引用本文： 張國威, 汪泱, 鄧志鋒. MSCs來源的外泌體修復組織損傷的機制研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(4): 499-503. doi: 10.7507/1002-1892.20160099 復制
MSCs廣泛存在于人體組織中，是一類具有自我更新能力的多能前體細胞。其具有多種功能，包括多系分化、促進組織修復、抗炎治療、免疫抑制以及神經保護作用等。傳統觀念認為MSCs發揮其生物學功能主要是通過定位至損傷組織，分化取代受損細胞發揮治療作用。然而，一系列研究發現MSCs在損傷位點的定植與分化效率很低，修復作用有限[1-2]，并且移植的MSCs與損傷組織間的距離對其發揮修復作用并無影響[3-5]。研究者認為，MSCs可能通過釋放一些因子減少細胞損傷、增強修復作用[6]。研究證明外泌體廣泛參與細胞之間的交流，因此研究者推測其可能作為MSCs的旁分泌因子來實現損傷修復作用[7]。
外泌體是細胞分泌的一種直徑為30～100nm的囊泡，其內包裹有來源細胞內的多種mRNA、微小RNA（micro RNA，miRNA）、DNA、蛋白質等生物活性物質，幾乎存在于所有體液中，并根據其大小、功能或表面標志物進行分類[8]。1980年Pan等首次發現羊網織紅細胞分泌一些小囊泡，最初認為它是網織紅細胞成熟過程中脫落的無用蛋白[9]，在1987年的進一步研究中將這些小囊泡命名為“exosomes”（即外泌體）[10]，由此研究者們開始關注這些功能性囊泡。外泌體相關研究的迅速發展主要得益于其領域的兩大突破：第一，1996年Raposo研究組發現B淋巴細胞來源的囊泡具有激活免疫系統的作用，參與適應性免疫過程[11]；隨后，許多研究組相繼發現了外泌體囊泡中含有的功能性蛋白，并參與一些生理過程，進而建立了外泌體作為細胞間信號傳遞介質的概念。第二，外泌體囊泡中RNA的發現，也極大促進了外泌體研究的發展。2006年，Ratajczak研究組報道，外泌體能夠運載mRNA至靶細胞，并翻譯成相應蛋白[12]；2007年，Valadi等[13]發現外泌體同樣負載miRNA；2010年，又有3個課題組分別獨立報道了miRNA存在于外泌體囊泡中，并抑制靶基因的表達[14-16]。越來越多研究證明，外泌體廣泛參與細胞之間的交流，作用于靶細胞，調節生理過程。隨后在多種疾病模型的研究中發現，MSCs來源的外泌體（MSCs-derived exosomes，MEX）具有與MSCs相似的促進組織修復作用，有望成為再生醫學中一個新的治療方法。本文通過闡述MEX中RNA、蛋白質及未明確的生物活性物質的組織損傷修復潛力，探討MEX的作用機制以及臨床應用潛能。
1 RNA介導的損傷修復作用
1.1 mRNA
研究表明MEX中mRNA在損傷修復中具有治療作用。Bruno等[17-18]研究表明，MEX中的mRNA主要與促增殖、轉錄調控以及免疫調節有關，對腎損傷發揮修復作用。Gatti等[19]在缺血再灌注急性腎損傷大鼠模型中發現，外泌體運載的mRNA通過促進固有腎小管上皮細胞增殖，抑制存活細胞的凋亡，發揮損傷修復作用。隨后，Zhu等[20]研究了MEX中mRNA與急性肺損傷修復間的關系，研究發現外泌體包含角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）mRNA，它從BMSCs轉運至肺泡二型上皮細胞，并翻譯KGF蛋白；KGF蛋白水平的升高可以抑制免疫反應，減少肺組織損傷。
1.2 miRNA
miRNA也被認為是MEX在組織損傷中修復的一個關鍵生物活性物質。首先在神經系統疾病方面，研究發現[21]在大腦中動脈栓塞鼠模型中，miRNA-133b從BMSCs轉運至受損神經元，可能通過調節酪氨酸羥化酶產生和多巴胺轉運蛋白，誘導神經突生長，增強神經可塑性，促進腦損傷修復。但miRNA-133b在MEX修復腦損傷中的確切機制還需要進一步探究。此外，Bonafede等[22]在體外構建脊髓側索硬化癥細胞模型，首次發現脂肪來源MSCs（adipose-derived stem cells，ADSCs）來源的外泌體在脊髓側索硬化癥中的神經保護作用，認為可能是外泌體內的miRNA，比如miRNA21、miRNA222及miRNAlet7a，通過凋亡抑制途徑、細胞周期調控、促增殖反應發揮修復作用。同時，MEX miRNA與心臟損傷修復方面的研究也有大量文獻報道。Feng等[23]認為心肌缺血后，心肌內甲基化CpG結合蛋白2的水平升高，miRNA-22直接作用于甲基化CpG結合蛋白2，發揮抗凋亡作用。另有研究發現，BMSCs來源外泌體中的miRNA-19a也具有相似的修復作用，但是其作用機制可能是抑制PTEN和BIM蛋白的表達，激活Akt和ERK信號途徑[24]。MEX miRNA在其他系統組織中的修復作用也相繼被發現。Nakamura等[25]在心臟毒素誘導的肌肉損傷模型中，采用肌肉注射MEX可誘導肌細胞新生以及血管新生，修復肌肉損傷；并認為miRNA494通過線粒體轉錄因子A和Forkhead box j3調控線粒體合成，能夠促進肌細胞新生和遷移。最近，Wang等[26]首次發現MEX中miRNA-223在膿毒血癥中具有心臟保護作用，為治療膿毒血癥提供了新的思路。可見，miRNA在組織修復過程中發揮了重要作用，為研究MEX功能提供了新的方向。
2 蛋白質介導的損傷修復作用
外泌體所含蛋白質的生物學功能首先在免疫學研究中證實[11, 27]。之后進一步研究發現了外泌體蛋白在癌癥及神經科學領域中的作用[28-30]。直至2010年才報道了MEX中蛋白質的損傷修復作用[31]，但目前相關研究報道較少。
MEX中蛋白質主要通過調節細胞內的信號途徑，促進細胞增殖和存活細胞的抗凋亡，在多種組織中發揮修復作用。早期研究發現[31-32]MSCs來源的旁分泌因子對心肌缺血再灌注損傷的修復作用，主要是外泌體的參與；一系列相關研究[33]證明外泌體蛋白質可以提高ATP和還原型輔酶Ⅰ水平，降低c-JNK磷酸化減少氧化應激，激活PI3K/Akt通路促進細胞增殖，由此發揮損傷修復作用，但發揮作用的具體外泌體蛋白質還需要進一步研究。Zhang等[34]研究人臍帶MSCs分泌的外泌體，通過運載Wnt4蛋白激活內皮細胞的Wnt/β-鏈蛋白信號通路，增強血管新生，促進皮膚損傷愈合。在神經系統方面，Katsuda等[35]研究發現ADSCs外泌體包含酶活性腦啡肽酶，其為腦中β淀粉樣蛋白的降解酶；共培養實驗表明，ADSCs來源MEX被轉運到過度表達淀粉樣前體蛋白的Neuro-2a細胞中，細胞內外β淀粉樣蛋白濃度水平降低。在免疫調節方面，研究發現了外泌體相關的酶在移植物抗宿主病中的治療潛能[36]。比如，BMSCs來源的外泌體運載具有酶功能的CD73，它是作用于ATP信號途徑的生物大分子，能夠將AMP代謝為腺苷，通過此通路促進腺苷A2A受體表達的Th1凋亡[37]。目前關于功能性蛋白質的研究有限，因此MEX中蛋白質在其他系統組織中的修復作用需要進一步研究。
3 MEX中未明確的生物活性物質介導的損傷修復
盡管有關MEX損傷修復作用的報道很多，但大部分研究都未能確定何種生物活性物質發揮了修復作用。MEX在各個系統組織損傷修復的研究成果，為下一步深入探討相關分子機制奠定了基礎。He等[38]研究發現，5/6腎切除殘腎鼠模型中通過尾靜脈注入MEX，可以阻止腎組織纖維化、間質淋巴細胞浸潤以及防止腎小管萎縮，達到保護修復腎臟損傷的作用。在呼吸系統方面，相關報道顯示在缺氧性肺動脈高壓模型鼠中，MEX通過抑制巨噬細胞涌入缺氧性肺動脈以及缺氧誘導的STAT3信號途徑，誘導抗炎和促增殖因子的產生，達到保護修復的作用[39]。在神經系統方面，Zhang 等[40]首次發現通過尾靜脈注射MEX能夠促進神經功能恢復和神經血管重塑，減少創傷性腦損傷后的神經炎性反應。Farinazzo等[41]在體外將神經細胞暴露于H2O2，模擬神經細胞氧化應激狀態，并給予ADSCs來源MEX干預，通過調節神經炎癥和神經退行性疾病的微環境，發揮神經保護和神經再生作用。在運動系統方面，研究表明下肢缺血模型中，MEX在體外能夠促進內皮細胞的增殖成管，在患肢四點注射MEX，體外采用激光多普勒檢測可觀察到明顯的血流恢復現象[42]。在消化系統方面，Tan等[43]研究CCl4誘導的肝損傷鼠模型，發現MEX能夠上調肝臟再生過程中的啟動基因，使增殖相關的蛋白、增殖細胞核抗原和Cyclin D1表達增加，修復受損肝臟。在心肌缺血性疾病中，Teng等[44]研究發現，MEX能夠誘導血管新生，抑制T淋巴細胞增殖，改善缺血后的微環境，從而促進心肌缺血后功能的恢復。Zhao等[45]研究顯示，人臍帶MSCs來源的外泌體能夠顯著增強心肌細胞在低氧條件下Bcl-2（一種重要的抗凋亡蛋白）的表達，增強急性心肌缺血邊緣區域Ki67蛋白（與細胞增殖密切相關，可減輕急性心肌缺血損傷）的表達。此外，STAT3信號通路在傷口愈合過程中發揮重要作用，包括遷移、增殖、血管新生以及生長因子的產生[46]；Shabbir等[46]研究發現MEX能夠促進傷口愈合，主要通過激活多個生長因子信號級聯，包括Akt、STAT3和ERK，使生長因子HGF、IL-6、IGF-1、NGF和基質細胞來源因子1表達量增加；作者認為這些因子的釋放激活了Akt和ERK1/2信號級聯，并進一步激活了STAT3信號通路。Zhang等[47]首次發現了誘導多能干細胞源性MEX可以促進膠原合成和血管新生，從而促進皮膚傷口的愈合。MEX在生物體內多個系統損傷中均表現出優越的修復效果，為進一步研究MEX內容物發揮生物效應機制奠定了前提基礎。
4 小結與展望
以上大量研究表明，在多種動物模型中，MEX均表現出理想的損傷修復效果；并且外泌體中包含的豐富RNA和蛋白質等生物活性物質，在體內運送到靶細胞過程中也不會降解，所以外泌體被認為是理想的藥物運輸工具[48]。此外，一些研究證明，通過對來源細胞的預處理比如基因干預等，能夠改變外泌體的分泌特征以及功能作用[49-50]。參考大量關于MSCs轉基因修飾的文獻報道[51-53]，我們認為MSCs經過預處理后釋放的外泌體將是基因或細胞治療過程中理想的藥物或基因傳送介質。此外，同一種MSCs在不同生長階段培養基中獲得的外泌體，其所含生物活性物質并不完全一樣，為了達到不同的實驗要求，還需要進一步標準化外泌體的提取和收集。
MEX功能也具有個體差異性，據文獻報道，各種組織來源MSCs具有相似的表面標志，但是其產生細胞因子的類型及數量以及對炎癥的反應能力，均表現出明顯不同[54]。供體的年齡和性別也影響MSCs的一些特點，比如表面標志和克隆能力[55]。我們需要進一步明確供體MSCs的特征與它們分泌外泌體功能之間的關系，MEX中生物活性物質特點與MEX治療作用間的關系，以及供體MSCs的特征與MEX產量是否存在相關性，以期為預測臨床應用MEX治療損傷修復的效果提供更加準確的信息。
同時，我們還應注意到MEX的致癌風險。MEX在損傷組織中具有促增殖作用，說明它也可能加快癌癥進展。目前對于MEX是否具有致癌風險仍在討論中。文獻報道MEX可抑制膀胱癌細胞的生長[56]，但能夠促進腎癌細胞的生長和侵襲[57]。這兩種不同的結果表明MEX對癌細胞的作用可能具有類型依賴性。在MEX應用于臨床前我們還需要對此矛盾問題進行更加全面的研究。
MSCs廣泛存在于人體組織中，是一類具有自我更新能力的多能前體細胞。其具有多種功能，包括多系分化、促進組織修復、抗炎治療、免疫抑制以及神經保護作用等。傳統觀念認為MSCs發揮其生物學功能主要是通過定位至損傷組織，分化取代受損細胞發揮治療作用。然而，一系列研究發現MSCs在損傷位點的定植與分化效率很低，修復作用有限[1-2]，并且移植的MSCs與損傷組織間的距離對其發揮修復作用并無影響[3-5]。研究者認為，MSCs可能通過釋放一些因子減少細胞損傷、增強修復作用[6]。研究證明外泌體廣泛參與細胞之間的交流，因此研究者推測其可能作為MSCs的旁分泌因子來實現損傷修復作用[7]。
外泌體是細胞分泌的一種直徑為30～100nm的囊泡，其內包裹有來源細胞內的多種mRNA、微小RNA（micro RNA，miRNA）、DNA、蛋白質等生物活性物質，幾乎存在于所有體液中，并根據其大小、功能或表面標志物進行分類[8]。1980年Pan等首次發現羊網織紅細胞分泌一些小囊泡，最初認為它是網織紅細胞成熟過程中脫落的無用蛋白[9]，在1987年的進一步研究中將這些小囊泡命名為“exosomes”（即外泌體）[10]，由此研究者們開始關注這些功能性囊泡。外泌體相關研究的迅速發展主要得益于其領域的兩大突破：第一，1996年Raposo研究組發現B淋巴細胞來源的囊泡具有激活免疫系統的作用，參與適應性免疫過程[11]；隨后，許多研究組相繼發現了外泌體囊泡中含有的功能性蛋白，并參與一些生理過程，進而建立了外泌體作為細胞間信號傳遞介質的概念。第二，外泌體囊泡中RNA的發現，也極大促進了外泌體研究的發展。2006年，Ratajczak研究組報道，外泌體能夠運載mRNA至靶細胞，并翻譯成相應蛋白[12]；2007年，Valadi等[13]發現外泌體同樣負載miRNA；2010年，又有3個課題組分別獨立報道了miRNA存在于外泌體囊泡中，并抑制靶基因的表達[14-16]。越來越多研究證明，外泌體廣泛參與細胞之間的交流，作用于靶細胞，調節生理過程。隨后在多種疾病模型的研究中發現，MSCs來源的外泌體（MSCs-derived exosomes，MEX）具有與MSCs相似的促進組織修復作用，有望成為再生醫學中一個新的治療方法。本文通過闡述MEX中RNA、蛋白質及未明確的生物活性物質的組織損傷修復潛力，探討MEX的作用機制以及臨床應用潛能。
1 RNA介導的損傷修復作用
1.1 mRNA
研究表明MEX中mRNA在損傷修復中具有治療作用。Bruno等[17-18]研究表明，MEX中的mRNA主要與促增殖、轉錄調控以及免疫調節有關，對腎損傷發揮修復作用。Gatti等[19]在缺血再灌注急性腎損傷大鼠模型中發現，外泌體運載的mRNA通過促進固有腎小管上皮細胞增殖，抑制存活細胞的凋亡，發揮損傷修復作用。隨后，Zhu等[20]研究了MEX中mRNA與急性肺損傷修復間的關系，研究發現外泌體包含角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）mRNA，它從BMSCs轉運至肺泡二型上皮細胞，并翻譯KGF蛋白；KGF蛋白水平的升高可以抑制免疫反應，減少肺組織損傷。
1.2 miRNA
miRNA也被認為是MEX在組織損傷中修復的一個關鍵生物活性物質。首先在神經系統疾病方面，研究發現[21]在大腦中動脈栓塞鼠模型中，miRNA-133b從BMSCs轉運至受損神經元，可能通過調節酪氨酸羥化酶產生和多巴胺轉運蛋白，誘導神經突生長，增強神經可塑性，促進腦損傷修復。但miRNA-133b在MEX修復腦損傷中的確切機制還需要進一步探究。此外，Bonafede等[22]在體外構建脊髓側索硬化癥細胞模型，首次發現脂肪來源MSCs（adipose-derived stem cells，ADSCs）來源的外泌體在脊髓側索硬化癥中的神經保護作用，認為可能是外泌體內的miRNA，比如miRNA21、miRNA222及miRNAlet7a，通過凋亡抑制途徑、細胞周期調控、促增殖反應發揮修復作用。同時，MEX miRNA與心臟損傷修復方面的研究也有大量文獻報道。Feng等[23]認為心肌缺血后，心肌內甲基化CpG結合蛋白2的水平升高，miRNA-22直接作用于甲基化CpG結合蛋白2，發揮抗凋亡作用。另有研究發現，BMSCs來源外泌體中的miRNA-19a也具有相似的修復作用，但是其作用機制可能是抑制PTEN和BIM蛋白的表達，激活Akt和ERK信號途徑[24]。MEX miRNA在其他系統組織中的修復作用也相繼被發現。Nakamura等[25]在心臟毒素誘導的肌肉損傷模型中，采用肌肉注射MEX可誘導肌細胞新生以及血管新生，修復肌肉損傷；并認為miRNA494通過線粒體轉錄因子A和Forkhead box j3調控線粒體合成，能夠促進肌細胞新生和遷移。最近，Wang等[26]首次發現MEX中miRNA-223在膿毒血癥中具有心臟保護作用，為治療膿毒血癥提供了新的思路。可見，miRNA在組織修復過程中發揮了重要作用，為研究MEX功能提供了新的方向。
2 蛋白質介導的損傷修復作用
外泌體所含蛋白質的生物學功能首先在免疫學研究中證實[11, 27]。之后進一步研究發現了外泌體蛋白在癌癥及神經科學領域中的作用[28-30]。直至2010年才報道了MEX中蛋白質的損傷修復作用[31]，但目前相關研究報道較少。
MEX中蛋白質主要通過調節細胞內的信號途徑，促進細胞增殖和存活細胞的抗凋亡，在多種組織中發揮修復作用。早期研究發現[31-32]MSCs來源的旁分泌因子對心肌缺血再灌注損傷的修復作用，主要是外泌體的參與；一系列相關研究[33]證明外泌體蛋白質可以提高ATP和還原型輔酶Ⅰ水平，降低c-JNK磷酸化減少氧化應激，激活PI3K/Akt通路促進細胞增殖，由此發揮損傷修復作用，但發揮作用的具體外泌體蛋白質還需要進一步研究。Zhang等[34]研究人臍帶MSCs分泌的外泌體，通過運載Wnt4蛋白激活內皮細胞的Wnt/β-鏈蛋白信號通路，增強血管新生，促進皮膚損傷愈合。在神經系統方面，Katsuda等[35]研究發現ADSCs外泌體包含酶活性腦啡肽酶，其為腦中β淀粉樣蛋白的降解酶；共培養實驗表明，ADSCs來源MEX被轉運到過度表達淀粉樣前體蛋白的Neuro-2a細胞中，細胞內外β淀粉樣蛋白濃度水平降低。在免疫調節方面，研究發現了外泌體相關的酶在移植物抗宿主病中的治療潛能[36]。比如，BMSCs來源的外泌體運載具有酶功能的CD73，它是作用于ATP信號途徑的生物大分子，能夠將AMP代謝為腺苷，通過此通路促進腺苷A2A受體表達的Th1凋亡[37]。目前關于功能性蛋白質的研究有限，因此MEX中蛋白質在其他系統組織中的修復作用需要進一步研究。
3 MEX中未明確的生物活性物質介導的損傷修復
盡管有關MEX損傷修復作用的報道很多，但大部分研究都未能確定何種生物活性物質發揮了修復作用。MEX在各個系統組織損傷修復的研究成果，為下一步深入探討相關分子機制奠定了基礎。He等[38]研究發現，5/6腎切除殘腎鼠模型中通過尾靜脈注入MEX，可以阻止腎組織纖維化、間質淋巴細胞浸潤以及防止腎小管萎縮，達到保護修復腎臟損傷的作用。在呼吸系統方面，相關報道顯示在缺氧性肺動脈高壓模型鼠中，MEX通過抑制巨噬細胞涌入缺氧性肺動脈以及缺氧誘導的STAT3信號途徑，誘導抗炎和促增殖因子的產生，達到保護修復的作用[39]。在神經系統方面，Zhang 等[40]首次發現通過尾靜脈注射MEX能夠促進神經功能恢復和神經血管重塑，減少創傷性腦損傷后的神經炎性反應。Farinazzo等[41]在體外將神經細胞暴露于H2O2，模擬神經細胞氧化應激狀態，并給予ADSCs來源MEX干預，通過調節神經炎癥和神經退行性疾病的微環境，發揮神經保護和神經再生作用。在運動系統方面，研究表明下肢缺血模型中，MEX在體外能夠促進內皮細胞的增殖成管，在患肢四點注射MEX，體外采用激光多普勒檢測可觀察到明顯的血流恢復現象[42]。在消化系統方面，Tan等[43]研究CCl4誘導的肝損傷鼠模型，發現MEX能夠上調肝臟再生過程中的啟動基因，使增殖相關的蛋白、增殖細胞核抗原和Cyclin D1表達增加，修復受損肝臟。在心肌缺血性疾病中，Teng等[44]研究發現，MEX能夠誘導血管新生，抑制T淋巴細胞增殖，改善缺血后的微環境，從而促進心肌缺血后功能的恢復。Zhao等[45]研究顯示，人臍帶MSCs來源的外泌體能夠顯著增強心肌細胞在低氧條件下Bcl-2（一種重要的抗凋亡蛋白）的表達，增強急性心肌缺血邊緣區域Ki67蛋白（與細胞增殖密切相關，可減輕急性心肌缺血損傷）的表達。此外，STAT3信號通路在傷口愈合過程中發揮重要作用，包括遷移、增殖、血管新生以及生長因子的產生[46]；Shabbir等[46]研究發現MEX能夠促進傷口愈合，主要通過激活多個生長因子信號級聯，包括Akt、STAT3和ERK，使生長因子HGF、IL-6、IGF-1、NGF和基質細胞來源因子1表達量增加；作者認為這些因子的釋放激活了Akt和ERK1/2信號級聯，并進一步激活了STAT3信號通路。Zhang等[47]首次發現了誘導多能干細胞源性MEX可以促進膠原合成和血管新生，從而促進皮膚傷口的愈合。MEX在生物體內多個系統損傷中均表現出優越的修復效果，為進一步研究MEX內容物發揮生物效應機制奠定了前提基礎。
4 小結與展望
以上大量研究表明，在多種動物模型中，MEX均表現出理想的損傷修復效果；并且外泌體中包含的豐富RNA和蛋白質等生物活性物質，在體內運送到靶細胞過程中也不會降解，所以外泌體被認為是理想的藥物運輸工具[48]。此外，一些研究證明，通過對來源細胞的預處理比如基因干預等，能夠改變外泌體的分泌特征以及功能作用[49-50]。參考大量關于MSCs轉基因修飾的文獻報道[51-53]，我們認為MSCs經過預處理后釋放的外泌體將是基因或細胞治療過程中理想的藥物或基因傳送介質。此外，同一種MSCs在不同生長階段培養基中獲得的外泌體，其所含生物活性物質并不完全一樣，為了達到不同的實驗要求，還需要進一步標準化外泌體的提取和收集。
MEX功能也具有個體差異性，據文獻報道，各種組織來源MSCs具有相似的表面標志，但是其產生細胞因子的類型及數量以及對炎癥的反應能力，均表現出明顯不同[54]。供體的年齡和性別也影響MSCs的一些特點，比如表面標志和克隆能力[55]。我們需要進一步明確供體MSCs的特征與它們分泌外泌體功能之間的關系，MEX中生物活性物質特點與MEX治療作用間的關系，以及供體MSCs的特征與MEX產量是否存在相關性，以期為預測臨床應用MEX治療損傷修復的效果提供更加準確的信息。
同時，我們還應注意到MEX的致癌風險。MEX在損傷組織中具有促增殖作用，說明它也可能加快癌癥進展。目前對于MEX是否具有致癌風險仍在討論中。文獻報道MEX可抑制膀胱癌細胞的生長[56]，但能夠促進腎癌細胞的生長和侵襲[57]。這兩種不同的結果表明MEX對癌細胞的作用可能具有類型依賴性。在MEX應用于臨床前我們還需要對此矛盾問題進行更加全面的研究。