引用本文： 張凱彬, 石晶, 李楊, 蔣逸秋, 丁朋, 楊曉霏, 桂鑒超. 大鼠軟骨非全層損傷模型的建立及活化細胞與整合素β1表達關系的研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(4): 432-439. doi: 10.7507/1002-1892.20160087 復制
骨關節炎是臨床常見病，隨著老齡化社會的到來，其發病率日趨升高。骨關節炎的早期組織改變是從軟骨層表面的破壞開始，因此研究軟骨的非全層損傷（未及軟骨下骨）對骨關節炎的早期診斷和治療具有重要意義[1]。有研究發現體外培養的軟骨組織塊表面可見一種不同于軟骨細胞表型的軟骨前體細胞，其活化可能與軟骨損傷有關[2-3]。本研究采用軟骨劃痕的方法造成大鼠軟骨非全層損傷模型，從組織形態學、免疫病理學等角度觀察損傷周圍軟骨基質和細胞變化，并探究細胞活化與整合素β1表達間的關系，從而為骨關節炎的早期診斷和治療提供新的臨床思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級10周齡SD雄性大鼠45只，體質量300～400 g，由南京醫科大學附屬南京醫院動物實驗中心提供。
HE染色試劑盒、番紅O染色試劑盒、BrdU、鼠抗BrdU單克隆抗體、FITC標記山羊抗兔免疫球蛋白IgG（南京凱基生物科技發展有限公司）；CD105兔抗鼠單克隆抗體、整合素β1兔抗鼠單克隆抗體（Abcam公司，英國）；0.25%胰蛋白酶、20%EDTA、鏈霉素、PBS（上海基星試劑公司）。眼科無菌手術刀片（上海浦東金環醫療用品公司）；RM 2135石蠟切片機、EG 1140H包埋機（Leica公司，德國）；光學顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 實驗分組及造模方法
隨機將45只大鼠分為手術組、假手術組和對照組3 組，每組15只。所有大鼠以水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，手術組和假手術組選取右膝關節，沿髕韌帶內側緣切開長約1 cm皮膚，切開關節囊，將髕骨向外側脫位，暴露股骨髁負重區。手術組用手術刀片在兩側股骨髁負重區沿矢狀位分別劃痕2次，深度以無出血為止（圖 1）；假手術組不行劃痕。兩組髕骨復位及生理鹽水清洗傷口后，用5-0可吸收線單獨縫合關節囊，5-0絲線間斷縫合皮膚。對照組未作任何處理。術后各組立即皮下注射5 mg/mL BrdU 1mL，待大鼠清醒后分籠飼養，讓其自由活動及進食。術后腹腔注射青霉素（10萬U/只） 抗感染，每天1次，連續注射3 d。
圖1
手術組軟骨非全層損傷模型造模過程 ? 暴露股骨髁負重區 ? 劃痕2次造模 圖 2 各組術后各時間點大體觀察 ? 手術組1d ? 手術組7 d ? 手術組14 d ? 假手術組1 d ? 假手術組7 d ? 假手術組14 d ? 對照組1 d ? 對照組7 d ? 對照組14 d 圖 3 各組術后各時間點組織學觀察（HE×400） ? 手術組1 d ? 手術組7 d ? 手術組14 d ? 假手術組7 d ? 對照組14 d
Figure1.
The establishing process of the partial-thickness articular cartilage injury model in operated group ? Exposure of the weight-bearing area of femoral condyle ? Model establishment of two linear cartilage defects using an ophthalmic knife Fig. 2 Macroscopic observation of each group at different time points ? Operated group at 1 day ? Operated group at 7 days ? Operated group at 14 days ? Sham-operated group at 1day ? Sham-operated group at 7 days ? Sham-operated group at 14 days ? Control group at 1 day ? Control group at 7days ? Control group at 14 days Fig. 3 Histological observation of each group at different time points (HE×400) ? Operated group at 1day ? Operated group at 7 days ? Operated group at 14 days ? Sham-operated group at 7 days ? Control group at 14 days
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察各組大鼠飲食、活動及傷口等情況。術后1、7、14 d各組分別處死5只大鼠，取右股骨下段，清除右膝關節周圍的軟組織及韌帶，病理取材后大體觀察關節面的光滑度及色澤，表面劃痕是否明顯，劃痕周圍軟骨是否有軟化、纖維化，及軟骨下骨是否裸露等情況。
1.3.2 組織學觀察
取各組各時間點樣本，生理鹽水沖洗，置于100 g/L多聚甲醛4℃固定48 h；5%稀硝酸脫鈣3～4 d，70%、80%、90%、100%乙醇逐級脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，石蠟包埋，沿膝關節橫斷面切片，制備5 μm厚組織切片。常規行HE染色和番紅O染色，光鏡下觀察。采用改良組織學評分[4]評估HE染色結果，評價各時間點各組軟骨損傷情況；每個標本隨機選取4個區域，利用Photoshop CS分析軟件分析番紅O染色切片的灰度值。
1.3.3 免疫熒光染色觀察
取各組各時間點切片，脫蠟至水，用0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min× 3 次。①部分切片加入2 mol/L HCl 50μL，37℃孵育30min，0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min×3 次；加入0.25%胰蛋白酶50 μL，37℃孵育10 min，室溫下血清封閉10 min；加入鼠抗BrdU單克隆抗體（1∶200），37℃避光孵育30 min；0.01mol/ L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察BrdU染色情況。②部分切片加入3%H2O2 5min阻斷內源性過氧化物酶活性，滴加0.4%胃蛋白酶（pH2）濕盒孵育10 min修復抗原，室溫下血清封閉10 min；滴加CD105兔抗鼠單克隆抗體（1∶200）、4℃過夜；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，滴加二抗FITC標記山羊抗兔免疫球蛋白IgG（1∶100），37℃避光孵育2 h；0.01mol/ L PBS（pH7.4）漂洗5min×3 次，防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察CD105染色情況。每張切片隨機選取不同的4個區域，采用標準雙盲法計數每高倍鏡視野陽性細胞，取均值。③部分切片在抗原修復后，同時滴加CD105兔抗鼠單克隆抗體（1∶200）和整合素β1兔抗鼠單克隆抗體（1∶200），4℃過夜；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，滴加二抗FITC標記山羊抗兔免疫球蛋白IgG（1∶100），37℃避光孵育2 h；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min×3次，防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察CD105/整合素β1雙標記染色情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后30 min～1 h所有大鼠蘇醒，能自由活動右下肢，大鼠的飲食、活動、體質量增長等指標正常。術后未見傷口感染及關節腫脹、步態不對稱等異常狀況，各組均未見大鼠異常死亡。
手術組膝關節滑膜輕度充血增生，無纖維素性滲出，滑液分泌量正常，透明；軟骨呈淡藍白色，劃痕明顯，劃痕周圍軟骨欠光滑，非透明，有軟骨軟化、纖維化改變，且隨造模時間延長逐漸加重；未見關節面缺損，無骨贅形成。假手術組膝關節滑膜輕度充血增生，無纖維素性滲出，滑液分泌量正常，透明；軟骨呈藍白色透明狀，關節面稍粗糙，無軟化、纖維化改變，未見裂隙裂紋形成，各時間點基本一致；未見關節面缺損，無骨贅形成。對照組膝關節滑膜未見充血增生，無纖維素性滲出，滑液分泌量正常，透明；軟骨呈透明白色，關節面平整，無軟化、纖維化改變，未見裂隙裂紋形成；未見軟骨面缺損，無骨贅形成。見圖 2。
2.2 組織學觀察
2.2.1 HE染色
手術組在劃痕底部見凋亡壞死軟骨細胞，劃痕周圍見細胞數增多，大小不等，排列分布不均，且隨造模時間延長逐漸明顯；有細胞簇集現象，細胞核染色深淺不一；未劃痕處軟骨層表面光滑，軟骨層變薄，潮線完整。假手術組各時間點均未見凋亡軟骨細胞，軟骨層變薄，表層完整無缺如，細胞大小均勻，細胞核染色均勻，排列有序，無軟骨細胞簇集，潮線規則。對照組各時間點均未見凋亡壞死軟骨細胞，細胞大小均勻，排列較整齊呈柱狀，層次清楚，無簇集軟骨細胞，細胞核染色均勻，潮線完整。見圖 3。
手術組術后各時間點改良組織學評分均顯著高于假手術組及對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；假手術組和對照組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。各組組內各時間點間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
各組術后各時間點HE染色改良組織學評分比較（n=5，2.2.2 番紅O染色
手術組各時間點染色欠均勻，著色貫穿軟骨全層，劃痕周圍區域著色較淺，隨造模時間延長，著色深淺無顯著變化；假手術組和對照組各時間點染色均勻，著色貫穿軟骨全層，濃度適中，無失染。見圖 4。術后各時間點各組間比較以及各組內各時間點間比較灰度值，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
圖4
各組術后各時間點組織學觀察（番紅O×400 ? 手術組1 d ? 手術組14 d ? 假手術組14 d ? 對照組14 d 圖 5 各組術后14 d BrdU免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡 ×400） 箭頭示BrdU 陽性細胞 ? 手術組 ? 假手術組 ? 對照組 圖 6 各組術后14 d CD105免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400） 箭頭示CD105陽性細胞 ? 手術組 ? 假手術組 ? 對照組 圖 7 各組術后各時間點CD105/整合素β1雙熒光標記染色觀察（熒光顯微鏡×400） 箭頭示CD105和整合素β1雙染標記陽性細胞 ? 手術組1 d ? 手術組14 d ? 假手術組14 d ? 對照組14 d
Figure4.
Histological observation of each group at different time points (Safranin O×400) ? Operated group at 1 day ? Operated group at 14 days ? Sham-operated group at 14 days ? Control group at 14 days Fig. 5 BrdU immunofluorescence staining in 3 groups at 14days (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated BrdU-positive cells ? Operated group ? Sham-operated group ? Control group Fig. 6 CD105 immunofluorescence staining in 3 groups at 14 days (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated CD105-positive cells ? Operated group ? Sham-operated group ? Control group Fig. 7 CD105/integrin β1 double immunofluorescence staining in 3groups at different time points (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated CD105/integrin β1 double positive cells Operated group at 1day ? Operated group at 14 days ? Sham-operated group at 14 days ? Control group at 14 days
表2
各組術后各時間點番紅O染色灰度值比較（n=5，2.3 免疫熒光染色觀察
BrdU免疫熒光染色示，手術組可見軟骨層綠色熒光反應強烈，劃痕周圍稍多，有向劃痕聚集傾向，陽性細胞排列紊亂、分布不均，隨造模時間延長更加顯著；假手術組及對照組各時間點綠色熒光反應強烈，無明顯聚集現象，陽性細胞排列分布均勻。見圖 5。
CD105免疫熒光染色示，手術組在劃痕周圍有較多顆粒狀綠色熒光，陽性細胞聚集、大小不一、分布不均，隨造模時間延長細胞聚集現象更加明顯，位置與HE染色標本細胞聚集位置基本一致；假手術組及對照組各時間點均見軟骨層少量綠色熒光，反應較弱，陽性細胞排列均勻。見圖 6。手術組術后各時間點CD105陽性細胞數均顯著多于假手術組和對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；假手術組和對照組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。手術組隨造模時間延長，CD105陽性細胞數逐漸增多，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）；假手術組和對照組內各時間點間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
表3
各組術后各時間點CD105陽性細胞數比較（n=5，個/HP ，CD105/整合素β1雙熒光標記染色示，手術組有大量細胞共表達CD105和整合素β1，以劃痕周圍處明顯，雙染標記陽性細胞大小不一、分布不均，隨造模時間延長陽性細胞聚集現象更加明顯。假手術組和對照組各時間點均未觀察到雙染標記陽性細胞。見圖 7。
3 討論
本研究在大鼠膝關節軟骨上運用刀片劃痕實驗建立了關節軟骨非全層損傷動物模型，并通過HE染色、番紅O染色、BrdU、CD105、CD105/整合素β1免疫熒光染色等方法，評估了劃痕周圍軟骨的宏觀改變和組織學變化，以及劃痕周圍細胞的某些分子學標志物表達特征。通過大體觀察發現劃痕周圍軟骨欠光滑，有軟化和纖維化改變；HE組織學染色發現劃痕周圍有細胞簇集現象，細胞分布不均，改良組織學評分隨造模時間延長未發生顯著變化，說明損傷的軟骨未得到修復。關節軟骨屬于透明軟骨，是一種特殊的結締組織，軟骨內無血管、淋巴管和神經，其營養主要由滑液供應，這些結構特點決定了其損傷后自愈能力有限[5]。關節軟骨損傷根據損傷深度分為穿透軟骨下骨的骨軟骨損傷（軟骨全層損傷）和局限于軟骨內的部分軟骨損傷（軟骨非全層損傷）。Namba等[6]研究發現，在胚胎羊膝關節軟骨造成深度為100 μm的表淺損傷，出生時已形成透明軟骨修復。而對于成年動物，未穿透軟骨下骨的部分軟骨損傷僅引起機體局限的損傷反應，關節軟骨不能得到修復[7]。本實驗結果與既往研究結論相符，即在成年動物上未觀察到關節軟骨損傷后的明顯修復。Sandell[8]發現輕度骨性關節炎時會出現軟骨細胞代謝活躍導致細胞簇集現象。本實驗中發現的劃痕周圍細胞簇集現象提示劃痕造成的軟骨損傷活化了某些細胞，引起局部細胞簇集。番紅O染色灰度值分析顯示3組組間和組內各時間點間比較，差異均無統計學意義。正常關節軟骨內蛋白多糖主要分布于軟骨基質內，軟骨囊區染色最深。關節軟骨番紅O染色后，蛋白多糖的變化主要表現為染色程度的變化，著色深淺用平均灰度值，在分析軟件上染色程度越深，其灰度值越低[9]。因此番紅O染色結果提示，劃痕損傷并未造成軟骨基質的改變，發生的劃痕周圍細胞活化和簇集現象可能與軟骨基質的關系不密切。
BrdU是一種人工合成的核苷酸類似物，常用于標記活體組織的增殖細胞。其結構類似于胸腺嘧啶，在細胞分裂的S期可取代胸腺嘧啶插入正在復制的細胞DNA中[10-11]。通過免疫組織化學方法，用BrdU抗體檢測整合在細胞DNA中的BrdU分子，可以反映出細胞周期的活力。本實驗中BrdU免疫熒光染色結果顯示在劃痕損傷周圍有大量陽性細胞聚集，提示這些細胞處于增殖活躍狀態。
本實驗CD105免疫熒光染色顯示，劃痕周圍有較多CD105陽性細胞，手術組CD105陽性細胞數多于假手術組和對照組，且隨造模時間延長，劃痕周圍的CD105陽性細胞數逐漸增多。CD105是一種前體細胞標志物，研究發現軟骨組織中CD105陽性細胞有軟骨分化潛能[12-14]。有研究發現[3]，在體外培養的軟骨組織塊表面可見一種不同于軟骨細胞表型的軟骨前體細胞。軟骨前體細胞一般存在于軟骨層表面，Seol等[11]發現在軟骨損傷和軟骨細胞死亡時，軟骨前體細胞會激活并遷徙至受損區域，在軟骨全層損傷模型中很可能參與其修復過程。因此我們推測本實驗中觀察到的損傷部位周圍的活化細胞可能是軟骨前體細胞，而在假手術組未觀察到大量陽性細胞，表明該細胞的活化與軟骨膜損傷及周圍組織炎癥關系不大，而只與軟骨層的破壞損傷有關。但還需要進一步分離和培養細胞，并進行體外分化實驗來確認活化細胞是軟骨前體細胞。
本實驗CD105和整合素β1免疫雙熒光標記結果顯示，在劃痕損傷周圍有雙標陽性細胞，而假手術組和對照組未觀察到雙標陽性細胞。整合素是黏附分子中的一類，是介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質黏附的一類細胞膜表面的糖蛋白，由不同的α與β亞單位組成，是許多細胞增生和遷移的基礎。研究表明，軟骨細胞中表達的整合素包括以膠原為配體的α1β1、α2β1、α10β1、α11β1，以纖維粘連蛋白為配體的α5β1、αVβ3、αVβ5。其中與膠原結合的整合素均含有β1亞基，且絕大多數β1亞基參與形成了以膠原為配體的整合素[15-17]。研究報道，許多激活的干細胞表面整合素β1的表達量上升，例如造血干細胞、表皮干細胞、BMSCs等[1, 18-21]；整合素β1的表達上升使其能夠快速介導活化的干細胞與周圍基質中的蛋白成分結合，進而促進干細胞增殖分化，以適應應激狀態或組織損傷[22-23]。Zwolanek等[16]通過體外實驗研究得出結論，整合素β1能介導BMSCs與細胞外基質中膠原的黏附作用，尤其是Ⅱ型膠原；運用單克隆整合素β1封閉抗體，能夠抑制BMSCs與細胞外基質中的膠原結合，從而阻斷整合素介導的信號傳導過程，抑制細胞發揮生物學作用。
因此我們認為，劃痕造成的軟骨損傷激活了某些細胞，使其細胞膜上的整合素β1表達升高，進而介導活化細胞的黏附作用，促進其增殖分化，以適應損傷后的應激狀態，這與Gottschling等[1]的研究結論相符。此外我們可以推斷與BMSCs類似，整合素β1作為可能的軟骨前體細胞膜表面重要的蛋白，能夠介導細胞與細胞外基質中膠原的黏附，從而促進增殖分化及發揮生物學作用。當然，還需要進一步研究證實整合素β1對細胞功能的調節機制。盡管如此，本實驗結果提示可通過早期檢測整合素β1的高表達，發現軟骨損傷早期某些細胞的活化；并結合其他診斷指標和方法，如Ⅱ型膠原羧基端端肽[24]，為早期診斷骨性關節炎提供線索。此外，將來對整合素β1調節細胞和細胞外基質黏附機制的深入研究，將有助于軟骨損傷修復方法的發展和進步。
綜上述，劃痕造成的軟骨非全層損傷不能得到完整修復，但引發了損傷病灶周圍的細胞改變，包括軟骨細胞的壞死和某些細胞的活化，這些活化細 胞 增殖活躍，表達前體細胞標志物CD105以及整合素β1；而細胞的活化與軟骨基質的改變和周圍組織炎癥關系不大。本研究為軟骨缺損的治療及骨性關節炎的早期發現提供了新的臨床思路及線索。但本研究還有一些局限，例如關于整合素β1介導活化細胞與細胞外基質的黏附作用機制，以及相關信號通路還不清楚；并且需要進行更深入的體外研究，證實劃痕導致的活化細胞是軟骨前體細胞。
骨關節炎是臨床常見病，隨著老齡化社會的到來，其發病率日趨升高。骨關節炎的早期組織改變是從軟骨層表面的破壞開始，因此研究軟骨的非全層損傷（未及軟骨下骨）對骨關節炎的早期診斷和治療具有重要意義[1]。有研究發現體外培養的軟骨組織塊表面可見一種不同于軟骨細胞表型的軟骨前體細胞，其活化可能與軟骨損傷有關[2-3]。本研究采用軟骨劃痕的方法造成大鼠軟骨非全層損傷模型，從組織形態學、免疫病理學等角度觀察損傷周圍軟骨基質和細胞變化，并探究細胞活化與整合素β1表達間的關系，從而為骨關節炎的早期診斷和治療提供新的臨床思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級10周齡SD雄性大鼠45只，體質量300～400 g，由南京醫科大學附屬南京醫院動物實驗中心提供。
HE染色試劑盒、番紅O染色試劑盒、BrdU、鼠抗BrdU單克隆抗體、FITC標記山羊抗兔免疫球蛋白IgG（南京凱基生物科技發展有限公司）；CD105兔抗鼠單克隆抗體、整合素β1兔抗鼠單克隆抗體（Abcam公司，英國）；0.25%胰蛋白酶、20%EDTA、鏈霉素、PBS（上海基星試劑公司）。眼科無菌手術刀片（上海浦東金環醫療用品公司）；RM 2135石蠟切片機、EG 1140H包埋機（Leica公司，德國）；光學顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 實驗分組及造模方法
隨機將45只大鼠分為手術組、假手術組和對照組3 組，每組15只。所有大鼠以水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，手術組和假手術組選取右膝關節，沿髕韌帶內側緣切開長約1 cm皮膚，切開關節囊，將髕骨向外側脫位，暴露股骨髁負重區。手術組用手術刀片在兩側股骨髁負重區沿矢狀位分別劃痕2次，深度以無出血為止（圖 1）；假手術組不行劃痕。兩組髕骨復位及生理鹽水清洗傷口后，用5-0可吸收線單獨縫合關節囊，5-0絲線間斷縫合皮膚。對照組未作任何處理。術后各組立即皮下注射5 mg/mL BrdU 1mL，待大鼠清醒后分籠飼養，讓其自由活動及進食。術后腹腔注射青霉素（10萬U/只） 抗感染，每天1次，連續注射3 d。
圖1
手術組軟骨非全層損傷模型造模過程 ? 暴露股骨髁負重區 ? 劃痕2次造模 圖 2 各組術后各時間點大體觀察 ? 手術組1d ? 手術組7 d ? 手術組14 d ? 假手術組1 d ? 假手術組7 d ? 假手術組14 d ? 對照組1 d ? 對照組7 d ? 對照組14 d 圖 3 各組術后各時間點組織學觀察（HE×400） ? 手術組1 d ? 手術組7 d ? 手術組14 d ? 假手術組7 d ? 對照組14 d
Figure1.
The establishing process of the partial-thickness articular cartilage injury model in operated group ? Exposure of the weight-bearing area of femoral condyle ? Model establishment of two linear cartilage defects using an ophthalmic knife Fig. 2 Macroscopic observation of each group at different time points ? Operated group at 1 day ? Operated group at 7 days ? Operated group at 14 days ? Sham-operated group at 1day ? Sham-operated group at 7 days ? Sham-operated group at 14 days ? Control group at 1 day ? Control group at 7days ? Control group at 14 days Fig. 3 Histological observation of each group at different time points (HE×400) ? Operated group at 1day ? Operated group at 7 days ? Operated group at 14 days ? Sham-operated group at 7 days ? Control group at 14 days
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察各組大鼠飲食、活動及傷口等情況。術后1、7、14 d各組分別處死5只大鼠，取右股骨下段，清除右膝關節周圍的軟組織及韌帶，病理取材后大體觀察關節面的光滑度及色澤，表面劃痕是否明顯，劃痕周圍軟骨是否有軟化、纖維化，及軟骨下骨是否裸露等情況。
1.3.2 組織學觀察
取各組各時間點樣本，生理鹽水沖洗，置于100 g/L多聚甲醛4℃固定48 h；5%稀硝酸脫鈣3～4 d，70%、80%、90%、100%乙醇逐級脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，石蠟包埋，沿膝關節橫斷面切片，制備5 μm厚組織切片。常規行HE染色和番紅O染色，光鏡下觀察。采用改良組織學評分[4]評估HE染色結果，評價各時間點各組軟骨損傷情況；每個標本隨機選取4個區域，利用Photoshop CS分析軟件分析番紅O染色切片的灰度值。
1.3.3 免疫熒光染色觀察
取各組各時間點切片，脫蠟至水，用0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min× 3 次。①部分切片加入2 mol/L HCl 50μL，37℃孵育30min，0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min×3 次；加入0.25%胰蛋白酶50 μL，37℃孵育10 min，室溫下血清封閉10 min；加入鼠抗BrdU單克隆抗體（1∶200），37℃避光孵育30 min；0.01mol/ L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察BrdU染色情況。②部分切片加入3%H2O2 5min阻斷內源性過氧化物酶活性，滴加0.4%胃蛋白酶（pH2）濕盒孵育10 min修復抗原，室溫下血清封閉10 min；滴加CD105兔抗鼠單克隆抗體（1∶200）、4℃過夜；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，滴加二抗FITC標記山羊抗兔免疫球蛋白IgG（1∶100），37℃避光孵育2 h；0.01mol/ L PBS（pH7.4）漂洗5min×3 次，防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察CD105染色情況。每張切片隨機選取不同的4個區域，采用標準雙盲法計數每高倍鏡視野陽性細胞，取均值。③部分切片在抗原修復后，同時滴加CD105兔抗鼠單克隆抗體（1∶200）和整合素β1兔抗鼠單克隆抗體（1∶200），4℃過夜；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，滴加二抗FITC標記山羊抗兔免疫球蛋白IgG（1∶100），37℃避光孵育2 h；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min×3次，防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察CD105/整合素β1雙標記染色情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后30 min～1 h所有大鼠蘇醒，能自由活動右下肢，大鼠的飲食、活動、體質量增長等指標正常。術后未見傷口感染及關節腫脹、步態不對稱等異常狀況，各組均未見大鼠異常死亡。
手術組膝關節滑膜輕度充血增生，無纖維素性滲出，滑液分泌量正常，透明；軟骨呈淡藍白色，劃痕明顯，劃痕周圍軟骨欠光滑，非透明，有軟骨軟化、纖維化改變，且隨造模時間延長逐漸加重；未見關節面缺損，無骨贅形成。假手術組膝關節滑膜輕度充血增生，無纖維素性滲出，滑液分泌量正常，透明；軟骨呈藍白色透明狀，關節面稍粗糙，無軟化、纖維化改變，未見裂隙裂紋形成，各時間點基本一致；未見關節面缺損，無骨贅形成。對照組膝關節滑膜未見充血增生，無纖維素性滲出，滑液分泌量正常，透明；軟骨呈透明白色，關節面平整，無軟化、纖維化改變，未見裂隙裂紋形成；未見軟骨面缺損，無骨贅形成。見圖 2。
2.2 組織學觀察
2.2.1 HE染色
手術組在劃痕底部見凋亡壞死軟骨細胞，劃痕周圍見細胞數增多，大小不等，排列分布不均，且隨造模時間延長逐漸明顯；有細胞簇集現象，細胞核染色深淺不一；未劃痕處軟骨層表面光滑，軟骨層變薄，潮線完整。假手術組各時間點均未見凋亡軟骨細胞，軟骨層變薄，表層完整無缺如，細胞大小均勻，細胞核染色均勻，排列有序，無軟骨細胞簇集，潮線規則。對照組各時間點均未見凋亡壞死軟骨細胞，細胞大小均勻，排列較整齊呈柱狀，層次清楚，無簇集軟骨細胞，細胞核染色均勻，潮線完整。見圖 3。
手術組術后各時間點改良組織學評分均顯著高于假手術組及對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；假手術組和對照組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。各組組內各時間點間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
各組術后各時間點HE染色改良組織學評分比較（n=5，2.2.2 番紅O染色
手術組各時間點染色欠均勻，著色貫穿軟骨全層，劃痕周圍區域著色較淺，隨造模時間延長，著色深淺無顯著變化；假手術組和對照組各時間點染色均勻，著色貫穿軟骨全層，濃度適中，無失染。見圖 4。術后各時間點各組間比較以及各組內各時間點間比較灰度值，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
圖4
各組術后各時間點組織學觀察（番紅O×400 ? 手術組1 d ? 手術組14 d ? 假手術組14 d ? 對照組14 d 圖 5 各組術后14 d BrdU免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡 ×400） 箭頭示BrdU 陽性細胞 ? 手術組 ? 假手術組 ? 對照組 圖 6 各組術后14 d CD105免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400） 箭頭示CD105陽性細胞 ? 手術組 ? 假手術組 ? 對照組 圖 7 各組術后各時間點CD105/整合素β1雙熒光標記染色觀察（熒光顯微鏡×400） 箭頭示CD105和整合素β1雙染標記陽性細胞 ? 手術組1 d ? 手術組14 d ? 假手術組14 d ? 對照組14 d
Figure4.
Histological observation of each group at different time points (Safranin O×400) ? Operated group at 1 day ? Operated group at 14 days ? Sham-operated group at 14 days ? Control group at 14 days Fig. 5 BrdU immunofluorescence staining in 3 groups at 14days (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated BrdU-positive cells ? Operated group ? Sham-operated group ? Control group Fig. 6 CD105 immunofluorescence staining in 3 groups at 14 days (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated CD105-positive cells ? Operated group ? Sham-operated group ? Control group Fig. 7 CD105/integrin β1 double immunofluorescence staining in 3groups at different time points (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated CD105/integrin β1 double positive cells Operated group at 1day ? Operated group at 14 days ? Sham-operated group at 14 days ? Control group at 14 days
表2
各組術后各時間點番紅O染色灰度值比較（n=5，2.3 免疫熒光染色觀察
BrdU免疫熒光染色示，手術組可見軟骨層綠色熒光反應強烈，劃痕周圍稍多，有向劃痕聚集傾向，陽性細胞排列紊亂、分布不均，隨造模時間延長更加顯著；假手術組及對照組各時間點綠色熒光反應強烈，無明顯聚集現象，陽性細胞排列分布均勻。見圖 5。
CD105免疫熒光染色示，手術組在劃痕周圍有較多顆粒狀綠色熒光，陽性細胞聚集、大小不一、分布不均，隨造模時間延長細胞聚集現象更加明顯，位置與HE染色標本細胞聚集位置基本一致；假手術組及對照組各時間點均見軟骨層少量綠色熒光，反應較弱，陽性細胞排列均勻。見圖 6。手術組術后各時間點CD105陽性細胞數均顯著多于假手術組和對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；假手術組和對照組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。手術組隨造模時間延長，CD105陽性細胞數逐漸增多，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）；假手術組和對照組內各時間點間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
表3
各組術后各時間點CD105陽性細胞數比較（n=5，個/HP ，CD105/整合素β1雙熒光標記染色示，手術組有大量細胞共表達CD105和整合素β1，以劃痕周圍處明顯，雙染標記陽性細胞大小不一、分布不均，隨造模時間延長陽性細胞聚集現象更加明顯。假手術組和對照組各時間點均未觀察到雙染標記陽性細胞。見圖 7。
3 討論
本研究在大鼠膝關節軟骨上運用刀片劃痕實驗建立了關節軟骨非全層損傷動物模型，并通過HE染色、番紅O染色、BrdU、CD105、CD105/整合素β1免疫熒光染色等方法，評估了劃痕周圍軟骨的宏觀改變和組織學變化，以及劃痕周圍細胞的某些分子學標志物表達特征。通過大體觀察發現劃痕周圍軟骨欠光滑，有軟化和纖維化改變；HE組織學染色發現劃痕周圍有細胞簇集現象，細胞分布不均，改良組織學評分隨造模時間延長未發生顯著變化，說明損傷的軟骨未得到修復。關節軟骨屬于透明軟骨，是一種特殊的結締組織，軟骨內無血管、淋巴管和神經，其營養主要由滑液供應，這些結構特點決定了其損傷后自愈能力有限[5]。關節軟骨損傷根據損傷深度分為穿透軟骨下骨的骨軟骨損傷（軟骨全層損傷）和局限于軟骨內的部分軟骨損傷（軟骨非全層損傷）。Namba等[6]研究發現，在胚胎羊膝關節軟骨造成深度為100 μm的表淺損傷，出生時已形成透明軟骨修復。而對于成年動物，未穿透軟骨下骨的部分軟骨損傷僅引起機體局限的損傷反應，關節軟骨不能得到修復[7]。本實驗結果與既往研究結論相符，即在成年動物上未觀察到關節軟骨損傷后的明顯修復。Sandell[8]發現輕度骨性關節炎時會出現軟骨細胞代謝活躍導致細胞簇集現象。本實驗中發現的劃痕周圍細胞簇集現象提示劃痕造成的軟骨損傷活化了某些細胞，引起局部細胞簇集。番紅O染色灰度值分析顯示3組組間和組內各時間點間比較，差異均無統計學意義。正常關節軟骨內蛋白多糖主要分布于軟骨基質內，軟骨囊區染色最深。關節軟骨番紅O染色后，蛋白多糖的變化主要表現為染色程度的變化，著色深淺用平均灰度值，在分析軟件上染色程度越深，其灰度值越低[9]。因此番紅O染色結果提示，劃痕損傷并未造成軟骨基質的改變，發生的劃痕周圍細胞活化和簇集現象可能與軟骨基質的關系不密切。
BrdU是一種人工合成的核苷酸類似物，常用于標記活體組織的增殖細胞。其結構類似于胸腺嘧啶，在細胞分裂的S期可取代胸腺嘧啶插入正在復制的細胞DNA中[10-11]。通過免疫組織化學方法，用BrdU抗體檢測整合在細胞DNA中的BrdU分子，可以反映出細胞周期的活力。本實驗中BrdU免疫熒光染色結果顯示在劃痕損傷周圍有大量陽性細胞聚集，提示這些細胞處于增殖活躍狀態。
本實驗CD105免疫熒光染色顯示，劃痕周圍有較多CD105陽性細胞，手術組CD105陽性細胞數多于假手術組和對照組，且隨造模時間延長，劃痕周圍的CD105陽性細胞數逐漸增多。CD105是一種前體細胞標志物，研究發現軟骨組織中CD105陽性細胞有軟骨分化潛能[12-14]。有研究發現[3]，在體外培養的軟骨組織塊表面可見一種不同于軟骨細胞表型的軟骨前體細胞。軟骨前體細胞一般存在于軟骨層表面，Seol等[11]發現在軟骨損傷和軟骨細胞死亡時，軟骨前體細胞會激活并遷徙至受損區域，在軟骨全層損傷模型中很可能參與其修復過程。因此我們推測本實驗中觀察到的損傷部位周圍的活化細胞可能是軟骨前體細胞，而在假手術組未觀察到大量陽性細胞，表明該細胞的活化與軟骨膜損傷及周圍組織炎癥關系不大，而只與軟骨層的破壞損傷有關。但還需要進一步分離和培養細胞，并進行體外分化實驗來確認活化細胞是軟骨前體細胞。
本實驗CD105和整合素β1免疫雙熒光標記結果顯示，在劃痕損傷周圍有雙標陽性細胞，而假手術組和對照組未觀察到雙標陽性細胞。整合素是黏附分子中的一類，是介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質黏附的一類細胞膜表面的糖蛋白，由不同的α與β亞單位組成，是許多細胞增生和遷移的基礎。研究表明，軟骨細胞中表達的整合素包括以膠原為配體的α1β1、α2β1、α10β1、α11β1，以纖維粘連蛋白為配體的α5β1、αVβ3、αVβ5。其中與膠原結合的整合素均含有β1亞基，且絕大多數β1亞基參與形成了以膠原為配體的整合素[15-17]。研究報道，許多激活的干細胞表面整合素β1的表達量上升，例如造血干細胞、表皮干細胞、BMSCs等[1, 18-21]；整合素β1的表達上升使其能夠快速介導活化的干細胞與周圍基質中的蛋白成分結合，進而促進干細胞增殖分化，以適應應激狀態或組織損傷[22-23]。Zwolanek等[16]通過體外實驗研究得出結論，整合素β1能介導BMSCs與細胞外基質中膠原的黏附作用，尤其是Ⅱ型膠原；運用單克隆整合素β1封閉抗體，能夠抑制BMSCs與細胞外基質中的膠原結合，從而阻斷整合素介導的信號傳導過程，抑制細胞發揮生物學作用。
因此我們認為，劃痕造成的軟骨損傷激活了某些細胞，使其細胞膜上的整合素β1表達升高，進而介導活化細胞的黏附作用，促進其增殖分化，以適應損傷后的應激狀態，這與Gottschling等[1]的研究結論相符。此外我們可以推斷與BMSCs類似，整合素β1作為可能的軟骨前體細胞膜表面重要的蛋白，能夠介導細胞與細胞外基質中膠原的黏附，從而促進增殖分化及發揮生物學作用。當然，還需要進一步研究證實整合素β1對細胞功能的調節機制。盡管如此，本實驗結果提示可通過早期檢測整合素β1的高表達，發現軟骨損傷早期某些細胞的活化；并結合其他診斷指標和方法，如Ⅱ型膠原羧基端端肽[24]，為早期診斷骨性關節炎提供線索。此外，將來對整合素β1調節細胞和細胞外基質黏附機制的深入研究，將有助于軟骨損傷修復方法的發展和進步。
綜上述，劃痕造成的軟骨非全層損傷不能得到完整修復，但引發了損傷病灶周圍的細胞改變，包括軟骨細胞的壞死和某些細胞的活化，這些活化細 胞 增殖活躍，表達前體細胞標志物CD105以及整合素β1；而細胞的活化與軟骨基質的改變和周圍組織炎癥關系不大。本研究為軟骨缺損的治療及骨性關節炎的早期發現提供了新的臨床思路及線索。但本研究還有一些局限，例如關于整合素β1介導活化細胞與細胞外基質的黏附作用機制，以及相關信號通路還不清楚；并且需要進行更深入的體外研究，證實劃痕導致的活化細胞是軟骨前體細胞。
