引用本文： 陳琳, 習佳飛, 劉大慶, 張秀媛, 呂洋, 李靜, 王靜雪, 周軍年, 南雪, 岳文, 裴雪濤. 小鼠皮膚表皮和真皮細胞共移植誘導毛囊再生實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(4): 485-490. doi: 10.7507/1002-1892.20160097 復制
皮膚是人體最大的器官，包括表皮和真皮。毛囊是包圍在毛發根部的囊狀組織，由內層的上皮性組織和外層的結締性組織組成。毛囊存在于真皮層，它具有自我更新和周期性生長的特性。毛囊的表皮和真皮相互作用能夠發育成完整毛囊。文獻報道[1-6]真皮細胞中的毛囊干細胞能夠誘導毛囊再生，表皮成分對于毛囊再生具有重要的支持作用。毛囊上部隆突區的外根鞘細胞、下部的真皮鞘細胞以及毛乳頭細胞均具有毛囊干細胞特性[7]。既往獲取毛囊干細胞首先需要將表皮和真皮分離，從真皮中拔出毛囊，在解剖顯微鏡下剝離毛囊干細胞區，酶消化分離細胞，整個操作過程費時費力，且所分離細胞數量有限。本研究采用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的C57成年及新生小鼠，分離其真皮和表皮，通過酶消化法獲得表皮細胞和真皮細胞，操作更簡便，并且可獲得大量毛囊干細胞；由于新生小鼠真皮細胞易于培養，可體外擴增其毛囊干細胞，以期應用于毛囊再生。我們將成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞、真皮細胞及新生小鼠傳代培養的真皮細胞移植至裸鼠皮下，通過檢測GFP表達觀察毛囊再生情況，為毛囊研究和應用提供實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8周齡成年雌性C57-GFP小鼠3只，體質量20～23 g；6～8周齡Balb/c裸鼠8只，體質量17～21 g；均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。新生1～2 d C57-GFP小鼠3只，體質量1.5～ 2.0 g，由本研究室提供。
DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（Takara公司，日本）；多能聚糖（Versican）抗體、角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）抗體、CK15抗體、CD133抗體（Abcam公司，美國）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（Sigma公司，美國）；波形蛋白（Vimentin）抗體（Cell Signaling公司，美國）；增強GFP（enhanced GFP，EGFP）抗體（Peprotech公司，美國）；PV6001工作液（中杉金橋生物技術有限公司）。倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；脫水機、包埋機、切片機（Thermo公司，美 國）。
1.2 小鼠表皮和真皮細胞分離培養
將C57-GFP新生及成年小鼠頸部脫臼處死，分別取背部皮膚（2 cm×1 cm）/只和（3 cm×2 cm） /只，浸泡于70%乙醇中2～3 min，PBS洗滌；去除皮膚毛發，冰上操作；將皮膚置于70%乙醇浸泡2min×2次，PBS洗滌后，表皮朝上漂浮于0.25%胰蛋白酶消化液中，4℃過夜；取出皮膚放入無菌平皿中，用刀片分離表皮和真皮；于成年小鼠表皮中加入0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化30min（10 mL吸管反復吹打至消化完全），分離表皮細胞，70 μm濾網過濾。于成年小鼠和新生小鼠真皮中加入0.35%Ⅰ型膠原酶37℃消化30 min，DNA酶繼續消化10 min，以500×g離心5 min，分離真皮細胞，PBS洗滌，100 μm濾網過濾[8]；新生小鼠真皮細胞采用含5%FBS、40 ng/mL bFGF、100 U/mL青-鏈霉素、10 μm二甲基乙二酰基甘氨酸的DMEM/F12培養基培養，擴增至第3代。采用熒光顯微鏡觀察成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞（按1∶1比例混合）、成年小鼠原代真皮細胞、新生小鼠第3代真皮細胞激發綠色熒光的情況及細胞形態變化。采用免疫細胞化學檢測培養的新生小鼠第3代真皮細胞中毛囊干細胞標志（真皮鞘細胞標志Vimentin、α-SMA，毛乳頭細胞標志CD133、Versican，毛囊隆突部標志CK-15，以及陰性對照CK-19）的表達。
1.3 裸鼠皮下移植實驗
1.3.1 實驗分組及方法
取Balb/c裸鼠采用乙醚麻醉后，于背中線與兩后肢髖關節連線交叉處皮下移植細胞。實驗分為4組，每組2只裸鼠，分別為移植成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞組（A組）、移植成年小鼠原代真皮細胞組（B組）、移植新生小鼠第3 代真皮細胞組（C組）及注射生理鹽水陰性對照組（D組），A、B、C組移植細胞數均為1×106個。常規飼養并觀察4～6周。
1.3.2 大體觀察
移植后4、5、6周大體觀察各組裸鼠背部細胞移植部位皮膚外觀情況。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
取移植后6周的各組裸鼠移植部位1 cm×1 cm大小皮膚組織，4%甲醛固定，70%、90%、95%、100%乙醇、二甲苯梯度脫水，石蠟包埋，組織切片（片厚4 μm）。切片以二甲苯室溫脫蠟2次，5～10 min/次；100%、90%、70%乙醇梯度入水各5 min；PBS洗滌5 min×3次，檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進行抗原修復，微波10 min；PBS洗滌5 min×3次，加入3%H2O2-甲醇溶液，室溫孵育10 min；PBS洗滌5 min×3次，加入Triton X-100室溫孵育10 min；PBS洗滌5 min×3次，5%～10%正常血清封閉，室溫孵育10 min；棄血清，勿洗；滴加1∶100稀釋的抗GFP一抗，4℃過夜；PBS洗滌5min×3次，加入PV6001工作液，室溫30min；PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色；自來水充分沖洗，脫水透明并封片，倒置顯微鏡下觀察。同時以正常C57-GFP成年小鼠皮膚為陽性對照。
2 結果
2.1 細胞形態觀察及表型檢測
熒光顯微鏡觀察示，分離、培養的C57-GFP新生及成年小鼠表皮及真皮細胞均能激發綠色熒光。C57-GFP成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞、原代真皮細胞均呈圓形，大小不一；新生小鼠第3代真皮細胞多呈梭形，且可見“鋪路石”狀的上皮樣細胞。見圖 1。免疫細胞化學染色示，體外培養的新生小鼠第3代真皮細胞Vimentin、α-SMA均呈強陽性，提示細胞多為真皮鞘細胞；部分細胞表達毛乳頭細胞標志CD133、Versican及毛囊隆突部標志CK-15；CK-19呈陰性表達。見圖 2。
圖1
C57-GFP小鼠表皮細胞及真皮細胞形態學觀察（熒光顯微鏡×100） ? 成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞 ? 成年小鼠原代真皮細胞 ? 新生小鼠第3代真皮細胞 圖 2 C57-GFP新生小鼠第3代真皮細胞免疫細胞化學染色觀察（倒置顯微鏡×100） ? CK-19 ? CK-15 ? CD133 ? Versican ? Vimentin ? α-SMA
Figure1.
Morphology observation of epidermis and dermis cells of C57-GFP mouse (Fluorescence microscope×100) ? Epidermis and dermis mixed cells of adult mouse ? Dermis cells of adult mouse ? Cultured 3rd generation dermis cells of new born mouse Fig. 2 Immunocytochemistry staining observation of cultured 3rd generation dermis cells of new born mouse (Inverted microscope×100) ? CK-19 ? CK-15 ? CD133 ? Versican ? Vimentin ? α-SMA
2.2 裸鼠皮下移植實驗
2.2.1 大體觀察
移植4～6周，A組可見裸鼠細胞移植處皮下呈灰黑色，未見毛發穿出皮膚表面；B、C、D組裸鼠皮膚均未見著色。見圖 3。
圖3
各組裸鼠皮下移植術后6周大體觀察 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 圖 4 各組裸鼠皮下移植術后6周免疫組織化學染色倒置顯微鏡觀察 ? 正常C57-GFP成年小鼠皮膚（×100） ? D組（×100） ? A組毛囊（×200） ? B組外根鞘、真皮鞘（×200） ? C組外根鞘、真皮鞘（×400） ? C組毛乳頭（×400） ? C組汗腺（×400）
Figure3.
Gross observation of the nude mice skin in each group at 6 weeks after transplantation ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D Fig. 4 Immunohistochemistry staining of the nude mice skin in each group at 6 weeks after transplantation (Inverted microscope) ? Skin of normal aldult C57-GFP mouse (×100) ? Group D (×100) ? Hair follicle in group A (×200) ? Outer root sheath and dermal sheath in group B (×200) ? Outer root sheath and dermal sheath in group C (×400) ? Hair papilla in group C (×400) ? Sweat gland in group C (×400)
2.2.2 免疫組織化學染色觀察
正常C57-GFP成年小鼠皮膚GFP表達陽性，D組GFP表達陰性。移植6周后A、B、C組細胞均能夠在裸鼠皮下成活，A組可見GFP呈陽性表達且完整的毛囊結構，同時也可見毛囊外根鞘細胞表達GFP；B組GFP陽性細胞多表達于毛囊真皮鞘、外根鞘；C組GFP陽性細胞主要分布于毛囊真皮鞘、外根鞘、毛乳頭，在汗腺中也有表達。見圖 4。
3 討論
人體的毛發具有重要生理功能和美容價值。近年來受環境、工作壓力等多種因素的影響，脫發人群不斷增加。目前常采用藥物治療、自體毛囊移植等，均具有一定局限性[9]。毛發由皮膚外的毛干和皮膚內毛根組成，毛根外面包裹著毛囊，毛根和毛囊末端膨大形成毛球。毛囊由來源于表皮的內根鞘、外根鞘、毛母質和來源于真皮的真皮鞘、毛乳頭組成。毛發周期性生長的特性，正是皮膚中毛囊干細胞自我更新并誘導分化的結果[10]。
皮膚包括表皮、真皮和附屬器，其中表皮含有角質形成細胞和非角質形成細胞，如黑素細胞、朗格漢斯細胞等；真皮主要由成纖維細胞和結締組織構成，真皮中含有毛囊、皮脂腺和汗腺等皮膚附屬器。表皮中角質形成細胞屬終末分化細胞，分裂能力有限，且不具有分化能力，不能形成皮膚附屬器；而存在于表皮基底層的表皮干細胞雖然具有很強的增殖能力并可形成表皮的各層細胞，但由于其為單潛能干細胞，只能向表皮角質形成細胞分化，不能形成其他皮膚附屬器[11]。而真皮中含有大量毛囊干細胞，其具有多向分化潛能，能夠形成新的毛囊、皮膚及其附屬器[12-14]。有文獻報道毛囊隆突部干細胞在毛囊再生中發揮重要作用[15]。此外，毛囊的真皮乳頭細胞和真皮鞘細胞同樣能夠誘導毛發生長和毛囊再生，真皮鞘細胞和毛乳頭細胞可互相轉化[16-17]。研究提示真皮乳頭細胞與周圍表皮成分相互作用可誘導毛囊再生[18-19]。
毛囊干細胞分離繁瑣、操作依賴解剖顯微鏡，耗費時間長[20]。我們采用C57-GFP小鼠，利用酶消化法分離獲得表皮和真皮細胞，操作更為簡便。熒光顯微鏡觀察示，細胞均能夠激發GFP綠色熒光，可作為細胞移植標記物進行示蹤、檢測；成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞、真皮細胞均為圓形，大小不一；毛囊存在于皮膚真皮中，且新生小鼠細胞增殖能力強，易于培養，利用特定培養基擴增3代的真皮細胞多為梭形，推測多為真皮來源的真皮鞘細胞和毛乳頭細胞，也可見少量“鋪路石”狀的上皮樣細胞，可能是毛囊隆突部細胞以及腺細胞。免疫細胞化學檢測毛囊干細胞標志表明，細胞多為真皮鞘細胞，部分細胞表達毛乳頭細胞標志以及表皮來源的毛囊隆突部細胞標志，鼠的毛囊隆突部不表達CK19，作為陰性對照。結果提示真皮細胞中含有大量毛囊干細胞，傳至第3代仍具有干細胞特性。
正常Balb/c裸鼠為T淋巴細胞缺陷鼠，且毛囊角化，毛干萎縮。將成年小鼠真皮-表皮混合細胞（A組）、成年小鼠原代真皮細胞（B組）、新生小鼠第3代真皮細胞（C組）移植于裸鼠皮下4～6周，大體觀察可見A組裸鼠皮下呈黑褐色，但未見毛發長出，可能與裸鼠表皮缺乏相應的調控因子有關；B、C組皮膚外觀與注射生理鹽水組（D組）無差別。石蠟切片免疫組織化學染色結果示，A組呈現 GFP陽性表達的新的、完整的毛囊，且生長方向正常，提示可能是毛囊干細胞與表皮細胞相互作用的結果，同時也可見毛囊結構中部分細胞表達GFP，如毛囊外根鞘細胞等，推測移植的細胞參與了裸鼠毛囊的形成；B組GFP陽性細胞多分布于毛囊真皮鞘、外根鞘；C組GFP陽性細胞則分布于毛囊真皮鞘、毛乳頭、外根鞘，且汗腺中也有表達。同時可見C組毛囊結構較B組更為完整，提示可能是其毛囊干細胞與宿主細胞相互作用形成新的毛囊，且可分化為汗腺。
綜上述，小鼠皮膚的表皮和真皮細胞在裸鼠體內相互作用可形成完整的毛囊結構，而僅移植新鮮分離的原代或體外培養3代的真皮細胞則主要參與毛囊形成。本研究為利用皮膚毛囊干細胞進行毛發再生提供了新的思路，即共移植表皮和真皮細胞更有利于毛囊再生。下一步需要確認真皮中毛囊干細胞的特異性標志，以及表皮中發揮毛囊再生支持作用的細胞類型及其作用機制，為毛發再生治療提供實驗基礎。
皮膚是人體最大的器官，包括表皮和真皮。毛囊是包圍在毛發根部的囊狀組織，由內層的上皮性組織和外層的結締性組織組成。毛囊存在于真皮層，它具有自我更新和周期性生長的特性。毛囊的表皮和真皮相互作用能夠發育成完整毛囊。文獻報道[1-6]真皮細胞中的毛囊干細胞能夠誘導毛囊再生，表皮成分對于毛囊再生具有重要的支持作用。毛囊上部隆突區的外根鞘細胞、下部的真皮鞘細胞以及毛乳頭細胞均具有毛囊干細胞特性[7]。既往獲取毛囊干細胞首先需要將表皮和真皮分離，從真皮中拔出毛囊，在解剖顯微鏡下剝離毛囊干細胞區，酶消化分離細胞，整個操作過程費時費力，且所分離細胞數量有限。本研究采用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的C57成年及新生小鼠，分離其真皮和表皮，通過酶消化法獲得表皮細胞和真皮細胞，操作更簡便，并且可獲得大量毛囊干細胞；由于新生小鼠真皮細胞易于培養，可體外擴增其毛囊干細胞，以期應用于毛囊再生。我們將成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞、真皮細胞及新生小鼠傳代培養的真皮細胞移植至裸鼠皮下，通過檢測GFP表達觀察毛囊再生情況，為毛囊研究和應用提供實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8周齡成年雌性C57-GFP小鼠3只，體質量20～23 g；6～8周齡Balb/c裸鼠8只，體質量17～21 g；均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。新生1～2 d C57-GFP小鼠3只，體質量1.5～ 2.0 g，由本研究室提供。
DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（Takara公司，日本）；多能聚糖（Versican）抗體、角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）抗體、CK15抗體、CD133抗體（Abcam公司，美國）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（Sigma公司，美國）；波形蛋白（Vimentin）抗體（Cell Signaling公司，美國）；增強GFP（enhanced GFP，EGFP）抗體（Peprotech公司，美國）；PV6001工作液（中杉金橋生物技術有限公司）。倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；脫水機、包埋機、切片機（Thermo公司，美 國）。
1.2 小鼠表皮和真皮細胞分離培養
將C57-GFP新生及成年小鼠頸部脫臼處死，分別取背部皮膚（2 cm×1 cm）/只和（3 cm×2 cm） /只，浸泡于70%乙醇中2～3 min，PBS洗滌；去除皮膚毛發，冰上操作；將皮膚置于70%乙醇浸泡2min×2次，PBS洗滌后，表皮朝上漂浮于0.25%胰蛋白酶消化液中，4℃過夜；取出皮膚放入無菌平皿中，用刀片分離表皮和真皮；于成年小鼠表皮中加入0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化30min（10 mL吸管反復吹打至消化完全），分離表皮細胞，70 μm濾網過濾。于成年小鼠和新生小鼠真皮中加入0.35%Ⅰ型膠原酶37℃消化30 min，DNA酶繼續消化10 min，以500×g離心5 min，分離真皮細胞，PBS洗滌，100 μm濾網過濾[8]；新生小鼠真皮細胞采用含5%FBS、40 ng/mL bFGF、100 U/mL青-鏈霉素、10 μm二甲基乙二酰基甘氨酸的DMEM/F12培養基培養，擴增至第3代。采用熒光顯微鏡觀察成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞（按1∶1比例混合）、成年小鼠原代真皮細胞、新生小鼠第3代真皮細胞激發綠色熒光的情況及細胞形態變化。采用免疫細胞化學檢測培養的新生小鼠第3代真皮細胞中毛囊干細胞標志（真皮鞘細胞標志Vimentin、α-SMA，毛乳頭細胞標志CD133、Versican，毛囊隆突部標志CK-15，以及陰性對照CK-19）的表達。
1.3 裸鼠皮下移植實驗
1.3.1 實驗分組及方法
取Balb/c裸鼠采用乙醚麻醉后，于背中線與兩后肢髖關節連線交叉處皮下移植細胞。實驗分為4組，每組2只裸鼠，分別為移植成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞組（A組）、移植成年小鼠原代真皮細胞組（B組）、移植新生小鼠第3 代真皮細胞組（C組）及注射生理鹽水陰性對照組（D組），A、B、C組移植細胞數均為1×106個。常規飼養并觀察4～6周。
1.3.2 大體觀察
移植后4、5、6周大體觀察各組裸鼠背部細胞移植部位皮膚外觀情況。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
取移植后6周的各組裸鼠移植部位1 cm×1 cm大小皮膚組織，4%甲醛固定，70%、90%、95%、100%乙醇、二甲苯梯度脫水，石蠟包埋，組織切片（片厚4 μm）。切片以二甲苯室溫脫蠟2次，5～10 min/次；100%、90%、70%乙醇梯度入水各5 min；PBS洗滌5 min×3次，檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進行抗原修復，微波10 min；PBS洗滌5 min×3次，加入3%H2O2-甲醇溶液，室溫孵育10 min；PBS洗滌5 min×3次，加入Triton X-100室溫孵育10 min；PBS洗滌5 min×3次，5%～10%正常血清封閉，室溫孵育10 min；棄血清，勿洗；滴加1∶100稀釋的抗GFP一抗，4℃過夜；PBS洗滌5min×3次，加入PV6001工作液，室溫30min；PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色；自來水充分沖洗，脫水透明并封片，倒置顯微鏡下觀察。同時以正常C57-GFP成年小鼠皮膚為陽性對照。
2 結果
2.1 細胞形態觀察及表型檢測
熒光顯微鏡觀察示，分離、培養的C57-GFP新生及成年小鼠表皮及真皮細胞均能激發綠色熒光。C57-GFP成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞、原代真皮細胞均呈圓形，大小不一；新生小鼠第3代真皮細胞多呈梭形，且可見“鋪路石”狀的上皮樣細胞。見圖 1。免疫細胞化學染色示，體外培養的新生小鼠第3代真皮細胞Vimentin、α-SMA均呈強陽性，提示細胞多為真皮鞘細胞；部分細胞表達毛乳頭細胞標志CD133、Versican及毛囊隆突部標志CK-15；CK-19呈陰性表達。見圖 2。
圖1
C57-GFP小鼠表皮細胞及真皮細胞形態學觀察（熒光顯微鏡×100） ? 成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞 ? 成年小鼠原代真皮細胞 ? 新生小鼠第3代真皮細胞 圖 2 C57-GFP新生小鼠第3代真皮細胞免疫細胞化學染色觀察（倒置顯微鏡×100） ? CK-19 ? CK-15 ? CD133 ? Versican ? Vimentin ? α-SMA
Figure1.
Morphology observation of epidermis and dermis cells of C57-GFP mouse (Fluorescence microscope×100) ? Epidermis and dermis mixed cells of adult mouse ? Dermis cells of adult mouse ? Cultured 3rd generation dermis cells of new born mouse Fig. 2 Immunocytochemistry staining observation of cultured 3rd generation dermis cells of new born mouse (Inverted microscope×100) ? CK-19 ? CK-15 ? CD133 ? Versican ? Vimentin ? α-SMA
2.2 裸鼠皮下移植實驗
2.2.1 大體觀察
移植4～6周，A組可見裸鼠細胞移植處皮下呈灰黑色，未見毛發穿出皮膚表面；B、C、D組裸鼠皮膚均未見著色。見圖 3。
圖3
各組裸鼠皮下移植術后6周大體觀察 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 圖 4 各組裸鼠皮下移植術后6周免疫組織化學染色倒置顯微鏡觀察 ? 正常C57-GFP成年小鼠皮膚（×100） ? D組（×100） ? A組毛囊（×200） ? B組外根鞘、真皮鞘（×200） ? C組外根鞘、真皮鞘（×400） ? C組毛乳頭（×400） ? C組汗腺（×400）
Figure3.
Gross observation of the nude mice skin in each group at 6 weeks after transplantation ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D Fig. 4 Immunohistochemistry staining of the nude mice skin in each group at 6 weeks after transplantation (Inverted microscope) ? Skin of normal aldult C57-GFP mouse (×100) ? Group D (×100) ? Hair follicle in group A (×200) ? Outer root sheath and dermal sheath in group B (×200) ? Outer root sheath and dermal sheath in group C (×400) ? Hair papilla in group C (×400) ? Sweat gland in group C (×400)
2.2.2 免疫組織化學染色觀察
正常C57-GFP成年小鼠皮膚GFP表達陽性，D組GFP表達陰性。移植6周后A、B、C組細胞均能夠在裸鼠皮下成活，A組可見GFP呈陽性表達且完整的毛囊結構，同時也可見毛囊外根鞘細胞表達GFP；B組GFP陽性細胞多表達于毛囊真皮鞘、外根鞘；C組GFP陽性細胞主要分布于毛囊真皮鞘、外根鞘、毛乳頭，在汗腺中也有表達。見圖 4。
3 討論
人體的毛發具有重要生理功能和美容價值。近年來受環境、工作壓力等多種因素的影響，脫發人群不斷增加。目前常采用藥物治療、自體毛囊移植等，均具有一定局限性[9]。毛發由皮膚外的毛干和皮膚內毛根組成，毛根外面包裹著毛囊，毛根和毛囊末端膨大形成毛球。毛囊由來源于表皮的內根鞘、外根鞘、毛母質和來源于真皮的真皮鞘、毛乳頭組成。毛發周期性生長的特性，正是皮膚中毛囊干細胞自我更新并誘導分化的結果[10]。
皮膚包括表皮、真皮和附屬器，其中表皮含有角質形成細胞和非角質形成細胞，如黑素細胞、朗格漢斯細胞等；真皮主要由成纖維細胞和結締組織構成，真皮中含有毛囊、皮脂腺和汗腺等皮膚附屬器。表皮中角質形成細胞屬終末分化細胞，分裂能力有限，且不具有分化能力，不能形成皮膚附屬器；而存在于表皮基底層的表皮干細胞雖然具有很強的增殖能力并可形成表皮的各層細胞，但由于其為單潛能干細胞，只能向表皮角質形成細胞分化，不能形成其他皮膚附屬器[11]。而真皮中含有大量毛囊干細胞，其具有多向分化潛能，能夠形成新的毛囊、皮膚及其附屬器[12-14]。有文獻報道毛囊隆突部干細胞在毛囊再生中發揮重要作用[15]。此外，毛囊的真皮乳頭細胞和真皮鞘細胞同樣能夠誘導毛發生長和毛囊再生，真皮鞘細胞和毛乳頭細胞可互相轉化[16-17]。研究提示真皮乳頭細胞與周圍表皮成分相互作用可誘導毛囊再生[18-19]。
毛囊干細胞分離繁瑣、操作依賴解剖顯微鏡，耗費時間長[20]。我們采用C57-GFP小鼠，利用酶消化法分離獲得表皮和真皮細胞，操作更為簡便。熒光顯微鏡觀察示，細胞均能夠激發GFP綠色熒光，可作為細胞移植標記物進行示蹤、檢測；成年小鼠原代真皮-表皮混合細胞、真皮細胞均為圓形，大小不一；毛囊存在于皮膚真皮中，且新生小鼠細胞增殖能力強，易于培養，利用特定培養基擴增3代的真皮細胞多為梭形，推測多為真皮來源的真皮鞘細胞和毛乳頭細胞，也可見少量“鋪路石”狀的上皮樣細胞，可能是毛囊隆突部細胞以及腺細胞。免疫細胞化學檢測毛囊干細胞標志表明，細胞多為真皮鞘細胞，部分細胞表達毛乳頭細胞標志以及表皮來源的毛囊隆突部細胞標志，鼠的毛囊隆突部不表達CK19，作為陰性對照。結果提示真皮細胞中含有大量毛囊干細胞，傳至第3代仍具有干細胞特性。
正常Balb/c裸鼠為T淋巴細胞缺陷鼠，且毛囊角化，毛干萎縮。將成年小鼠真皮-表皮混合細胞（A組）、成年小鼠原代真皮細胞（B組）、新生小鼠第3代真皮細胞（C組）移植于裸鼠皮下4～6周，大體觀察可見A組裸鼠皮下呈黑褐色，但未見毛發長出，可能與裸鼠表皮缺乏相應的調控因子有關；B、C組皮膚外觀與注射生理鹽水組（D組）無差別。石蠟切片免疫組織化學染色結果示，A組呈現 GFP陽性表達的新的、完整的毛囊，且生長方向正常，提示可能是毛囊干細胞與表皮細胞相互作用的結果，同時也可見毛囊結構中部分細胞表達GFP，如毛囊外根鞘細胞等，推測移植的細胞參與了裸鼠毛囊的形成；B組GFP陽性細胞多分布于毛囊真皮鞘、外根鞘；C組GFP陽性細胞則分布于毛囊真皮鞘、毛乳頭、外根鞘，且汗腺中也有表達。同時可見C組毛囊結構較B組更為完整，提示可能是其毛囊干細胞與宿主細胞相互作用形成新的毛囊，且可分化為汗腺。
綜上述，小鼠皮膚的表皮和真皮細胞在裸鼠體內相互作用可形成完整的毛囊結構，而僅移植新鮮分離的原代或體外培養3代的真皮細胞則主要參與毛囊形成。本研究為利用皮膚毛囊干細胞進行毛發再生提供了新的思路，即共移植表皮和真皮細胞更有利于毛囊再生。下一步需要確認真皮中毛囊干細胞的特異性標志，以及表皮中發揮毛囊再生支持作用的細胞類型及其作用機制，為毛發再生治療提供實驗基礎。
