引用本文： 劉龍剛, 伍耀宏, 陶暉, 賈治偉, 李小川, 王德利, 何勍, 阮狄克. 修飾有BMP-7功能片段的功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠RADKPS制備及其生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(4): 491-498. doi: 10.7507/1002-1892.20160098 復制
近年來，組織工程技術為退變椎間盤的修復再生提供了新的臨床思路。支架材料與生長因子是組織工程方法的兩個必備因素，越來越多研究試圖將生長因子直接復合于支架材料上，以實現生物材料的功能化；但大多數方法僅僅通過物理或化學方法將細胞因子復合于支架材料表面，存在半衰期短等問題。RADA16-Ⅰ是一種新型自組裝多肽材料，具有良好的生物相容性[1-3]，其C末端可通過化學鍵結合具有細胞因子生物學活性的短肽片段，使材料具備生物學活性的同時延長細胞因子活性片段的作用時間[1]。大量研究顯示[4-6]，BMP-7于體內外條件下均可促進髓核組織蛋白多糖和Ⅱ型膠原合成，注射后還可改善新西蘭大白兔椎間盤內的含水量、增加椎間盤高度，從而修復椎間盤退變。本研究利用RADA16-Ⅰ通過化學鍵作用于其C末端復合BMP-7活性短肽片段（KPSSAPTQLN），成功制備了功能化自組裝多肽RADA-KPSS。RADA-KPSS對 RADA16-ⅠC末端的延長會降低自組裝多肽RADA16-Ⅰ固有的凝膠性，但當RADA-KPSS與RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合形成新的功能化自組裝多肽RADKPS后，又可恢復原有的水凝膠特性[7]。本課題組前期體外實驗結果顯示，新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料RADKPS有良好的成膠能力，且在體外對人退變髓核細胞的細胞活性、細胞增殖、分泌等具有明顯促進作用[7]。理想的生物材料必須首先具備良好的生物相容性[8]，才能安全用于體內研究；故本實驗進一步評價其生物相容性，為RADKPS用于退變椎間盤修復再生領域的進一步體內研究提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6 ～ 8 周齡健康昆明種小鼠 36只，雌雄各半，體質量17 ～ 23 g；3月齡新西蘭大白兔1只，體質量2.5 kg；6月齡新西蘭大白兔10只，雌雄各半，體質量2.8～3.1kg；均由中國人民解放軍海軍總醫院實驗動物中心提供。
RADA16-Ⅰ（氨基酸序列：ACN-RADARADARADARADA-CONH2）與RADA-KPSS（氨基酸序列：ACN-RADARADARADARADAGGKPSSAPT-QLN-CONH）多肽粉末各100 mg（利用固相合成法合成，純度>90%；上海生工生物工程有限公司）；兔淋巴細胞分離液（1.073×103 g/L；天津灝洋生物科技有限公司）；MTT、DMSO、青霉素、鏈霉素、PBS緩沖液（Sigma 公司，美國）；L-DMEM培養基、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；FBS（杭州四季青生物制品有限公司）。XFluor4酶標儀 （TECAN 公司，奧地利）；4300-S掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；Heraeus CO2 培養箱（Thermo公司，日本）；IME-Ⅱ倒置相差顯微鏡、IX71倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；SPM9600原子力學顯微鏡（島津公司，日本）；培養瓶、培養板（Corning公司，美國）；Hamilton微量注射器（北京博朗寧科技有限公司）。
1.2 RADKPS制備及其性能檢測
1.2.1 RADKPS的制備及成膠
將RADA16-Ⅰ和RADA-KPSS多肽粉末分別與10%蔗糖溶液配制成濃度為1%（m/v）的多肽溶液，4℃超聲振蕩30min以使多肽粉末充分溶解；然后將1%RADA16-Ⅰ溶液和1%RADA-KPSS溶液等體積混合形成1%RAD KPS；用孔徑為0.22 μm的一次性無菌注射式過濾膜消毒后置于4℃保存，備用。分別將3枚Transwell小室置于24孔培養板內，移液槍吸取備好的1%RADA16-Ⅰ、1%RADA-KPSS、1%RADKPS各100 μL分別移入3枚Transwell小室，然后分別向各Transwell小室中緩慢滴加L-DMEM并觀察各組成膠情況。
1.2.2 原子力學顯微鏡觀察
吸取5 μL 稀釋至0.01%（m/v）的RADKPS滴在新鮮的云母片上，靜置25～30 s后用100 μL PBS液輕輕沖洗，空氣中晾干后室溫放置3～4 h。用原子力顯微鏡釆用硅掃描探針接觸模式觀察RADKPS自組裝纖維形貌，掃描區域1 μm×1 μm，掃描頻率1.00 Hz；再以SPM-9700圖像分析軟件對RADKPS的自組裝纖維直徑和長度進行定量分析。
1.3 RADKPS細胞相容性實驗
1.3.1 兔BMSCs分離培養
取3月齡新西蘭大白兔以氯胺酮+速眠新0.5 mL肌肉注射麻醉后，于脛骨平臺下方穿刺抽取約3 mL骨髓，迅速置入預裝有2 mL肝素鈉的15 mL離心管，搖晃混勻，采用密度梯度離心聯合貼壁法分離培養兔BMSCs。等體積 PBS 混勻骨髓血，緩慢置于2倍體積淋巴細胞分離液上，以離心半徑10 cm、2 000 r/min離心20 min；吸取中間白膜層骨髓單個核細胞，PBS離心洗滌（6mL PBS混懸細胞以離心半徑10 cm、1 500 r/min 離心5min，棄上清）2遍后計數，以5 mL含20%FBS、1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的L-DMEM培養液重懸細胞，按1×106個/cm2密度接種于25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中行原代培養。48 h后換液，PBS沖洗3次棄去未貼壁細胞，此后每 2～3 天換液1次，待原代培養細胞達80%融合時行胰蛋白酶消化傳代培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，并取第3代細胞進行以下實驗。
1.3.2 細胞-支架復合物制備
將Transwell小室置于每孔加入400 μL 10%FBS、1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的L-DMEM培養液的24孔培養板內。用10%蔗糖溶液重懸第3代BMSCs制備濃度為2.5×106 個/mL的細胞懸液，取20 μL細胞懸液與100μL 1%RADKPS溶液迅速混勻，立即移入Transwell小室，向其表面緩慢滴加400 μL含10%FBS、1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的L-DMEM培養液，置入37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內孵育10 min；然后緩慢更換培養孔和水凝膠表面的培養基，再置入37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內孵育30 min；之后每30分鐘緩慢更換培養孔及水凝膠表面的培養液，至少更換2次以緩沖多肽水凝膠內的pH值。
1.3.3 掃描電鏡觀察
取培養12 h及7 d的細胞-支架復合物，2.5%戊二醛固定后，經20%、50%、70%、90%乙醇梯度脫水各15 min，無水乙醇脫水3 次，空氣中干燥24 h，噴金處理，掃描電鏡下觀察。
1.3.4 細胞活性染色觀察
取培養12 h及7 d的細胞-支架復合物，PBS沖洗3 min×3次，避光置于熒光素二乙酸鹽/碘化丙啶（fluorescein diacetate/propidium iodide，FDA/PI；FDA濃度為5 mg/mL，PI為2 mg/ mL）溶液，37℃下孵育5 min，PBS沖洗3min×3 次，IX71倒置熒光顯微鏡下觀察，100倍視野下每組隨機選取6個視野分別計數死、活細胞數量，計算細胞活性。
1.3.5 MTT檢測
取生長狀態良好的第3代BM SCs，0.25%胰蛋白酶消化后，制成濃度為1×104 個 / mL的細胞懸液，接種于96 孔板培養（100μL/孔）；培養 24 h 后，各孔分別再加入 100 μL濃度為0.1%、0.05%、0.025%的RADKPS溶液（分別為實驗組1、2、3），含10%FBS的L-DMEM培養液（陰性對照組）和10%無菌蔗糖溶液（空白對照組），每組設5個復孔。每2天換液1次，分別培養8 h及1、3、5、7 d，每孔加入20 μL MTT、5 mg/mL PBS液，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養4 h后棄上清，每孔加入 150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀于570nm 處測吸光度（A）值，按以下公式計算相對增殖度（relative growth rate，RGR）：實驗組A值/陰性對照組A值×100%。
1.3.6 兔離體椎間盤器官髓核內細胞活性觀察
取6月齡新西蘭大白兔10只，氯胺酮+速眠新0.5 mL肌肉注射麻醉后，6 000 U肝素鈉靜脈注射抗血栓。無菌條件下手術分離脊柱并獲取椎間盤，盡可能剃去椎間盤兩側骨性終板，并剔除椎間盤的前后縱韌帶及外層纖維環，生理鹽水反復高壓沖洗3遍。選取處理好的椎間盤，以10 mL注射器從椎間盤后外45°穿刺至髓核中心位置，維持10 mL負壓抽吸15 s，隨后于對側后外45°以微量注射器注入25 μL 1%RADKPS多肽溶液作為實驗組，未注射多肽椎間盤設為空白對照組（每組3枚椎間盤）。超凈臺無菌條件下，以含1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的PBS液沖洗椎間盤器官2遍后，兩組分別置入有10 mL含10%FBS、1%雙抗（青霉素/鏈霉素）L-DMEM培養液的25 cm2透氣培養瓶，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中豎立培養瓶培養。1、3、7 d后取出髓核，避光條件下置于配備好的0.5%FDA/0.2%PI染液，并于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中孵育5 min后，以PBS液反復沖洗髓核組織2 min。IX71倒置熒光顯微鏡下觀察。于100倍視野下每枚椎間盤隨機選取2個視野分別計數死、活細胞數量，計算細胞活性。
1.4 RADKPS血液相容性實驗
根據ISO 10993.4[9]標準及文獻[10-11]方法進行功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠RADKPS溶液血液相容性檢測。取兔肝素抗凝靜脈血10 mL，按血∶生理鹽水為4∶5的比例稀釋；向各試管分別加入0.1%（A組）、0.05%（B組）、0.025%（C組）RADKPS溶液及10%蔗糖溶液（D組）、生理鹽水（E組，陰性對照）、蒸餾水（F組，陽性對照）各5 mL，再向各管中加入稀釋后的全血0.1 mL，37℃水浴保溫60 min；然后以離心半徑10 cm、3 000 r/min離心5min，取上清液于波長545 nm處測定各管A值，按以下公式計算相對溶血率：（樣本A值－陰性對照A值）/（陽性對照A值－陰性對照A值） ×100%，實驗重復 3 次，取均值。相對溶血率<5%為不發生溶血，符合醫用生物材料的溶血實驗要求。
1.5 RADKPS組織相容性實驗
取6～8周齡健康昆明小鼠36只，5%水合氯醛100 μL麻醉，于雙側脊柱旁1 cm、頭端距髖關節1cm處以微量注射器分別注射1%RADKPS溶液0.1mL，注射完畢后針頭滯留30 s后緩慢拔出。常規飼養7、14、28 d觀察小鼠存活情況及注射局部有無水皰、紅斑及焦痂形成；各時間點分別處死12只小鼠，取出未完全降解的支架材料及部分周圍組織，經固定、石蠟包埋、切片后行HE染色，倒置顯微鏡下觀察支架降解情況及局部炎性反應情況。
1.6 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RADKPS支架性能觀察
在Transwell小室中緩慢滴加L-DMEM后，單純RADA16-Ⅰ多肽溶液和RADKPS多肽溶液從底部開始逐漸變成水凝膠狀，5 min后小室內的多肽溶液均呈水凝膠狀，從小室中取出后可見均勻透明、光亮的水凝膠圓柱體；而單純RADA-KPSS多肽溶液成膠能力較前二者差。見圖 1。原子力學顯微鏡示RADKPS自組裝納米纖維相互連接呈三維網狀結構，纖維直徑（25.68±4.62）nm，纖維長度（512.42±32.22）nm。見圖 2。
圖1
功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架大體觀察 ? 單純RADA-KPSS ? 單純RADA16-Ⅰ ? RADKPS 圖 2 RADKPS原子力學顯微鏡觀察（×50 k） 圖 3 第3代兔BMSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡 ×100） 圖 4 細胞-支架復合物培養不同時間點掃描電鏡觀察（×1 000） 箭頭示支架內附著的 BMSCs ? 12 h ? 7 d 圖 5 細胞-支架復合物培養不同時間點FDA/PI染色觀察細胞活性 ? 12 h（倒置熒光顯微鏡×100） ? 7 d（倒置熒光顯微鏡×40） 圖 6 MTT檢測各組培養各時間點細胞增殖情況 圖 7 兔離體椎間盤器官培養各時間點髓核細胞活性觀察 ? 實驗組1 d（倒置熒光顯微鏡×40） ? 空白對照組1 d（倒置熒光顯微鏡×40） ? 實驗組3 d（倒置熒光顯微鏡×100） ? 空白對照組3 d（倒置熒光顯微鏡×100） ? 實驗組7 d（倒置熒光顯微鏡×100） ? 空白對照組7 d（倒置熒光顯微鏡×100）
Figure1.
General observation of the functional self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold ? RADA-KPSS ? RADA16-I ? RADKPS Fig. 2 Atomic force microscopy image of RADKPS (×50 k) Fig. 3 Morphologic observation of the 3rd generation rabbit BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) Fig. 4 Scanning electron microscope observation of BMSCs-RADKPS scaffold composite at each time point (×1 000) Arrow indicated BMSCs which tightly attached to RADKPS ? At 12 hours ? At 7 days Fig. 5 Cellular activity observation of BMSCs-RADKPS scaffold composite at each time point after cultured through fluorescein diacetate/propidium iodide staining ? At 12 hours (Inverted fluorescence microscope×100) ? At 7 days (Inverted fluorescence microscope×40) Fig. 6 Cell proliferation by MTT in each group at each time point Fig. 7 Cellular activity observation of nucleus pulposus cells from isolated rabbit intervertebral disc organs cultured at each time point ? Experimental group at 1 day (Inverted fluorescence microscope×40) ? Blank control group at 1day (Inverted fluorescence microscope×40) ? Experimental group at 3 days (Inverted fluorescence microscope×100) ? Blank control group at 3 days (Inverted fluorescence microscope×100) ? Experimental group at 7 days (Inverted fluorescence microscope×100) ? Blank control group at 7days (Inverted fluorescence microscope×100)
2.2 RADKPS細胞相容性實驗
①倒置相差顯微鏡觀察示，第3代新西蘭大白兔BMSCs呈長梭形，漩渦樣生長（圖 3）。②掃描電鏡觀察示，細胞-支架復合物培養12 h，BMSCs呈球形黏附于支架材料內；7 d，支架材料內可見大量BMSCs，細胞伸出大量偽足與支架材料的納米纖維緊緊黏附，其形態呈現三維立體結構，表面可見大量類細胞外基質樣分泌物。見圖 4。③細胞活性染色示，細胞-支架復合物培養12 h及7 d，細胞活性分別為93.3%±1.6%和91.2%±1.9%，7 d時細胞數量顯著多于12 h時，但細胞活性低于12h時，比較差異有統計學意義（t=4.706，P=0.001）。見圖 5。④MTT檢測示，實驗組1、2、3的RGR分別為115.0%±1.1%、105.3%±1.6%、102.9%±0.9%，BMSCs增殖能力隨多肽溶液濃度增加呈遞增趨勢，但差異無統計學意義（F=3.146，P=0.112）。見圖 6。⑤兔離體椎間盤器官培養過程中，實驗組與空白對照組椎間盤內髓核細胞活性均在85%以上。培養1、3 d，實驗組與空白對照組椎間盤內髓核細胞活性比較差異無統計學意義（P>0.05）；7 d時實驗組細胞活性明顯高于空白對照組，差異有統計學意義（t=4.287，P=0.006）。見表 1、圖 7。
表1
兩組兔離體椎間盤器官培養各時間點髓核細胞活性比較（n=36，%，2.3 RADKPS血液相容性實驗
A、B、C、D、E組可見紅細胞沉積，上層液體顏色接近無色；F組未見紅細胞沉積，上層液體顏色為紅色。A、B、C組相對溶血率分別為3.6%、0.8%、0.6%，均<5%，符合醫用生物材料的溶血實驗要求。
2.4 RADKPS組織相容性實驗
所有小鼠注射區皮膚無明顯水皰、紅斑及焦痂形成；飼養24 h內無發熱、驚厥、死亡現象。注射局部皮膚取材后可見10 d內皮下呈明顯隆起，后隆起逐漸扁平，28 d時局部隆起基本消失。見圖 8。
圖8
小鼠皮下注射RADKPS溶液后各時間點大體觀察 ? 7 d ? 14 d ? 28 d 圖 9 小鼠皮下注射RADKPS溶液后各時間點HE染色觀察 ? 7 d（×40） ? 7 d （×100） ? 7 d （×200） ? 14 d（×40） ? 14 d（×100） ? 14 d（×200） ? 28 d（×40） ? 28 d（×100） ? 28d（×200）
Figure8.
General observation at each time point after subcutaneous implantation ? At 7 days ? At 14 days ? At 28 days Fig. 9 HE staining observation at each time point after subcutaneous implantation ? At 7 days (×40) ? At 7 days (×100) ? At 7 days (×200) ? At 14 days (×40) ? At 14 days (×100) ? At 14 days (×200) ? At 28 days (×40) ? At 28 days (×100) ? At 28 days (×200)
HE染色示，RADKPS溶液植入部位皮膚層次清晰，結構正常。植入7 d，水凝膠于皮下形成均勻的網格狀支架結構，有少量中性粒細胞浸潤；14 d，較多成纖維細胞長入并伴支架周圍部分降解；28 d，支架結構進一步降解，局部被正常纖維組織替代，以成纖維細胞和單核細胞浸潤為主。見圖 9。
3 討論
自組裝多肽納米纖維RADA16-Ⅰ具有含水量高（可達99%）、可注射、良好的生物相容性及可于體內自組裝成與細胞外基質結構相似的納米纖維支架等特征[12-14]，因此被認為是一種理想的組織工程生物支架材料。RADA16-Ⅰ的C末端可通過化學鍵插入短肽活性片段，使該多肽納米材料具有生物學活性。目前各種短肽活性片段修飾的RADA16-Ⅰ已在神經、軟骨、血管、心肌再生修復中應用，并獲得了滿意效果[3, 13, 15-16]。BMP-7是目前為止促進髓核細胞分泌蛋白多糖能力最強的生長因子之一[17-18]。Chen等[19]研究發現BMP-7具有3個功能活性片段——KPSS、SNVI、KAIS。本課題組前期研究結果表明，載有活性片段KPSS的功能化自組裝多肽RADA-KPSS較載有活性片段SNVI、KAIS的功能化自組裝多肽RADA-SNVI、RADA-KAIS更能促進人髓核細胞增殖、遷移及表達細胞外基質成分（Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX-9）[20]。但單純的RADA-KPSS成膠性能較差，而將RADA-KPSS與RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合后不但能夠明顯改善成膠性能，同時在體外條件下可顯著促進人退變髓核細胞增殖及Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX-9基因的表達[7]。故將RADA-KPSS與RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合制成的新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料RADKPS，可能為髓核組織工程內源性修復提供更優良的材 料。
本研究結果顯示，原子力顯微鏡觀察RADKPS支架材料具備納米級的纖維直徑以及孔徑結構，可為細胞提供良好的三維環境。理想的髓核組織工程支架復合材料應具有良好的生物相容性，以確保臨床應用的安全性。細胞相容性包括細胞在支架上的黏附、活性，以及不同濃度多肽支架溶液對細胞增殖的影響。掃描電鏡結果示，細胞在接種12 h時開始黏附，呈球狀，無偽足伸出；7 d時細胞已經展開，呈卵圓形，其表面附著大量顆粒，表明細胞已開始分泌細胞外基質，并與鄰近細胞多平面立體接觸。細胞活性染色結果示，細胞在接種12 h及7 d后活性均良好，表明多肽水凝膠成膠過程未產生具有明顯細胞毒性的物質。細胞增殖實驗結果示，兔BMSCs在不同濃度RADKPS溶液中生長良好，且數量均多于單純10%FBS培養液組，但無統計學差異，這可能是由于實驗組RADKPS溶液濃度均較低而不能形成三維孔隙結構，不能發揮支架材料三維培養細胞的優勢。而支架材料中復合的KPSS片段發揮了BMP-7的促細胞增殖效應，側面說明了該功能片段的有效 性。
多種離體椎間盤器官模型已被成功用于椎間盤早期退變及生物力學等研究[21-23]，本實驗選擇新西蘭大白兔離體椎間盤器官培養模型，能夠維持椎間盤內髓核細胞所固有的低氧、高滲和低pH環境，減少培養條件的變化對椎間盤髓核內細胞的影響，而反映RADKPS對髓核內細胞的作用。通過肝素化、盡可能修除骨性終板、剔去前后縱韌帶及外層纖維環，盡可能保證了椎間盤器官營養通道的通暢；以微量注射器注射方法有效防止了注入水凝膠材料的泄露，并盡可能降低對髓核內細胞的損傷。通過7 d的培養可定性觀察到注射組離體椎間盤器官內髓核細胞活性高于空白對照組。說明該新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠RADKPS對椎間盤器官內的髓核細胞無毒性反應。
支架本身或其在體內降解后產生的代謝產物不可避免地會進入血液循環中，有產生溶血副作用的風險，本研究溶血實驗結果顯示，不同濃度RADKPS溶液相對溶血率均<5%，完全符合醫用材料對溶血實驗的要求。
支架植入小鼠皮下觀察主要是評價其局部炎性反應以及降解速度情況。組織學結果顯示在14 d內以少量中性粒細胞浸潤為主，28 d時以成纖維細胞浸潤為主，成纖維細胞分泌大量膠原纖維，已逐步取代原支架結構，表明支架的降解速度符合人體內新生組織再生長入的速度，具有良好的組織相容性。
綜上述，修飾有BMP-7功能片段的新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠RADKPS具有良好的細胞相容性、血液相容性及組織相容性，為進一步動物實驗驗證其修復椎間盤的作用奠定了實驗基礎。
近年來，組織工程技術為退變椎間盤的修復再生提供了新的臨床思路。支架材料與生長因子是組織工程方法的兩個必備因素，越來越多研究試圖將生長因子直接復合于支架材料上，以實現生物材料的功能化；但大多數方法僅僅通過物理或化學方法將細胞因子復合于支架材料表面，存在半衰期短等問題。RADA16-Ⅰ是一種新型自組裝多肽材料，具有良好的生物相容性[1-3]，其C末端可通過化學鍵結合具有細胞因子生物學活性的短肽片段，使材料具備生物學活性的同時延長細胞因子活性片段的作用時間[1]。大量研究顯示[4-6]，BMP-7于體內外條件下均可促進髓核組織蛋白多糖和Ⅱ型膠原合成，注射后還可改善新西蘭大白兔椎間盤內的含水量、增加椎間盤高度，從而修復椎間盤退變。本研究利用RADA16-Ⅰ通過化學鍵作用于其C末端復合BMP-7活性短肽片段（KPSSAPTQLN），成功制備了功能化自組裝多肽RADA-KPSS。RADA-KPSS對 RADA16-ⅠC末端的延長會降低自組裝多肽RADA16-Ⅰ固有的凝膠性，但當RADA-KPSS與RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合形成新的功能化自組裝多肽RADKPS后，又可恢復原有的水凝膠特性[7]。本課題組前期體外實驗結果顯示，新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料RADKPS有良好的成膠能力，且在體外對人退變髓核細胞的細胞活性、細胞增殖、分泌等具有明顯促進作用[7]。理想的生物材料必須首先具備良好的生物相容性[8]，才能安全用于體內研究；故本實驗進一步評價其生物相容性，為RADKPS用于退變椎間盤修復再生領域的進一步體內研究提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6 ～ 8 周齡健康昆明種小鼠 36只，雌雄各半，體質量17 ～ 23 g；3月齡新西蘭大白兔1只，體質量2.5 kg；6月齡新西蘭大白兔10只，雌雄各半，體質量2.8～3.1kg；均由中國人民解放軍海軍總醫院實驗動物中心提供。
RADA16-Ⅰ（氨基酸序列：ACN-RADARADARADARADA-CONH2）與RADA-KPSS（氨基酸序列：ACN-RADARADARADARADAGGKPSSAPT-QLN-CONH）多肽粉末各100 mg（利用固相合成法合成，純度>90%；上海生工生物工程有限公司）；兔淋巴細胞分離液（1.073×103 g/L；天津灝洋生物科技有限公司）；MTT、DMSO、青霉素、鏈霉素、PBS緩沖液（Sigma 公司，美國）；L-DMEM培養基、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；FBS（杭州四季青生物制品有限公司）。XFluor4酶標儀 （TECAN 公司，奧地利）；4300-S掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；Heraeus CO2 培養箱（Thermo公司，日本）；IME-Ⅱ倒置相差顯微鏡、IX71倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；SPM9600原子力學顯微鏡（島津公司，日本）；培養瓶、培養板（Corning公司，美國）；Hamilton微量注射器（北京博朗寧科技有限公司）。
1.2 RADKPS制備及其性能檢測
1.2.1 RADKPS的制備及成膠
將RADA16-Ⅰ和RADA-KPSS多肽粉末分別與10%蔗糖溶液配制成濃度為1%（m/v）的多肽溶液，4℃超聲振蕩30min以使多肽粉末充分溶解；然后將1%RADA16-Ⅰ溶液和1%RADA-KPSS溶液等體積混合形成1%RAD KPS；用孔徑為0.22 μm的一次性無菌注射式過濾膜消毒后置于4℃保存，備用。分別將3枚Transwell小室置于24孔培養板內，移液槍吸取備好的1%RADA16-Ⅰ、1%RADA-KPSS、1%RADKPS各100 μL分別移入3枚Transwell小室，然后分別向各Transwell小室中緩慢滴加L-DMEM并觀察各組成膠情況。
1.2.2 原子力學顯微鏡觀察
吸取5 μL 稀釋至0.01%（m/v）的RADKPS滴在新鮮的云母片上，靜置25～30 s后用100 μL PBS液輕輕沖洗，空氣中晾干后室溫放置3～4 h。用原子力顯微鏡釆用硅掃描探針接觸模式觀察RADKPS自組裝纖維形貌，掃描區域1 μm×1 μm，掃描頻率1.00 Hz；再以SPM-9700圖像分析軟件對RADKPS的自組裝纖維直徑和長度進行定量分析。
1.3 RADKPS細胞相容性實驗
1.3.1 兔BMSCs分離培養
取3月齡新西蘭大白兔以氯胺酮+速眠新0.5 mL肌肉注射麻醉后，于脛骨平臺下方穿刺抽取約3 mL骨髓，迅速置入預裝有2 mL肝素鈉的15 mL離心管，搖晃混勻，采用密度梯度離心聯合貼壁法分離培養兔BMSCs。等體積 PBS 混勻骨髓血，緩慢置于2倍體積淋巴細胞分離液上，以離心半徑10 cm、2 000 r/min離心20 min；吸取中間白膜層骨髓單個核細胞，PBS離心洗滌（6mL PBS混懸細胞以離心半徑10 cm、1 500 r/min 離心5min，棄上清）2遍后計數，以5 mL含20%FBS、1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的L-DMEM培養液重懸細胞，按1×106個/cm2密度接種于25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中行原代培養。48 h后換液，PBS沖洗3次棄去未貼壁細胞，此后每 2～3 天換液1次，待原代培養細胞達80%融合時行胰蛋白酶消化傳代培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，并取第3代細胞進行以下實驗。
1.3.2 細胞-支架復合物制備
將Transwell小室置于每孔加入400 μL 10%FBS、1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的L-DMEM培養液的24孔培養板內。用10%蔗糖溶液重懸第3代BMSCs制備濃度為2.5×106 個/mL的細胞懸液，取20 μL細胞懸液與100μL 1%RADKPS溶液迅速混勻，立即移入Transwell小室，向其表面緩慢滴加400 μL含10%FBS、1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的L-DMEM培養液，置入37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內孵育10 min；然后緩慢更換培養孔和水凝膠表面的培養基，再置入37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內孵育30 min；之后每30分鐘緩慢更換培養孔及水凝膠表面的培養液，至少更換2次以緩沖多肽水凝膠內的pH值。
1.3.3 掃描電鏡觀察
取培養12 h及7 d的細胞-支架復合物，2.5%戊二醛固定后，經20%、50%、70%、90%乙醇梯度脫水各15 min，無水乙醇脫水3 次，空氣中干燥24 h，噴金處理，掃描電鏡下觀察。
1.3.4 細胞活性染色觀察
取培養12 h及7 d的細胞-支架復合物，PBS沖洗3 min×3次，避光置于熒光素二乙酸鹽/碘化丙啶（fluorescein diacetate/propidium iodide，FDA/PI；FDA濃度為5 mg/mL，PI為2 mg/ mL）溶液，37℃下孵育5 min，PBS沖洗3min×3 次，IX71倒置熒光顯微鏡下觀察，100倍視野下每組隨機選取6個視野分別計數死、活細胞數量，計算細胞活性。
1.3.5 MTT檢測
取生長狀態良好的第3代BM SCs，0.25%胰蛋白酶消化后，制成濃度為1×104 個 / mL的細胞懸液，接種于96 孔板培養（100μL/孔）；培養 24 h 后，各孔分別再加入 100 μL濃度為0.1%、0.05%、0.025%的RADKPS溶液（分別為實驗組1、2、3），含10%FBS的L-DMEM培養液（陰性對照組）和10%無菌蔗糖溶液（空白對照組），每組設5個復孔。每2天換液1次，分別培養8 h及1、3、5、7 d，每孔加入20 μL MTT、5 mg/mL PBS液，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養4 h后棄上清，每孔加入 150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀于570nm 處測吸光度（A）值，按以下公式計算相對增殖度（relative growth rate，RGR）：實驗組A值/陰性對照組A值×100%。
1.3.6 兔離體椎間盤器官髓核內細胞活性觀察
取6月齡新西蘭大白兔10只，氯胺酮+速眠新0.5 mL肌肉注射麻醉后，6 000 U肝素鈉靜脈注射抗血栓。無菌條件下手術分離脊柱并獲取椎間盤，盡可能剃去椎間盤兩側骨性終板，并剔除椎間盤的前后縱韌帶及外層纖維環，生理鹽水反復高壓沖洗3遍。選取處理好的椎間盤，以10 mL注射器從椎間盤后外45°穿刺至髓核中心位置，維持10 mL負壓抽吸15 s，隨后于對側后外45°以微量注射器注入25 μL 1%RADKPS多肽溶液作為實驗組，未注射多肽椎間盤設為空白對照組（每組3枚椎間盤）。超凈臺無菌條件下，以含1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的PBS液沖洗椎間盤器官2遍后，兩組分別置入有10 mL含10%FBS、1%雙抗（青霉素/鏈霉素）L-DMEM培養液的25 cm2透氣培養瓶，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中豎立培養瓶培養。1、3、7 d后取出髓核，避光條件下置于配備好的0.5%FDA/0.2%PI染液，并于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中孵育5 min后，以PBS液反復沖洗髓核組織2 min。IX71倒置熒光顯微鏡下觀察。于100倍視野下每枚椎間盤隨機選取2個視野分別計數死、活細胞數量，計算細胞活性。
1.4 RADKPS血液相容性實驗
根據ISO 10993.4[9]標準及文獻[10-11]方法進行功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠RADKPS溶液血液相容性檢測。取兔肝素抗凝靜脈血10 mL，按血∶生理鹽水為4∶5的比例稀釋；向各試管分別加入0.1%（A組）、0.05%（B組）、0.025%（C組）RADKPS溶液及10%蔗糖溶液（D組）、生理鹽水（E組，陰性對照）、蒸餾水（F組，陽性對照）各5 mL，再向各管中加入稀釋后的全血0.1 mL，37℃水浴保溫60 min；然后以離心半徑10 cm、3 000 r/min離心5min，取上清液于波長545 nm處測定各管A值，按以下公式計算相對溶血率：（樣本A值－陰性對照A值）/（陽性對照A值－陰性對照A值） ×100%，實驗重復 3 次，取均值。相對溶血率<5%為不發生溶血，符合醫用生物材料的溶血實驗要求。
1.5 RADKPS組織相容性實驗
取6～8周齡健康昆明小鼠36只，5%水合氯醛100 μL麻醉，于雙側脊柱旁1 cm、頭端距髖關節1cm處以微量注射器分別注射1%RADKPS溶液0.1mL，注射完畢后針頭滯留30 s后緩慢拔出。常規飼養7、14、28 d觀察小鼠存活情況及注射局部有無水皰、紅斑及焦痂形成；各時間點分別處死12只小鼠，取出未完全降解的支架材料及部分周圍組織，經固定、石蠟包埋、切片后行HE染色，倒置顯微鏡下觀察支架降解情況及局部炎性反應情況。
1.6 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RADKPS支架性能觀察
在Transwell小室中緩慢滴加L-DMEM后，單純RADA16-Ⅰ多肽溶液和RADKPS多肽溶液從底部開始逐漸變成水凝膠狀，5 min后小室內的多肽溶液均呈水凝膠狀，從小室中取出后可見均勻透明、光亮的水凝膠圓柱體；而單純RADA-KPSS多肽溶液成膠能力較前二者差。見圖 1。原子力學顯微鏡示RADKPS自組裝納米纖維相互連接呈三維網狀結構，纖維直徑（25.68±4.62）nm，纖維長度（512.42±32.22）nm。見圖 2。
圖1
功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架大體觀察 ? 單純RADA-KPSS ? 單純RADA16-Ⅰ ? RADKPS 圖 2 RADKPS原子力學顯微鏡觀察（×50 k） 圖 3 第3代兔BMSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡 ×100） 圖 4 細胞-支架復合物培養不同時間點掃描電鏡觀察（×1 000） 箭頭示支架內附著的 BMSCs ? 12 h ? 7 d 圖 5 細胞-支架復合物培養不同時間點FDA/PI染色觀察細胞活性 ? 12 h（倒置熒光顯微鏡×100） ? 7 d（倒置熒光顯微鏡×40） 圖 6 MTT檢測各組培養各時間點細胞增殖情況 圖 7 兔離體椎間盤器官培養各時間點髓核細胞活性觀察 ? 實驗組1 d（倒置熒光顯微鏡×40） ? 空白對照組1 d（倒置熒光顯微鏡×40） ? 實驗組3 d（倒置熒光顯微鏡×100） ? 空白對照組3 d（倒置熒光顯微鏡×100） ? 實驗組7 d（倒置熒光顯微鏡×100） ? 空白對照組7 d（倒置熒光顯微鏡×100）
Figure1.
General observation of the functional self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold ? RADA-KPSS ? RADA16-I ? RADKPS Fig. 2 Atomic force microscopy image of RADKPS (×50 k) Fig. 3 Morphologic observation of the 3rd generation rabbit BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) Fig. 4 Scanning electron microscope observation of BMSCs-RADKPS scaffold composite at each time point (×1 000) Arrow indicated BMSCs which tightly attached to RADKPS ? At 12 hours ? At 7 days Fig. 5 Cellular activity observation of BMSCs-RADKPS scaffold composite at each time point after cultured through fluorescein diacetate/propidium iodide staining ? At 12 hours (Inverted fluorescence microscope×100) ? At 7 days (Inverted fluorescence microscope×40) Fig. 6 Cell proliferation by MTT in each group at each time point Fig. 7 Cellular activity observation of nucleus pulposus cells from isolated rabbit intervertebral disc organs cultured at each time point ? Experimental group at 1 day (Inverted fluorescence microscope×40) ? Blank control group at 1day (Inverted fluorescence microscope×40) ? Experimental group at 3 days (Inverted fluorescence microscope×100) ? Blank control group at 3 days (Inverted fluorescence microscope×100) ? Experimental group at 7 days (Inverted fluorescence microscope×100) ? Blank control group at 7days (Inverted fluorescence microscope×100)
2.2 RADKPS細胞相容性實驗
①倒置相差顯微鏡觀察示，第3代新西蘭大白兔BMSCs呈長梭形，漩渦樣生長（圖 3）。②掃描電鏡觀察示，細胞-支架復合物培養12 h，BMSCs呈球形黏附于支架材料內；7 d，支架材料內可見大量BMSCs，細胞伸出大量偽足與支架材料的納米纖維緊緊黏附，其形態呈現三維立體結構，表面可見大量類細胞外基質樣分泌物。見圖 4。③細胞活性染色示，細胞-支架復合物培養12 h及7 d，細胞活性分別為93.3%±1.6%和91.2%±1.9%，7 d時細胞數量顯著多于12 h時，但細胞活性低于12h時，比較差異有統計學意義（t=4.706，P=0.001）。見圖 5。④MTT檢測示，實驗組1、2、3的RGR分別為115.0%±1.1%、105.3%±1.6%、102.9%±0.9%，BMSCs增殖能力隨多肽溶液濃度增加呈遞增趨勢，但差異無統計學意義（F=3.146，P=0.112）。見圖 6。⑤兔離體椎間盤器官培養過程中，實驗組與空白對照組椎間盤內髓核細胞活性均在85%以上。培養1、3 d，實驗組與空白對照組椎間盤內髓核細胞活性比較差異無統計學意義（P>0.05）；7 d時實驗組細胞活性明顯高于空白對照組，差異有統計學意義（t=4.287，P=0.006）。見表 1、圖 7。
表1
兩組兔離體椎間盤器官培養各時間點髓核細胞活性比較（n=36，%，2.3 RADKPS血液相容性實驗
A、B、C、D、E組可見紅細胞沉積，上層液體顏色接近無色；F組未見紅細胞沉積，上層液體顏色為紅色。A、B、C組相對溶血率分別為3.6%、0.8%、0.6%，均<5%，符合醫用生物材料的溶血實驗要求。
2.4 RADKPS組織相容性實驗
所有小鼠注射區皮膚無明顯水皰、紅斑及焦痂形成；飼養24 h內無發熱、驚厥、死亡現象。注射局部皮膚取材后可見10 d內皮下呈明顯隆起，后隆起逐漸扁平，28 d時局部隆起基本消失。見圖 8。
圖8
小鼠皮下注射RADKPS溶液后各時間點大體觀察 ? 7 d ? 14 d ? 28 d 圖 9 小鼠皮下注射RADKPS溶液后各時間點HE染色觀察 ? 7 d（×40） ? 7 d （×100） ? 7 d （×200） ? 14 d（×40） ? 14 d（×100） ? 14 d（×200） ? 28 d（×40） ? 28 d（×100） ? 28d（×200）
Figure8.
General observation at each time point after subcutaneous implantation ? At 7 days ? At 14 days ? At 28 days Fig. 9 HE staining observation at each time point after subcutaneous implantation ? At 7 days (×40) ? At 7 days (×100) ? At 7 days (×200) ? At 14 days (×40) ? At 14 days (×100) ? At 14 days (×200) ? At 28 days (×40) ? At 28 days (×100) ? At 28 days (×200)
HE染色示，RADKPS溶液植入部位皮膚層次清晰，結構正常。植入7 d，水凝膠于皮下形成均勻的網格狀支架結構，有少量中性粒細胞浸潤；14 d，較多成纖維細胞長入并伴支架周圍部分降解；28 d，支架結構進一步降解，局部被正常纖維組織替代，以成纖維細胞和單核細胞浸潤為主。見圖 9。
3 討論
自組裝多肽納米纖維RADA16-Ⅰ具有含水量高（可達99%）、可注射、良好的生物相容性及可于體內自組裝成與細胞外基質結構相似的納米纖維支架等特征[12-14]，因此被認為是一種理想的組織工程生物支架材料。RADA16-Ⅰ的C末端可通過化學鍵插入短肽活性片段，使該多肽納米材料具有生物學活性。目前各種短肽活性片段修飾的RADA16-Ⅰ已在神經、軟骨、血管、心肌再生修復中應用，并獲得了滿意效果[3, 13, 15-16]。BMP-7是目前為止促進髓核細胞分泌蛋白多糖能力最強的生長因子之一[17-18]。Chen等[19]研究發現BMP-7具有3個功能活性片段——KPSS、SNVI、KAIS。本課題組前期研究結果表明，載有活性片段KPSS的功能化自組裝多肽RADA-KPSS較載有活性片段SNVI、KAIS的功能化自組裝多肽RADA-SNVI、RADA-KAIS更能促進人髓核細胞增殖、遷移及表達細胞外基質成分（Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX-9）[20]。但單純的RADA-KPSS成膠性能較差，而將RADA-KPSS與RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合后不但能夠明顯改善成膠性能，同時在體外條件下可顯著促進人退變髓核細胞增殖及Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX-9基因的表達[7]。故將RADA-KPSS與RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合制成的新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料RADKPS，可能為髓核組織工程內源性修復提供更優良的材 料。
本研究結果顯示，原子力顯微鏡觀察RADKPS支架材料具備納米級的纖維直徑以及孔徑結構，可為細胞提供良好的三維環境。理想的髓核組織工程支架復合材料應具有良好的生物相容性，以確保臨床應用的安全性。細胞相容性包括細胞在支架上的黏附、活性，以及不同濃度多肽支架溶液對細胞增殖的影響。掃描電鏡結果示，細胞在接種12 h時開始黏附，呈球狀，無偽足伸出；7 d時細胞已經展開，呈卵圓形，其表面附著大量顆粒，表明細胞已開始分泌細胞外基質，并與鄰近細胞多平面立體接觸。細胞活性染色結果示，細胞在接種12 h及7 d后活性均良好，表明多肽水凝膠成膠過程未產生具有明顯細胞毒性的物質。細胞增殖實驗結果示，兔BMSCs在不同濃度RADKPS溶液中生長良好，且數量均多于單純10%FBS培養液組，但無統計學差異，這可能是由于實驗組RADKPS溶液濃度均較低而不能形成三維孔隙結構，不能發揮支架材料三維培養細胞的優勢。而支架材料中復合的KPSS片段發揮了BMP-7的促細胞增殖效應，側面說明了該功能片段的有效 性。
多種離體椎間盤器官模型已被成功用于椎間盤早期退變及生物力學等研究[21-23]，本實驗選擇新西蘭大白兔離體椎間盤器官培養模型，能夠維持椎間盤內髓核細胞所固有的低氧、高滲和低pH環境，減少培養條件的變化對椎間盤髓核內細胞的影響，而反映RADKPS對髓核內細胞的作用。通過肝素化、盡可能修除骨性終板、剔去前后縱韌帶及外層纖維環，盡可能保證了椎間盤器官營養通道的通暢；以微量注射器注射方法有效防止了注入水凝膠材料的泄露，并盡可能降低對髓核內細胞的損傷。通過7 d的培養可定性觀察到注射組離體椎間盤器官內髓核細胞活性高于空白對照組。說明該新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠RADKPS對椎間盤器官內的髓核細胞無毒性反應。
支架本身或其在體內降解后產生的代謝產物不可避免地會進入血液循環中，有產生溶血副作用的風險，本研究溶血實驗結果顯示，不同濃度RADKPS溶液相對溶血率均<5%，完全符合醫用材料對溶血實驗的要求。
支架植入小鼠皮下觀察主要是評價其局部炎性反應以及降解速度情況。組織學結果顯示在14 d內以少量中性粒細胞浸潤為主，28 d時以成纖維細胞浸潤為主，成纖維細胞分泌大量膠原纖維，已逐步取代原支架結構，表明支架的降解速度符合人體內新生組織再生長入的速度，具有良好的組織相容性。
綜上述，修飾有BMP-7功能片段的新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠RADKPS具有良好的細胞相容性、血液相容性及組織相容性，為進一步動物實驗驗證其修復椎間盤的作用奠定了實驗基礎。
