺癌、前列腺癌、結腸癌和肝癌等）發生[24]。研究表明，SFRP1對Wnt/β-catenin信號通路的負性調節可以導致骨細胞凋亡，骨量丟失，介導骨質疏松發病過程[25-27]，敲除L RP1基因小鼠會出現明顯的骨密度增加及骨形成活躍，同時會加速骨折愈合[28-31]。本研究使用SFRP1作為Wnt通路抑制劑，干預C組模型動物，結果提示C組空骨陷窩率、細胞凋亡率均高于B組，骨壞死以及骨細胞凋亡程度更高；同時C組活性β-catenin、c-Myc表達較B組更低，信號通路表達異常與骨壞死發生增加具有一定相關性。上述結果提示，SFRP1對Wnt/β-catenin 信號通路起到了抑制作用，加劇了股骨頭壞死的發生。
通過本實驗我們發現在SANFH中存在著細胞凋亡現象，激素的使用造成骨壞死，導致了更多的細胞凋亡，且引起了Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵蛋白β-catenin、c-Myc的表達降低。在使用SFRP1將Wnt/β-catenin信號通路阻斷時，β-catenin、c-Myc的表達進一步下降，且出現了更多的細胞凋亡和更嚴重的骨壞死。提示Wnt/β-catenin信號通路的異常參與了SANFH早期病變，作用機制可能與其調控c-Myc的表達，導致骨細胞凋亡有關。然而，激素影響Wnt/β-catenin信號通路的具體機制、其他類型的股骨頭缺血性壞死中是否也存在Wnt/β-catenin信號通路的異常，以及SFRP1是否通過其他通路導致骨壞死，還有待進一步實驗研究。
研究表明，激素性股骨頭缺血性壞死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）與成骨細胞和骨細胞的凋亡存在密切關系[1-4]。糖皮質激素促進骨細胞和成骨細胞凋亡，可能是導致SANFH發生的重要因素之一[5]。Wnt/β-catenin信號通路在多細胞動物中廣泛存在，參與調控一些凋亡因子與抗凋亡因子，即Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因，主要有c-Myc、cyclin D1基因等[6-7]。研究表明，Wnt信號通路參與了骨質形成[8]以及BMSCs分化[9-14]。目前共發現了5種Wnt/β-catenin信號通路的胞外拮抗分子，分泌型卷曲相關蛋白（secreted frizzled related proteins，SFRPs）是其中一種，由SFRP1～SFRP5組成，SFRP1能與受體競爭結合Wnt蛋白，有效阻斷Wnt信號通路[15]。本實驗應用SFRP1作為Wnt/β-catenin信號通路的阻斷劑，探討Wnt/β-catenin信號通路在SANFH中的作用以及在應用SFRP1之后骨壞死程度的改變，為SANFH的診治研究提供新的理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑
12月齡清潔級雄性SD大鼠72只，體質量200～230 g，由西安交通大學實驗動物中心提供，實驗前適應性喂養1周。脂多糖、人重組SFRP1蛋白、免疫組織化學檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒（Sigma公司，美國）；甲潑尼龍（Pfizer公司，美國）；氨芐青霉素（Genview公司，美國）；TUNEL凋亡試劑盒（Promega公司，美國）；兔抗鼠β-catenin、c-Myc抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（Santa Cruz公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
采用隨機數字表法將72只SD大鼠分為3組（n=24），分別為對照組（A組）、模型組（B組）和干預組（C組）。B、C組大鼠采用脂多糖聯合甲潑尼龍法制備SANFH模型[16-18]。具體方法：經尾靜脈注射脂多糖（10 μg/L），共3次，每次間隔24 h；脂多糖注射結束后開始肌肉注射甲潑尼龍（20 mg/kg），共7 次，每次間隔24 h。B組僅制備SANFH模型；C組在第1次注射甲潑尼龍時，開始在激素注射對側肢體肌肉注射人重組SFRP1蛋白[1 μg/（kg·d）]，持續30?d[19]。A組于B組各注射時間點同法給予等量生理鹽水。為防止感染發生，于第1次注射甲潑尼龍開始，每天肌肉注射10萬U青霉素，連續7 d；之后按照相等劑量每周注射2次。實驗期間動物均分籠飼養。于末次注射甲潑尼龍后2、4、8 周，各組隨機取8只動物，采取脊椎脫臼法處死，切取雙側股骨頭標本進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察B、C組動物造模期間以及造模后存活、飲食、活動等情況。
1.3.2 組織學觀察
取左側股骨頭PBS沖洗后，置于4%多聚甲醛固定3 d，EDTA緩沖液脫鈣，每2天更換1次脫鈣液，觀察骨標本表面顏色，應用物理法檢測脫鈣程度。待組織脫鈣完全后，逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，片厚 5 μm。取部分切片行HE染色，鏡下觀察骨髓細胞以及骨髓內脂肪細胞，骨小梁以及骨細胞。每個樣本取3張切片，于200倍鏡下隨機取10個視野，計數空骨陷窩以及總骨陷窩，并按照以下公式計算空骨陷窩率。空骨陷窩率=空骨陷窩數/總骨陷窩數×100%。取均值。
1.3.3 細胞凋亡染色觀察
取部分切片根據TUNEL凋亡試劑盒說明進行染色，鏡下觀察骨細胞中細胞核染色為棕黃色者為陽性細胞。每個樣本取3 張切片，于200倍鏡下隨機取10個視野，計數陽性細胞以及總細胞，并按照以下公式計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=陽性細胞數/總細胞數×100%。取均值。
1.3.4 免疫組織化學染色
取部分切片按照SP法行免疫組織化學染色，觀測股骨頭組織中活性β-catenin、c-Myc表達。鏡下觀察細胞膜、細胞質及細胞外基質中出現棕黃色反應產物判定為陽性。照相后采用FR-200紫外與可見光分析裝置圖像分析系統測量圖像積分吸光度（IA）值，作為活性β-catenin、c-Myc表達量。
1.3.5 Western blot 檢測
取右側股骨頭低溫研磨，應用RIPA裂解液低溫提取總蛋白，BCA法測定總蛋白量。經制膠、電泳、轉膜、封閉后，一抗孵育過夜，二抗孵育。取出聚偏氟乙烯膜，化學發光法獲得膠片后進行圖像采集，目標條帶A值采用 Quantity One 凝膠圖像軟件分析，以目標條帶與β-actin條帶 A值的比值作為活性β-catenin、c-Myc相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
B、C組造模期間共6只動物死亡，3只于注射脂多糖當天死于脂多糖引起的機體急性反應；另3 只分別于末次注射甲潑尼龍后第6、8、9天因感染死亡。同法對動物進行補充。其余動物均存活至實驗完成。
注射脂多糖第1、2天B、C組動物出現寒顫、蜷縮，飲食、活動均減少，精神較差；注射甲潑尼龍1周后，各組動物活動、飲食恢復正常，四肢負重未見明顯異常；6周后B、C組動物均出現輕度跛行，其余情況正常。
2.2 組織學觀察
A組：各時間點骨小梁結構正常，未見紊亂或斷裂，未發現空骨陷窩，其中骨陷窩中骨細胞大小、形態均正常，髓腔內造血組織與脂肪組織未見明顯變性或壞死。B組：2周時骨小梁出現骨質紊亂，并有部分小梁發生斷裂，骨小梁中出現少量空骨陷窩，髓腔內脂肪細胞體積增大，部分融合；4周時空骨陷窩較2周時明顯增多，骨髓腔內脂肪細胞增大、增多；8 周時出現壞死骨，骨小梁嚴重破壞，大量空骨陷窩，骨髓腔內正常造血組織消失。C組：2周時骨組織破壞程度較B組2周時更嚴重，骨小梁更紊亂，出現少量空骨陷窩；4周時可見較多空骨陷窩，髓腔內造血細胞減少以及脂肪細胞增大、增多；8周時出現嚴重骨壞死形成，髓腔內造血組織完全消失，并有大量空骨陷窩。見圖 1。各時間點C組空骨陷窩率均高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
圖1
各時間點各組組織學觀察（HE×200） 從左至右分別為A、B、C組 ? 2周 ? 4周 ? 8周 圖 2 各時間點各組TUNEL染色觀察（×200） 從左至右分別為A、B、C組 ? 2周 ? 4周 ? 8周
Figure1.
Histological observation in every group at each time point (HE×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ? At 2?weeks ? At 4 weeks ? At 8 weeks Fig.2 TUNEL staining in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ? At 2 weeks ? At 4 weeks ? At 8 weeks
表1
各時間點各組空骨陷窩率及細胞凋亡率比較（n=8，%，2.3 細胞凋亡染色觀察
A組各時間點未見凋亡細胞異常增多，B、C組隨時間延長凋亡細胞均逐漸增多（圖 2）。各時間點C組細胞凋亡率均高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
2.4 免疫組織化學染色觀察
隨時間延長，A組活性β-catenin、c-Myc表達未見顯著變化，B、C組活性β-catenin、c-Myc表達逐漸降低（圖 3、4）。各時間點C組活性β-catenin及c-Myc表達水平均低于A、B組，B組低于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 5、6。
圖3
各時間點各組活性β-catenin免疫組織化學染色觀察（×200） 從左至右分別為A、B、C組 ? 2周 ? 4周 ? 8周 圖 4 各時間點各組活性c-Myc免疫組織化學染色觀察（×200） 從左至右分別為A、B、C組 ? 2周 ? 4周 ? 8周
Figure3.
Immunohistochemical staining of activated β-catenin in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ? At 2 weeks ? At 4 weeks ? At 8 weeks Fig. 4 Immunohistochemical staining of activated c-Myc in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ? At 2 weeks ? At 4 weeks ? At 8 weeks
圖5
免疫組織化學染色檢測各時間點各組活性β-catenin表達量 圖 6 免疫組織化學染色檢測各時間點各組活性c-Myc表達量 圖 7 Western blot檢測各時間點各組活性β-catenin、c-Myc表達 1：A組 2：B組 3：C組 ? 2周 ? 4周 ? 8周 圖 8 各時間點各組活性β-catenin 相對表達量 圖 9 各時間點各組活性c-Myc 相對表達量
Figure5.
Comparison of expression of activated β-catenin between groups at each time point by immunohistochemical staining Fig. 6 Comparison of expression of activated c-Myc between groups at each time point by immunohistochemical staining Fig. 7 Expression of activated β-catenin and c-Myc in every group at each time point by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C ? At 2 weeks ? At 4 weeks ? At 8?weeks Fig. 8 Comparison of relative expression of activated β-catenin between groups at each time point Fig. 9 Comparison of relative expression of activated c-Myc between groups at each time point
2.5 Western blot 檢測
各時間點，A組均見活性β-catenin、c-Myc表達，且表達程度無明顯變化；B、C組隨時間延長活性β-catenin、c-Myc表達逐漸降低（圖 7）。各時間點C組活性β-catenin、c-Myc相對表達量均明顯低于A、B組，B組低于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05) 。見圖 8、9。
3 討論
目前，SANFH的發生機制尚未闡明，由此產生了相關學說，比如脂肪栓塞學說、血管內凝血學說、骨內高壓理論學說、骨質疏松學說、免疫因素紊亂學說等。Weinstein等[20]發現由激素所致的股骨頭壞死組織切片中出現了大量骨細胞凋亡，而其他因素所致的股骨頭壞死切片中未見或少見凋亡骨細胞。激素具有使細胞凋亡的潛在誘導作用，能促進骨細胞和成骨細胞凋亡，這可能是導致股骨頭發生壞死的重要因素之一[5]。本研究中，B、C組TUNEL染色顯示了明顯的細胞凋亡表現，提示股骨頭壞死發病過程中，細胞凋亡機制存在并產生一定作用。
Wnt/β-catenin信號通路在多細胞動物中廣泛存在，是一條非常保守的信號通路，參與了機體組織動態平衡的維持以及胚胎形成中許多發育過程，同時還能調控一些凋亡因子與抗凋亡因子。Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因主要有c-Myc、cyclin D1基因等[6-7]。Wnt蛋白的主要受體為卷曲蛋白（frizzled，Frz），是一種7次跨膜的受體蛋白，另外還存在一個輔助受體，即低密度脂蛋白受體相關蛋白（lowdensity lipoprotein receptor related protein，LRP）。上述受體與骨密度變化相關，敲除LRP5基因的小鼠骨質會減少，而過度表達LRP5可以增加骨量、減少成骨細胞的凋亡[21]。Wnt/β-catenin信號通路未被抑制時，Wnt能與Frz、LPR5/6結合，進而使β-catenin降解復合物的形成受到抑制，保持β-catenin細胞質濃度在較高水平，促使一部分β-catenin能夠順利轉入細胞核內，與TCF/LEF形成復合體，介導相關基因如Bcl-2、c-Myc、cyclin D1等的表達，抑制細胞凋亡，促進細胞增殖和活化[7]。Wnt不表達或其作用被拮抗劑抑制時，本被抑制的β-catenin降解復合物將被激活，使細胞質內的β-catenin發生降解，細胞凋亡增加。本研究結果顯示，隨時間延長B組活性β-catenin、c-Myc表達逐漸降低，各時間點均顯著低于A組。B組Wnt/β-catenin 信號通路相關信號分子表達異常，提示異常的Wnt/β-catenin 信號通路參與了早期股骨頭壞死的發生。
Wnt/β-catenin信號通路存在許多拮抗分子對其進行負性調節，本實驗使用的SFRP1是目前可以商業化購買的Wnt/β-catenin信號通路的細胞外拮抗分子。 SFRP蛋白屬于分泌性糖蛋白家族，位于染色體8p12-11.1[22-23]。SFRP 受體可以競爭性或直接抑制Wnt 蛋白，從而阻斷Wnt表達。腫瘤學研究表明，SFRP1表觀遺傳學的改變以及表達下調會導致Wnt信號轉導途徑失調，進而誘發腫瘤（如乳腺癌、前列腺癌、結腸癌和肝癌等）發生[24]。研究表明，SFRP1對Wnt/β-catenin信號通路的負性調節可以導致骨細胞凋亡，骨量丟失，介導骨質疏松發病過程[25-27]，敲除L RP1基因小鼠會出現明顯的骨密度增加及骨形成活躍，同時會加速骨折愈合[28-31]。本研究使用SFRP1作為Wnt通路抑制劑，干預C組模型動物，結果提示C組空骨陷窩率、細胞凋亡率均高于B組，骨壞死以及骨細胞凋亡程度更高；同時C組活性β-catenin、c-Myc表達較B組更低，信號通路表達異常與骨壞死發生增加具有一定相關性。上述結果提示，SFRP1對Wnt/β-catenin 信號通路起到了抑制作用，加劇了股骨頭壞死的發生。
通過本實驗我們發現在SANFH中存在著細胞凋亡現象，激素的使用造成骨壞死，導致了更多的細胞凋亡，且引起了Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵蛋白β-catenin、c-Myc的表達降低。在使用SFRP1將Wnt/β-catenin信號通路阻斷時，β-catenin、c-Myc的表達進一步下降，且出現了更多的細胞凋亡和更嚴重的骨壞死。提示Wnt/β-catenin信號通路的異常參與了SANFH早期病變，作用機制可能與其調控c-Myc的表達，導致骨細胞凋亡有關。然而，激素影響Wnt/β-catenin信號通路的具體機制、其他類型的股骨頭缺血性壞死中是否也存在Wnt/β-catenin信號通路的異常，以及SFRP1是否通過其他通路導致骨壞死，還有待進一步實驗研究。
