引用本文： 于風旭, 陳永恩, 陳楓, 夏紀毅, 劉洪端, 付勇, 李妙玲, 廖斌. Akt1基因轉染對BMSCs缺氧耐受影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(4): 479-484. doi: 10.7507/1002-1892.20160096 復制
目前，世界范圍內心肌梗死導致的心血管疾病危害嚴重，但預防治療存在明顯不足，探索有效治療方法迫在眉睫。2001年Orlic等[1]報道BMSCs可再生心肌后，干細胞治療心肌梗死成為研究熱點。但在各種干細胞移植治療心肌梗死的研究中，移植后干細胞在缺血、缺氧梗死區的存活率極低[2-3]。因此提高干細胞的耐缺血、缺氧能力可能是改善干細胞移植治療心肌梗死的關鍵。Akt功能涉及細胞周期調控、凋亡的啟動、血管生成、端粒酶活性和細胞侵襲性等諸多方面[4]。在PI3K/Akt途徑中生成的Akt蛋白在PI3K等作用下充分活化，參與介導細胞生長、增殖等[5-6]，其既是細胞存活的信號介質，又是細胞存活的必要因素[7]，持續存在可避免細胞損傷[8]。鑒于此，本研究以BMSCs為種子細胞，Akt1為抗凋亡目的基因，經重組慢病毒（lentivirus，LVs）介導Akt1基因轉染BMSCs，探討在缺氧條件下Akt1是否能提高BMSCs的抗凋亡及增殖能力（即缺氧耐受能力），為提高干細胞移植治療心肌梗死的療效提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3～5周齡SD大鼠20只，雌雄不限，體質量150～200 g，由西南醫科大學實驗動物中心提供。
標準FBS（HyClone公司，美國）；DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）；膜聯蛋白V（Annexin V）-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色試劑盒（寶靈曼公司，德國）；過表達Akt1慢病毒載體[pLVX-增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）-3FLAG]、不含Akt1的病毒載體（pLVX-EGFP）、Polybrene（上海生博生物醫藥科技有限公司）；Akt1多克隆抗體（武漢艾美捷科技有限公司）；兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）多克隆抗體、內參照β-actin（北京博奧生物技術有限公司）。
超凈工作臺（Ibemotol公司，美國）；低溫離心機（Hitachi公司，日本）；三通氣孵育箱（上海力康生物醫療科技控股有限公司）；BX-70倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；S70熒光顯微鏡（Leica Demirb公司，德國）；超低溫冰箱（Thermo公司，美國）；FACSC Alibur流式細胞儀、Kaluza流式細胞儀分析軟件（B&D公司，美國）；臺式高速冷凍離心機（Beckman公司，美國）； Tannon2500凝膠成像掃描系統（Bio-Rad公司，美國）； LabWorks軟件（UVP公司，美國）。
1.2 大鼠BMSCs的分離培養
取SD大鼠頸椎脫臼法處死，將剪下的股骨分別剪去兩端，暴露骨髓腔，吸取5 mL含15%FBS的DMEM培養液，加入10%肝素沖洗骨髓腔3～4 次，吸管吹打混勻，將濾液貼壁輕輕加入至含等體積Percoll分離液（1.073 g/mL）的離心管中，以離心半徑5 cm、2 500 r/min離心20 min；收集單個核細胞于另一離心管中，DMEM/F12培養液離心（離心半徑5cm、1 000 r/min，5 min）洗滌2次；用含15%FBS的DMEM重懸細胞，以（1.5～2.0）×105個/cm2密度接種于培養瓶中，于37℃、5%CO2培養箱中培養。待貼壁細胞達80%～90%融合后，棄培養液，PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶室溫下消化，以1∶2比例傳代，取第3代細胞用于實驗。
1.3 細胞轉染和驗證
1.3.1 細胞轉染
取第3代BMSCs分為3組，分別為空白對照組（A組，不添加任何轉染試劑）、對照組（B組，加入pLVX-EGFP及轉染增強劑Polybrene）、Akt1慢病毒載體組（C組，加入pLVX-EGFP-3FLAG及轉染增強劑Polybrene）。具體步驟：實驗前1 d用PBS清冼BMSCs 2遍，0.25%胰蛋白酶消化后以（3～5）×105個/cm2密度接種至6孔培養板上，每孔1 mL，DMEM培養液培養24 h。B、C組將相應病毒置于冰塊上慢慢融化，根據預實驗結果以感染復數10分別加入11 μL pLVX-EGFP病毒液（滴度為1.81×108 TU/mL）和7 μL pLVX-EGFP-3FLAG病毒液（滴度為2.84×108 TU/mL）；取2 μL Polybrene（1mg/ mL）稀釋至400 μL，B、C組分別加入10 μL；混勻后繼續培養。8～12 h后更換為新鮮DMEM培養基，轉染2～3 d后熒光顯微鏡觀察。
1.3.2 轉染后Western blot法驗證Akt1蛋白表達
取轉染48 h后的B、C組BMSCs，用4℃預冷1×PBS工作液輕柔洗滌細胞2次，0.25%胰蛋白酶消化提純后重復PBS漂洗步驟，提取總蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳法檢測蛋白表達，以驗證Akt1基因是否轉染成功。
1.4 缺氧干預后相關檢測
1.4.1 實驗分組
將上述B、C組培養的BMSCs分別置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱進行缺氧干預（分別為B1、C1組）。
1.4.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡
取缺氧干預0、3、6、9、12 h的B1、C1組BMSCs，PBS洗滌3次，以0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞懸液于離心管中，以離心半徑5cm、1 000 r/min離心10 min，棄上清。調整細胞密度為1×106個/mL，取100μL細胞懸液，用Annexin V-FITC/PI試劑盒行雙染，常規調試流式細胞儀后，激發光波長為488nm，用515 nm波長通帶濾器檢測FITC熒光，560nm波長濾器檢測PI。將對照管非特異熒光的99%以上作為本底扣除，以二維點陣圖顯示，記錄細胞凋亡率和死亡率。在雙變量流式細胞散點圖上，左下象限顯示活細胞（Annex inV-FITC-/PI-），右上象限為死亡細胞（AnnexinV-FITC+/PI+），而右下象限為凋亡細胞（Annexin V-FITC+/PI-），總計分析10 000個細胞。實驗重復3次。
1.4.3 MTT法檢測細胞增殖情況
取B、B1、C、C1組培養0、3、6、9、12 h的細胞，分別于每孔中加入0.5% MTT溶液20 μL，37℃、5%CO2條件下繼續培養4 h；棄培養液，PBS清洗2～3次，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速震蕩10 min，于酶聯免疫檢測儀波長490 nm處測吸光度（A）值，并繪制細胞生長曲線。
1.4.4 Western blot法檢測Caspase-3表達
取缺氧干預0、3、6、9、12 h的B1、C1組細胞，以RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA試劑盒進行蛋白定量，取60～80 μg/孔蛋白質進行10%SDS-PAGE，將電泳分離后的蛋白電轉移至聚偏二氟乙烯膜上，取出膜以5%脫脂奶粉25℃封閉1 h。封閉結束用PBS洗膜1次（10 min），加入活性Caspase-3抗體（1∶1000）及內參抗β-actin抗體（1∶2 000），4℃反應過夜；PBS洗膜3次（15 min 1次、5 min 2 次），加入辣根過氧化物酶標記抗兔IgG（1∶3000）搖床1 h；PBS洗膜3次（每次5 min），增強化學發光試劑ECL顯色。以Quantity One圖像分析軟件對結果進行分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較以及組內各時間點間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察
骨髓單個核細胞接種于培養瓶后呈圓形，大小不一，懸浮于培養液中；24 h后部分細胞開始貼壁，呈球形或梭形；3 d后可見少量梭形、星形或紡錘形細胞分散貼壁生長，伸出偽足呈逗點狀或短棒狀；7 d后細胞集落呈放射狀排列，有參差不齊、粗細不一的突起伸出，細胞核較大，核仁清晰可見，混有較多雜質；約14 d細胞融合達80%～90%，呈漩渦狀。傳代細胞貼壁快，24 h內全部貼壁、伸展，增殖迅速，均勻分布生長；5～6 d細胞貼壁融合率達80%～90%，形態均一，呈長梭形，鋪滿培養皿形成單層，呈“魚群狀”排列。見圖 1。
圖1
大鼠BMSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代培養7 d ? 原代培養14 d ? 第3代細胞培養5 d 圖 2 B、C組細胞轉染后熒光顯微鏡觀察（×100） ? B組 ? C組 圖 3 Western blot 檢測轉染48 h后B、C組Akt1蛋白表達 1：C組 2：B組 圖 4 流式細胞儀檢測缺氧干預各時間點B1、C1組細胞凋亡及死亡情況 ? B1組0 h ? B1組3 h ? B1組6 h ? B1組9 h ? B1組12h ? C1組0 h ? C1組3 h ? C1組6 h ? C1組9 h ? C1組12 h
Figure1.
Morphological observation of rat BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ? Primary BMSCs cultured for 7 days ? Primary BMSCs cultured for 14 days ? The 3rd generation BMSCs cultured for 5 days Fig. 2 Fluorescence microscope observation of BMSCs in groups B and C after transfection (×100) ? Group B ? Group C Fig. 3 Akt1 protein expression in groups B and C at 48 hours after transfecion by Western blot 1: Group C 2: Group B Fig. 4 Apoptosis and cell death observation of groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention by flow cytometry ? Group B1 at 0 hour ? Group B1 at 3 hours ? Group B1 at 6 hours ? Group B1 at 9 hours ? Group B1 at 12 hours ? Group C1 at 0 hour ? Group C1 at 3 hours ? Group C1 at 6 hours ? Group C1 at 9 hours ? Group C1 at 12 hours
2.2 細胞轉染后熒光顯微鏡觀察及蛋白檢測
轉染后A組均未見綠色熒光表達；B、C組可見表達量較高的綠色熒光，轉染率約60%。見圖 2。Western blot檢測示，轉染后48 h，C組可見Akt1蛋白條帶表達，B組條帶表達很微弱（圖 3）。C組灰度值為33.76±0.42，顯著高于B組的23.40±0.34，差異有統計學意義（t=17.525，P=0.013）。
2.3 缺氧干預后相關檢測
2.3.1 流式細胞儀檢測細胞凋亡率和死亡率
組內比較：B1組缺氧干預后各時間點細胞凋亡率和死亡率均逐漸增高，各時間點間比較差異有統計學意義（P<0.05）；C1組細胞凋亡率和死亡率在缺氧干預后3 h短暫下降，之后隨時間延長逐漸增高，各時間點間比較差異有統計學意義（P<0.05）。組間比較：除0h B1、C1組間比較細胞凋亡率和死亡率差異無統計學意義（t=1.009，P=0.185；t=1.380，P=0.119）外，其余各時間點C1組細胞凋亡率和死亡率均顯著低于 B1組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4，表 1、2。
表1
缺氧干預各時間點B1、C1組細胞凋亡率比較（n=3，%，
表2
缺氧干預各時間點B1、C1細胞死亡率比較（n=3，%，2.3.2 MTT法檢測細胞增殖情況
B、C組各時間點A值均顯著高于B1、C1組，差異有統計學意義（P<0.05）；C組各時間點A值均顯著高于B組，差異有統計學意義（P<0.05）；B1組缺氧干預后6、9、12 h A值顯著低于C1組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
常氧和缺氧培養各時間點各組細胞生長曲線 圖 6 Western blot檢測B1、C1組缺氧干預各時間點Caspase-3表達 1：0 h 2：3 h 3：6 h 4：9 h 5：12 h 圖 7 Western blot檢測B1、C1組缺氧干預各時間點Caspase-3相對表達量
Figure5.
Cell growth curve at each time point under normoxia and hypoxia conditions Fig. 6 Caspase-3 expression in groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention 1: 0 h 2: 3 h 3: 6 h 4: 9 h 5: 12 h Fig. 7 Relative expression of Caspase-3 in groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention
2.3.3 Western blot法檢測Caspase-3表達
缺氧干預后B1組Caspase-3表達明顯上調，3 h時Caspase-3表達達峰值，顯著高于其余各時間點，差異有統計學意義（P<0.05），隨時間推移逐漸下調；而C1組缺氧干預后Caspase-3表達呈先緩慢上升后下降趨勢，各時間點間比較差異無統計學意義（P>0.05）。與B1組比較，除0h外C1組缺氧干預后各時間點Caspase-3表達均顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 6、7。
3 討論
急性心肌梗死是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死，臨床表現多有劇烈而持久的胸骨后疼痛，可并發惡性心律失常、休克或心力衰竭，已成為全球首位死因。目前的標準療法包括藥物治療（溶栓）、介入治療（支架植入）和外科手術（冠狀動脈搭橋），這些方法雖然能改善患者癥狀甚至實現冠狀動脈的血運重建，但不能使已死亡的心肌細胞獲得再生[9]。理論上最理想的治療方法是重生梗死區域心肌細胞，目前研究最多的是干細胞移植。BMSCs因具有取材方便、低免疫原性、多向分化潛能和增殖能力、無倫理學問題并且無致癌性等優點[10]，是目前使用最多的組織工程種子細 胞。
Perin等[11]將BMSCs移植于14例慢性心肌梗死患者，證實干細胞移植能改善心肌血供和左心室功能。Chen等[12]應用自體血清培養的BMSCs移植至經皮冠脈介入術后18 d的患者，隨訪3個月發現BMSCs移植可明顯改善左心室功能，SPECT掃描顯示移植組的灌注缺損比未移植對照組顯著改善。但移植干細胞的低存活率是公認難題，因此，Moon等[13]通過VEGF基因轉染BMSCs同種異體移植治療大鼠急性心肌梗死，結果表明轉染加細胞移植對大鼠心功能改善優于單純細胞移植，可能與VEGF的新生血管作用提高了移植細胞存活率有關。Mangi等[14]在體外應用反轉錄病毒轉導Akt1前體基因對BMSCs進行修飾并移植至大鼠缺血心肌中，引起梗死心肌再生而使梗死面積減小，心臟功能幾乎恢復至正常水平，但其具體機制尚不清楚。鑒于Akt既是細胞存活的信號介質又是細胞存活的必要因素[15]，本研究選擇Akt基因作為目的基因，通過對分裂細胞和非分裂細胞均具有很好的感染能力，且能將目的基因整合到細胞核，使其具有長效穩定表達能力[16-18]的LVs作為載體轉染BMSCs，觀察其可否減少BMSCs的凋亡和死亡，從而為通過干細胞修飾提高BMSCs治療心肌梗死的效果提供依據。
我們在預實驗中發現脂質體介導轉染Akt1基因在轉染后不能形成穩定有效的表達，且隨時間推移轉染后熒光表達水平逐漸減弱。故本研究選擇LVs作為轉染載體，結果顯示Akt1基因成功轉入BMSCs內，并穩定表達綠色熒光。通過流式細胞儀及MTT檢測分析發現，轉染Akt1基因的BMSCs較未轉染的BMSCs在缺氧條件下能顯著抑制細胞凋亡并促進細胞增殖，說明Akt1基因能提高BMSCs的缺氧耐受。Caspase家族是細胞凋亡過程中的關鍵元件，其激活與超常表達均會引起細胞凋亡，因此又稱為死亡蛋白酶，可通過與眾多蛋白因子的相互作用調控細胞凋亡[19]。Caspase-3是處于凋亡反應的下游元件，是最重要的效應型Caspase，是Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一。本實驗通過Western blot檢測凋亡相關因子Caspase-3的表達水平發現，缺氧條件下未轉染Akt1基因的細胞Caspase-3表達水平明顯上調，且呈時間依耐性，轉染Akt1基因的BMSCs較未轉染的BMSCs在缺氧干預各時間點Caspase-3表達水平明顯下調。進一步說明Akt1基因在缺氧條件下能通過抑制凋亡相關因子的表達而抑制細胞凋亡。
綜上述，本研究提示Akt1基因轉染BMSCs可顯著提高BMSCs的缺氧耐受能力，可能是通過轉染Akt1基因提高BMSCs移植后存活率，從而提高了干細胞移植治療急性心肌梗死的療效。另外，Akt1基因轉染BMSCs提高BMSCs耐缺氧能力可能涉及到改善BMSCs缺氧時攝糖改變等方面，均有待進一步研究明確。
目前，世界范圍內心肌梗死導致的心血管疾病危害嚴重，但預防治療存在明顯不足，探索有效治療方法迫在眉睫。2001年Orlic等[1]報道BMSCs可再生心肌后，干細胞治療心肌梗死成為研究熱點。但在各種干細胞移植治療心肌梗死的研究中，移植后干細胞在缺血、缺氧梗死區的存活率極低[2-3]。因此提高干細胞的耐缺血、缺氧能力可能是改善干細胞移植治療心肌梗死的關鍵。Akt功能涉及細胞周期調控、凋亡的啟動、血管生成、端粒酶活性和細胞侵襲性等諸多方面[4]。在PI3K/Akt途徑中生成的Akt蛋白在PI3K等作用下充分活化，參與介導細胞生長、增殖等[5-6]，其既是細胞存活的信號介質，又是細胞存活的必要因素[7]，持續存在可避免細胞損傷[8]。鑒于此，本研究以BMSCs為種子細胞，Akt1為抗凋亡目的基因，經重組慢病毒（lentivirus，LVs）介導Akt1基因轉染BMSCs，探討在缺氧條件下Akt1是否能提高BMSCs的抗凋亡及增殖能力（即缺氧耐受能力），為提高干細胞移植治療心肌梗死的療效提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3～5周齡SD大鼠20只，雌雄不限，體質量150～200 g，由西南醫科大學實驗動物中心提供。
標準FBS（HyClone公司，美國）；DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）；膜聯蛋白V（Annexin V）-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色試劑盒（寶靈曼公司，德國）；過表達Akt1慢病毒載體[pLVX-增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）-3FLAG]、不含Akt1的病毒載體（pLVX-EGFP）、Polybrene（上海生博生物醫藥科技有限公司）；Akt1多克隆抗體（武漢艾美捷科技有限公司）；兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）多克隆抗體、內參照β-actin（北京博奧生物技術有限公司）。
超凈工作臺（Ibemotol公司，美國）；低溫離心機（Hitachi公司，日本）；三通氣孵育箱（上海力康生物醫療科技控股有限公司）；BX-70倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；S70熒光顯微鏡（Leica Demirb公司，德國）；超低溫冰箱（Thermo公司，美國）；FACSC Alibur流式細胞儀、Kaluza流式細胞儀分析軟件（B&D公司，美國）；臺式高速冷凍離心機（Beckman公司，美國）； Tannon2500凝膠成像掃描系統（Bio-Rad公司，美國）； LabWorks軟件（UVP公司，美國）。
1.2 大鼠BMSCs的分離培養
取SD大鼠頸椎脫臼法處死，將剪下的股骨分別剪去兩端，暴露骨髓腔，吸取5 mL含15%FBS的DMEM培養液，加入10%肝素沖洗骨髓腔3～4 次，吸管吹打混勻，將濾液貼壁輕輕加入至含等體積Percoll分離液（1.073 g/mL）的離心管中，以離心半徑5 cm、2 500 r/min離心20 min；收集單個核細胞于另一離心管中，DMEM/F12培養液離心（離心半徑5cm、1 000 r/min，5 min）洗滌2次；用含15%FBS的DMEM重懸細胞，以（1.5～2.0）×105個/cm2密度接種于培養瓶中，于37℃、5%CO2培養箱中培養。待貼壁細胞達80%～90%融合后，棄培養液，PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶室溫下消化，以1∶2比例傳代，取第3代細胞用于實驗。
1.3 細胞轉染和驗證
1.3.1 細胞轉染
取第3代BMSCs分為3組，分別為空白對照組（A組，不添加任何轉染試劑）、對照組（B組，加入pLVX-EGFP及轉染增強劑Polybrene）、Akt1慢病毒載體組（C組，加入pLVX-EGFP-3FLAG及轉染增強劑Polybrene）。具體步驟：實驗前1 d用PBS清冼BMSCs 2遍，0.25%胰蛋白酶消化后以（3～5）×105個/cm2密度接種至6孔培養板上，每孔1 mL，DMEM培養液培養24 h。B、C組將相應病毒置于冰塊上慢慢融化，根據預實驗結果以感染復數10分別加入11 μL pLVX-EGFP病毒液（滴度為1.81×108 TU/mL）和7 μL pLVX-EGFP-3FLAG病毒液（滴度為2.84×108 TU/mL）；取2 μL Polybrene（1mg/ mL）稀釋至400 μL，B、C組分別加入10 μL；混勻后繼續培養。8～12 h后更換為新鮮DMEM培養基，轉染2～3 d后熒光顯微鏡觀察。
1.3.2 轉染后Western blot法驗證Akt1蛋白表達
取轉染48 h后的B、C組BMSCs，用4℃預冷1×PBS工作液輕柔洗滌細胞2次，0.25%胰蛋白酶消化提純后重復PBS漂洗步驟，提取總蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳法檢測蛋白表達，以驗證Akt1基因是否轉染成功。
1.4 缺氧干預后相關檢測
1.4.1 實驗分組
將上述B、C組培養的BMSCs分別置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱進行缺氧干預（分別為B1、C1組）。
1.4.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡
取缺氧干預0、3、6、9、12 h的B1、C1組BMSCs，PBS洗滌3次，以0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞懸液于離心管中，以離心半徑5cm、1 000 r/min離心10 min，棄上清。調整細胞密度為1×106個/mL，取100μL細胞懸液，用Annexin V-FITC/PI試劑盒行雙染，常規調試流式細胞儀后，激發光波長為488nm，用515 nm波長通帶濾器檢測FITC熒光，560nm波長濾器檢測PI。將對照管非特異熒光的99%以上作為本底扣除，以二維點陣圖顯示，記錄細胞凋亡率和死亡率。在雙變量流式細胞散點圖上，左下象限顯示活細胞（Annex inV-FITC-/PI-），右上象限為死亡細胞（AnnexinV-FITC+/PI+），而右下象限為凋亡細胞（Annexin V-FITC+/PI-），總計分析10 000個細胞。實驗重復3次。
1.4.3 MTT法檢測細胞增殖情況
取B、B1、C、C1組培養0、3、6、9、12 h的細胞，分別于每孔中加入0.5% MTT溶液20 μL，37℃、5%CO2條件下繼續培養4 h；棄培養液，PBS清洗2～3次，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速震蕩10 min，于酶聯免疫檢測儀波長490 nm處測吸光度（A）值，并繪制細胞生長曲線。
1.4.4 Western blot法檢測Caspase-3表達
取缺氧干預0、3、6、9、12 h的B1、C1組細胞，以RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA試劑盒進行蛋白定量，取60～80 μg/孔蛋白質進行10%SDS-PAGE，將電泳分離后的蛋白電轉移至聚偏二氟乙烯膜上，取出膜以5%脫脂奶粉25℃封閉1 h。封閉結束用PBS洗膜1次（10 min），加入活性Caspase-3抗體（1∶1000）及內參抗β-actin抗體（1∶2 000），4℃反應過夜；PBS洗膜3次（15 min 1次、5 min 2 次），加入辣根過氧化物酶標記抗兔IgG（1∶3000）搖床1 h；PBS洗膜3次（每次5 min），增強化學發光試劑ECL顯色。以Quantity One圖像分析軟件對結果進行分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較以及組內各時間點間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察
骨髓單個核細胞接種于培養瓶后呈圓形，大小不一，懸浮于培養液中；24 h后部分細胞開始貼壁，呈球形或梭形；3 d后可見少量梭形、星形或紡錘形細胞分散貼壁生長，伸出偽足呈逗點狀或短棒狀；7 d后細胞集落呈放射狀排列，有參差不齊、粗細不一的突起伸出，細胞核較大，核仁清晰可見，混有較多雜質；約14 d細胞融合達80%～90%，呈漩渦狀。傳代細胞貼壁快，24 h內全部貼壁、伸展，增殖迅速，均勻分布生長；5～6 d細胞貼壁融合率達80%～90%，形態均一，呈長梭形，鋪滿培養皿形成單層，呈“魚群狀”排列。見圖 1。
圖1
大鼠BMSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代培養7 d ? 原代培養14 d ? 第3代細胞培養5 d 圖 2 B、C組細胞轉染后熒光顯微鏡觀察（×100） ? B組 ? C組 圖 3 Western blot 檢測轉染48 h后B、C組Akt1蛋白表達 1：C組 2：B組 圖 4 流式細胞儀檢測缺氧干預各時間點B1、C1組細胞凋亡及死亡情況 ? B1組0 h ? B1組3 h ? B1組6 h ? B1組9 h ? B1組12h ? C1組0 h ? C1組3 h ? C1組6 h ? C1組9 h ? C1組12 h
Figure1.
Morphological observation of rat BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ? Primary BMSCs cultured for 7 days ? Primary BMSCs cultured for 14 days ? The 3rd generation BMSCs cultured for 5 days Fig. 2 Fluorescence microscope observation of BMSCs in groups B and C after transfection (×100) ? Group B ? Group C Fig. 3 Akt1 protein expression in groups B and C at 48 hours after transfecion by Western blot 1: Group C 2: Group B Fig. 4 Apoptosis and cell death observation of groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention by flow cytometry ? Group B1 at 0 hour ? Group B1 at 3 hours ? Group B1 at 6 hours ? Group B1 at 9 hours ? Group B1 at 12 hours ? Group C1 at 0 hour ? Group C1 at 3 hours ? Group C1 at 6 hours ? Group C1 at 9 hours ? Group C1 at 12 hours
2.2 細胞轉染后熒光顯微鏡觀察及蛋白檢測
轉染后A組均未見綠色熒光表達；B、C組可見表達量較高的綠色熒光，轉染率約60%。見圖 2。Western blot檢測示，轉染后48 h，C組可見Akt1蛋白條帶表達，B組條帶表達很微弱（圖 3）。C組灰度值為33.76±0.42，顯著高于B組的23.40±0.34，差異有統計學意義（t=17.525，P=0.013）。
2.3 缺氧干預后相關檢測
2.3.1 流式細胞儀檢測細胞凋亡率和死亡率
組內比較：B1組缺氧干預后各時間點細胞凋亡率和死亡率均逐漸增高，各時間點間比較差異有統計學意義（P<0.05）；C1組細胞凋亡率和死亡率在缺氧干預后3 h短暫下降，之后隨時間延長逐漸增高，各時間點間比較差異有統計學意義（P<0.05）。組間比較：除0h B1、C1組間比較細胞凋亡率和死亡率差異無統計學意義（t=1.009，P=0.185；t=1.380，P=0.119）外，其余各時間點C1組細胞凋亡率和死亡率均顯著低于 B1組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4，表 1、2。
表1
缺氧干預各時間點B1、C1組細胞凋亡率比較（n=3，%，
表2
缺氧干預各時間點B1、C1細胞死亡率比較（n=3，%，2.3.2 MTT法檢測細胞增殖情況
B、C組各時間點A值均顯著高于B1、C1組，差異有統計學意義（P<0.05）；C組各時間點A值均顯著高于B組，差異有統計學意義（P<0.05）；B1組缺氧干預后6、9、12 h A值顯著低于C1組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
常氧和缺氧培養各時間點各組細胞生長曲線 圖 6 Western blot檢測B1、C1組缺氧干預各時間點Caspase-3表達 1：0 h 2：3 h 3：6 h 4：9 h 5：12 h 圖 7 Western blot檢測B1、C1組缺氧干預各時間點Caspase-3相對表達量
Figure5.
Cell growth curve at each time point under normoxia and hypoxia conditions Fig. 6 Caspase-3 expression in groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention 1: 0 h 2: 3 h 3: 6 h 4: 9 h 5: 12 h Fig. 7 Relative expression of Caspase-3 in groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention
2.3.3 Western blot法檢測Caspase-3表達
缺氧干預后B1組Caspase-3表達明顯上調，3 h時Caspase-3表達達峰值，顯著高于其余各時間點，差異有統計學意義（P<0.05），隨時間推移逐漸下調；而C1組缺氧干預后Caspase-3表達呈先緩慢上升后下降趨勢，各時間點間比較差異無統計學意義（P>0.05）。與B1組比較，除0h外C1組缺氧干預后各時間點Caspase-3表達均顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 6、7。
3 討論
急性心肌梗死是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死，臨床表現多有劇烈而持久的胸骨后疼痛，可并發惡性心律失常、休克或心力衰竭，已成為全球首位死因。目前的標準療法包括藥物治療（溶栓）、介入治療（支架植入）和外科手術（冠狀動脈搭橋），這些方法雖然能改善患者癥狀甚至實現冠狀動脈的血運重建，但不能使已死亡的心肌細胞獲得再生[9]。理論上最理想的治療方法是重生梗死區域心肌細胞，目前研究最多的是干細胞移植。BMSCs因具有取材方便、低免疫原性、多向分化潛能和增殖能力、無倫理學問題并且無致癌性等優點[10]，是目前使用最多的組織工程種子細 胞。
Perin等[11]將BMSCs移植于14例慢性心肌梗死患者，證實干細胞移植能改善心肌血供和左心室功能。Chen等[12]應用自體血清培養的BMSCs移植至經皮冠脈介入術后18 d的患者，隨訪3個月發現BMSCs移植可明顯改善左心室功能，SPECT掃描顯示移植組的灌注缺損比未移植對照組顯著改善。但移植干細胞的低存活率是公認難題，因此，Moon等[13]通過VEGF基因轉染BMSCs同種異體移植治療大鼠急性心肌梗死，結果表明轉染加細胞移植對大鼠心功能改善優于單純細胞移植，可能與VEGF的新生血管作用提高了移植細胞存活率有關。Mangi等[14]在體外應用反轉錄病毒轉導Akt1前體基因對BMSCs進行修飾并移植至大鼠缺血心肌中，引起梗死心肌再生而使梗死面積減小，心臟功能幾乎恢復至正常水平，但其具體機制尚不清楚。鑒于Akt既是細胞存活的信號介質又是細胞存活的必要因素[15]，本研究選擇Akt基因作為目的基因，通過對分裂細胞和非分裂細胞均具有很好的感染能力，且能將目的基因整合到細胞核，使其具有長效穩定表達能力[16-18]的LVs作為載體轉染BMSCs，觀察其可否減少BMSCs的凋亡和死亡，從而為通過干細胞修飾提高BMSCs治療心肌梗死的效果提供依據。
我們在預實驗中發現脂質體介導轉染Akt1基因在轉染后不能形成穩定有效的表達，且隨時間推移轉染后熒光表達水平逐漸減弱。故本研究選擇LVs作為轉染載體，結果顯示Akt1基因成功轉入BMSCs內，并穩定表達綠色熒光。通過流式細胞儀及MTT檢測分析發現，轉染Akt1基因的BMSCs較未轉染的BMSCs在缺氧條件下能顯著抑制細胞凋亡并促進細胞增殖，說明Akt1基因能提高BMSCs的缺氧耐受。Caspase家族是細胞凋亡過程中的關鍵元件，其激活與超常表達均會引起細胞凋亡，因此又稱為死亡蛋白酶，可通過與眾多蛋白因子的相互作用調控細胞凋亡[19]。Caspase-3是處于凋亡反應的下游元件，是最重要的效應型Caspase，是Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一。本實驗通過Western blot檢測凋亡相關因子Caspase-3的表達水平發現，缺氧條件下未轉染Akt1基因的細胞Caspase-3表達水平明顯上調，且呈時間依耐性，轉染Akt1基因的BMSCs較未轉染的BMSCs在缺氧干預各時間點Caspase-3表達水平明顯下調。進一步說明Akt1基因在缺氧條件下能通過抑制凋亡相關因子的表達而抑制細胞凋亡。
綜上述，本研究提示Akt1基因轉染BMSCs可顯著提高BMSCs的缺氧耐受能力，可能是通過轉染Akt1基因提高BMSCs移植后存活率，從而提高了干細胞移植治療急性心肌梗死的療效。另外，Akt1基因轉染BMSCs提高BMSCs耐缺氧能力可能涉及到改善BMSCs缺氧時攝糖改變等方面，均有待進一步研究明確。
