引用本文： 黃永軍, 黃東, 張大衛, 牟勇, 劉曉春. FTY-720P通過抑制破骨細胞形成增強同種異體骨修復骨缺損效果. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(4): 426-431. doi: 10.7507/1002-1892.20160086 復制
骨缺損的修復是骨科醫生面臨的重要挑戰之一。目前臨床上同種異體骨成為自體骨移植修復骨缺損的“最佳替代”；但其植入人體后易產生免疫反應，導致植骨失敗甚至造成更嚴重后果[1]。因此，如何減輕同種異體骨免疫原性成為目前研究熱點。FTY-720是一種新型免疫抑制劑，其在體內的活性成分為FTY-720P，除能有效抑制免疫反應外，有研究表明其有一定成骨作用，但具體機制尚不清楚[2-3]。同種異體骨體內成骨過程需要破骨細胞的吞噬作用，而破骨細胞與自身免疫系統關系密切，FTY-720P能否通過抑制破骨細胞形成及功能，進而減少同種異體骨的提前吸收，起到更好的骨傳導作用，尚缺少文獻報道。本研究擬通過動物實驗及細胞學實驗探索FTY-720P聯合同種異體骨修復骨缺損的效果，為該藥物在臨床上的應用及后續研究提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
普通級成年新西蘭大白兔50只，雌雄不限，體質量2～3 kg，由廣東省實驗動物中心提供。1 月齡SD大鼠5只，雌雄不限，體質量130～150 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供。
NF-κB受體活化因子配體（receptor activator ofNF-κBligand，RANKL；R&D公司，美國）；DEPC水新鮮配制的乙醇、DEPC水、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液（Invitrogen公司，美國）；DMEM、α-MEM、FBS（HyClone公司，美國）；新鮮牛骨切片（廣州市杏海生物科技有限公司）；巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）、酒石酸抗酸性磷酸酶（tartrate-resistantacidphosphatas，TRAP）試劑盒（Sigma公司，美國）。CHANLLENGE雙能量T射線骨密度儀（Hologic公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 動物實驗
1.2.1 同種異體骨的制作
隨機選取2只成年新西蘭大白兔，采用耳緣靜脈注射空氣法處死，完整取出其四肢長骨，采用凍干法制作同種異體骨，以25kGy 60Co輻照滅菌并置于4℃恒溫冰箱內保存。
1.2.2 實驗分組及方法
取剩余48只新西蘭大白兔，采用deGirolamo等[4]的方法建立1.5cm長單側脛骨皮質骨缺損模型。然后隨機分為4組，每組12只。其中A組僅單純制備骨缺損模型；B組移植1.5cm長同種異體骨修復骨缺損；C組移植1.5cm長自體腓骨修復骨缺損；D組移植FTY-720P聯合1.5cm長同種異體骨（同種異體骨于無菌環境下置于1 mg/mL FTY-720P浸泡30 min）修復骨缺損。
1.2.3 影像學檢查
術后2、4、8、12周取所有動物以耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉后，常規攝X線片，采用Lane-Sandhu法[5]進行影像學評分；并采用CHANLLENGE雙能量T射線骨密度儀行骨密度檢查。
1.3 細胞學實驗
1.3.1 骨髓源性單核巨細胞（bone marrow-derived mononuclear phagocytes，BMMs）誘導破骨細胞形成及鑒定
取5只1月齡SD大鼠脫頸法處死后，完整取出長骨，充分消毒后，于超凈臺內以含10%FBS的DMEM培養基反復沖洗骨髓腔內細胞至培養皿，沖洗至骨髓腔顏色發白。于上述培養皿中加入10ng/ mL M-CSF并置入無菌新鮮牛骨切片后，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養細胞，每2天更換培養基并維持M-CSF 10 ng/mL誘導濃度。培養72 h后添加30ng/mL RANKL，然后每天倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，每2天更換細胞培養液。誘導培養7 d，采用TRAP染色法[6]鑒定培養破骨細胞，以單個細胞細胞核計數>3個，TRAP染色紫紅色為破骨細胞陽性標準。
1.3.2 FTY-720P對BMMs誘導破骨細胞形成的影響
于誘導培養1 d的破骨細胞培養液中添加FTY-720P。按加入FTY-720P濃度的不同，將實驗分為0、500、600、700、800、900、1000、1500ng/mL濃度組，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中以含10%FBS的DMEM培養基培養10 d后，行TRAP染色并于倒置相差顯微鏡下對破骨細胞進行計數。采用Image-Pro Plus 5.0軟件進行分析，計數總細胞數及TRAP染色陽性細胞（包括單核和多核細胞）數，計算各組破骨細胞陽性率。
1.3.3 FTY-720P對BMMs誘導破骨細胞吞噬骨片的影響
分組方法同1.3.2，倒置相差顯微鏡下每天觀察細胞形態及骨陷窩形成情況，每隔2 d換液并添加相應濃度的試劑以保證觀察效果。培養10 d后取出培養的骨片，充分清除表面破骨細胞并行甲苯胺藍染色，于100倍光鏡下觀察破骨細胞吞噬骨片后形成的陷窩數。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較及組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 FTY-720P聯合同種異體骨修復骨缺損效果評 價
術后隨時間延長，各組Lane-Sandhu評分均呈逐漸上升趨勢，各時間點間比較差異有統計學意義（P<0.05）。術后2周各組Lane-Sandhu評分比較差異均無統計學意義（P>0.05）；其余各時間點C、D組Lane-Sandhu評分均優于A、B組，B組優于A組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；C、D組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組Lane-Sandhu評分比較（n=12，術后隨時間延長，各組骨密度均呈逐漸上升趨勢，各時間點間比較差異有統計學意義（P<0.05）。術后2周，C組骨密度大于A、B、D組，差異有統計學意義（P<0.05），A、B、D組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。術后4、8、12周，B、C、D組骨密度均高于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C、D組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
術后各時間點各組骨密度比較（n=12，g/cm2，2.2 細胞學實驗
2.2.1 BMMs誘導破骨細胞形成及鑒定
自骨髓中提取的細胞以單核細胞為主，未見多個核細胞，多呈圓形或多角形，少量呈梭形。加入M-CSF和RANKL誘導后，部分細胞出現梭形改變，逐漸壞死并漂浮在培養基表面；誘導4 d后，培養基中出現少量體型較大細胞，細胞呈多核并伸出觸角；誘導7 d，培養基中可見數量較多的多核巨細胞，細胞長出較多偽足，TRAP染色為紫紅色，提示該巨型多核細胞為破骨細胞。見圖 1。
圖1
BMMs誘導破骨細胞形成形態學觀察 ? 誘導培養24 h（倒置相差顯微鏡×200） ? 誘導培養7 d（倒置相差顯微鏡×200） ? 誘導培養7 d TRAP染色（倒置相差顯微鏡×100）
Figure1.
Morphology observation of osteoclasts induced from BMMs by using M-CSF and RANKL ? At 24 hours after induction (Inverted phase contrast microscope×200) ? At 7 days after induction (Inverted phase contrast microscope×200) ? TRAP staining at 7 days after induction (Inverted phase contrast microscope×100)
2.2.2 FTY-720P對BMMs誘導破骨細胞形成的影響
0、500、600、700、800、900、1 000、1500ng/ mL濃度組破骨細胞陽性率分別為9.93%±0.63%、9.14%± 0.37%、8.99%±0.37%、7.61±0.38%、3.94%±0.29%、2.77%±0.48%、1.10%±0.57%、0.58%±0.09%，0、500、600、700、800、900 ng/mL濃度組顯著高于1000、1500ng/mL濃度組，0、500、600、700ng/mL濃度組高于800、900ng/mL濃度組，0、500、600ng/mL濃度組高于700ng/mL濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05），其余各濃度組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2.3 FTY-720P對BMMs誘導破骨細胞吞噬骨片的影響
0、500、600、700、800、900、1 000、1500ng/ mL濃度組破骨細胞吞噬骨片后形成的陷窩數分別為（147.58±13.27）、（136.21±12.71）、（129.93±10.68）、（96.47±13.11）、（47.32±14.59）、（31.13±9.08）、（19.79±8.41）、（19.03±8.95）個/視野，0、500、600、700ng/mL濃度組顯著高于800、900、1000、1500ng/ mL濃度組，0、500、600ng/ mL濃度組高于700ng/mL濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05），其余各濃度組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
隨著社會經濟水平的進步和發展，各種原因引起的骨缺損在臨床上越來越常見。目前臨床上引起骨缺損的常見原因有骨腫瘤、創傷等，造成了嚴重后果，尤其是大段骨缺損修復效果差，因此骨缺損的修復成為臨床上亟待解決的重要課題。同種異體骨與自體骨在骨傳導作用上效果相當，且與自體骨比較，同種異體骨來源較多，能夠滿足各種類型骨缺損修復，但由于其具有免疫原性，在臨床應用時易產生多種并發癥，如移植骨壞死、局部炎性反應、再次骨折、骨折延遲愈合等，影響了其療效[1, 7-8]。因此，如何在不影響同種異體骨骨傳導及骨誘導作用的前提下減輕排斥反應，減少移植同種異體骨引起的并發癥，成為臨床難題之一。
FTY-720是一種從冬蟲夏草中提煉出的新型免疫抑制劑，其在體內被活化為FTY-720P，具有針對S1P受體特異性的作用，從而對多種自身免疫反應起到治療作用[9-10]。除能有效抑制免疫反應外，有研究表明FTY-720有一定成骨作用，但機制尚不清楚[11]。本研究中的動物實驗表明，FTY-720P聯合同種異體骨修復骨缺損在Lane-Sandhu評分及骨密度上可取得與自體骨相似的效果，且優于單純同種異體骨治療。
針對破骨細胞的研究，尤其是離體研究一直是難點與重點。破骨細胞的體外培養方法根據破骨細胞來源學說的不同分為脾干細胞培養法[12]、成熟破骨細胞分離培養法[13]以及目前認為最有效的骨髓誘導法。骨髓誘導法中最重要的誘導劑是M-CSF和RANKL。M-CSF主要由成骨細胞分泌，在破骨細胞的前體細胞中受體表達較高，是單核巨噬細胞增殖以及成熟破骨細胞形成的重要生物活因子之一[1 4-15]。當M-CSF被成骨細胞等合成并釋放后，其主要作用于破骨細胞前體細胞膜上的受體，并與c-Fms（M-CSF配體）結合，從而在有RANKL存在的前提下促進破骨細胞前體細胞相互融合并分化為成熟破骨細胞[16]。而 RANKL是TNF超家族成員之一，主要由成骨細胞系、T細胞和B細胞分泌[17]。但也有一系列研究表明，成骨細胞并不在破骨細胞的形成過程擔當必要角色，而骨細胞在破骨細胞的形成和活化過程中可能具有重要作用，進而影響骨重建過程[18]。近年發現，在松質骨中骨細胞分泌的RANKL才是調節破骨細胞形成的主要來源[19]，因此也有學者認為骨細胞對破骨細胞具有重要調節作用。本研究結果也進一步表明，通過采用一定濃度M-CSF與RANKL誘導，可有效促進破骨細胞形成。
成骨過程除與血運等條件有關外，其主要機制主要涉及破骨細胞與成骨細胞的協同作用，尤其對于骨缺損修復這一過程，需要破骨細胞吞噬填充材料及成骨細胞不斷成骨這一過程連續進行；同種異體骨具有一定免疫原性，因此更能激活機體免疫系統，進而激活破骨細胞這一體內唯一具有吞噬骨功能的特殊類型“巨噬細胞”吞噬同種異體骨，從而使同種異體骨無法行使其骨傳導作用，導致骨缺損治療失敗。而FTY-720P除能通過促進血管形成促進骨骼生長外，極有可能通過影響破骨-成骨系統起到保護同種異體骨骨傳導的作用。Ryu等[20]研究認為，在成骨細胞與破骨細胞共培養環境下，S1P的存在可通過結合成骨細胞表面受體而提高成骨細胞分泌的RANK，從而使破骨細胞的分化降低。而FTY-720P作為S1P受體的特異性抑制劑，是否能夠通過影響破骨細胞的作用，從而減少破骨細胞對同種異體骨的吞噬作用，進而減少機體將同種異體骨作為“異物”提前清除，減低其骨誘導作用，目前相關研究較少。本研究通過細胞學實驗表明，一定濃度的FTY-720P可有效作用于BMMs，抑制細胞分化為成熟破骨細胞，并且通過破骨細胞吞噬骨板實驗表明FTY-720P可有效抑制破骨細胞吞噬骨的能力，從而減少同種異體骨骨量丟失，使其作為生物支架起到良好的骨傳導作用，促進骨缺損修復。但FTY-720P具體如何影響BMMs誘導形成破骨細胞及FTY-720P如何影響破骨細胞的吞噬功能，本研究尚不能完全闡述清楚，還需進一步進行基因及蛋白質研究。
綜上述，本研究通過動物實驗及細胞學實驗表明，FTY-720P可通過抑制破骨細胞的分化及功能減少同種異體骨骨量丟失，進而達到與自體骨移植相似的效果，但具體機制尚不明確，需要進一步研究及探索。
骨缺損的修復是骨科醫生面臨的重要挑戰之一。目前臨床上同種異體骨成為自體骨移植修復骨缺損的“最佳替代”；但其植入人體后易產生免疫反應，導致植骨失敗甚至造成更嚴重后果[1]。因此，如何減輕同種異體骨免疫原性成為目前研究熱點。FTY-720是一種新型免疫抑制劑，其在體內的活性成分為FTY-720P，除能有效抑制免疫反應外，有研究表明其有一定成骨作用，但具體機制尚不清楚[2-3]。同種異體骨體內成骨過程需要破骨細胞的吞噬作用，而破骨細胞與自身免疫系統關系密切，FTY-720P能否通過抑制破骨細胞形成及功能，進而減少同種異體骨的提前吸收，起到更好的骨傳導作用，尚缺少文獻報道。本研究擬通過動物實驗及細胞學實驗探索FTY-720P聯合同種異體骨修復骨缺損的效果，為該藥物在臨床上的應用及后續研究提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
普通級成年新西蘭大白兔50只，雌雄不限，體質量2～3 kg，由廣東省實驗動物中心提供。1 月齡SD大鼠5只，雌雄不限，體質量130～150 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供。
NF-κB受體活化因子配體（receptor activator ofNF-κBligand，RANKL；R&D公司，美國）；DEPC水新鮮配制的乙醇、DEPC水、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液（Invitrogen公司，美國）；DMEM、α-MEM、FBS（HyClone公司，美國）；新鮮牛骨切片（廣州市杏海生物科技有限公司）；巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）、酒石酸抗酸性磷酸酶（tartrate-resistantacidphosphatas，TRAP）試劑盒（Sigma公司，美國）。CHANLLENGE雙能量T射線骨密度儀（Hologic公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 動物實驗
1.2.1 同種異體骨的制作
隨機選取2只成年新西蘭大白兔，采用耳緣靜脈注射空氣法處死，完整取出其四肢長骨，采用凍干法制作同種異體骨，以25kGy 60Co輻照滅菌并置于4℃恒溫冰箱內保存。
1.2.2 實驗分組及方法
取剩余48只新西蘭大白兔，采用deGirolamo等[4]的方法建立1.5cm長單側脛骨皮質骨缺損模型。然后隨機分為4組，每組12只。其中A組僅單純制備骨缺損模型；B組移植1.5cm長同種異體骨修復骨缺損；C組移植1.5cm長自體腓骨修復骨缺損；D組移植FTY-720P聯合1.5cm長同種異體骨（同種異體骨于無菌環境下置于1 mg/mL FTY-720P浸泡30 min）修復骨缺損。
1.2.3 影像學檢查
術后2、4、8、12周取所有動物以耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉后，常規攝X線片，采用Lane-Sandhu法[5]進行影像學評分；并采用CHANLLENGE雙能量T射線骨密度儀行骨密度檢查。
1.3 細胞學實驗
1.3.1 骨髓源性單核巨細胞（bone marrow-derived mononuclear phagocytes，BMMs）誘導破骨細胞形成及鑒定
取5只1月齡SD大鼠脫頸法處死后，完整取出長骨，充分消毒后，于超凈臺內以含10%FBS的DMEM培養基反復沖洗骨髓腔內細胞至培養皿，沖洗至骨髓腔顏色發白。于上述培養皿中加入10ng/ mL M-CSF并置入無菌新鮮牛骨切片后，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養細胞，每2天更換培養基并維持M-CSF 10 ng/mL誘導濃度。培養72 h后添加30ng/mL RANKL，然后每天倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，每2天更換細胞培養液。誘導培養7 d，采用TRAP染色法[6]鑒定培養破骨細胞，以單個細胞細胞核計數>3個，TRAP染色紫紅色為破骨細胞陽性標準。
1.3.2 FTY-720P對BMMs誘導破骨細胞形成的影響
于誘導培養1 d的破骨細胞培養液中添加FTY-720P。按加入FTY-720P濃度的不同，將實驗分為0、500、600、700、800、900、1000、1500ng/mL濃度組，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中以含10%FBS的DMEM培養基培養10 d后，行TRAP染色并于倒置相差顯微鏡下對破骨細胞進行計數。采用Image-Pro Plus 5.0軟件進行分析，計數總細胞數及TRAP染色陽性細胞（包括單核和多核細胞）數，計算各組破骨細胞陽性率。
1.3.3 FTY-720P對BMMs誘導破骨細胞吞噬骨片的影響
分組方法同1.3.2，倒置相差顯微鏡下每天觀察細胞形態及骨陷窩形成情況，每隔2 d換液并添加相應濃度的試劑以保證觀察效果。培養10 d后取出培養的骨片，充分清除表面破骨細胞并行甲苯胺藍染色，于100倍光鏡下觀察破骨細胞吞噬骨片后形成的陷窩數。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較及組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 FTY-720P聯合同種異體骨修復骨缺損效果評 價
術后隨時間延長，各組Lane-Sandhu評分均呈逐漸上升趨勢，各時間點間比較差異有統計學意義（P<0.05）。術后2周各組Lane-Sandhu評分比較差異均無統計學意義（P>0.05）；其余各時間點C、D組Lane-Sandhu評分均優于A、B組，B組優于A組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；C、D組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組Lane-Sandhu評分比較（n=12，術后隨時間延長，各組骨密度均呈逐漸上升趨勢，各時間點間比較差異有統計學意義（P<0.05）。術后2周，C組骨密度大于A、B、D組，差異有統計學意義（P<0.05），A、B、D組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。術后4、8、12周，B、C、D組骨密度均高于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C、D組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
術后各時間點各組骨密度比較（n=12，g/cm2，2.2 細胞學實驗
2.2.1 BMMs誘導破骨細胞形成及鑒定
自骨髓中提取的細胞以單核細胞為主，未見多個核細胞，多呈圓形或多角形，少量呈梭形。加入M-CSF和RANKL誘導后，部分細胞出現梭形改變，逐漸壞死并漂浮在培養基表面；誘導4 d后，培養基中出現少量體型較大細胞，細胞呈多核并伸出觸角；誘導7 d，培養基中可見數量較多的多核巨細胞，細胞長出較多偽足，TRAP染色為紫紅色，提示該巨型多核細胞為破骨細胞。見圖 1。
圖1
BMMs誘導破骨細胞形成形態學觀察 ? 誘導培養24 h（倒置相差顯微鏡×200） ? 誘導培養7 d（倒置相差顯微鏡×200） ? 誘導培養7 d TRAP染色（倒置相差顯微鏡×100）
Figure1.
Morphology observation of osteoclasts induced from BMMs by using M-CSF and RANKL ? At 24 hours after induction (Inverted phase contrast microscope×200) ? At 7 days after induction (Inverted phase contrast microscope×200) ? TRAP staining at 7 days after induction (Inverted phase contrast microscope×100)
2.2.2 FTY-720P對BMMs誘導破骨細胞形成的影響
0、500、600、700、800、900、1 000、1500ng/ mL濃度組破骨細胞陽性率分別為9.93%±0.63%、9.14%± 0.37%、8.99%±0.37%、7.61±0.38%、3.94%±0.29%、2.77%±0.48%、1.10%±0.57%、0.58%±0.09%，0、500、600、700、800、900 ng/mL濃度組顯著高于1000、1500ng/mL濃度組，0、500、600、700ng/mL濃度組高于800、900ng/mL濃度組，0、500、600ng/mL濃度組高于700ng/mL濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05），其余各濃度組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2.3 FTY-720P對BMMs誘導破骨細胞吞噬骨片的影響
0、500、600、700、800、900、1 000、1500ng/ mL濃度組破骨細胞吞噬骨片后形成的陷窩數分別為（147.58±13.27）、（136.21±12.71）、（129.93±10.68）、（96.47±13.11）、（47.32±14.59）、（31.13±9.08）、（19.79±8.41）、（19.03±8.95）個/視野，0、500、600、700ng/mL濃度組顯著高于800、900、1000、1500ng/ mL濃度組，0、500、600ng/ mL濃度組高于700ng/mL濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05），其余各濃度組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
隨著社會經濟水平的進步和發展，各種原因引起的骨缺損在臨床上越來越常見。目前臨床上引起骨缺損的常見原因有骨腫瘤、創傷等，造成了嚴重后果，尤其是大段骨缺損修復效果差，因此骨缺損的修復成為臨床上亟待解決的重要課題。同種異體骨與自體骨在骨傳導作用上效果相當，且與自體骨比較，同種異體骨來源較多，能夠滿足各種類型骨缺損修復，但由于其具有免疫原性，在臨床應用時易產生多種并發癥，如移植骨壞死、局部炎性反應、再次骨折、骨折延遲愈合等，影響了其療效[1, 7-8]。因此，如何在不影響同種異體骨骨傳導及骨誘導作用的前提下減輕排斥反應，減少移植同種異體骨引起的并發癥，成為臨床難題之一。
FTY-720是一種從冬蟲夏草中提煉出的新型免疫抑制劑，其在體內被活化為FTY-720P，具有針對S1P受體特異性的作用，從而對多種自身免疫反應起到治療作用[9-10]。除能有效抑制免疫反應外，有研究表明FTY-720有一定成骨作用，但機制尚不清楚[11]。本研究中的動物實驗表明，FTY-720P聯合同種異體骨修復骨缺損在Lane-Sandhu評分及骨密度上可取得與自體骨相似的效果，且優于單純同種異體骨治療。
針對破骨細胞的研究，尤其是離體研究一直是難點與重點。破骨細胞的體外培養方法根據破骨細胞來源學說的不同分為脾干細胞培養法[12]、成熟破骨細胞分離培養法[13]以及目前認為最有效的骨髓誘導法。骨髓誘導法中最重要的誘導劑是M-CSF和RANKL。M-CSF主要由成骨細胞分泌，在破骨細胞的前體細胞中受體表達較高，是單核巨噬細胞增殖以及成熟破骨細胞形成的重要生物活因子之一[1 4-15]。當M-CSF被成骨細胞等合成并釋放后，其主要作用于破骨細胞前體細胞膜上的受體，并與c-Fms（M-CSF配體）結合，從而在有RANKL存在的前提下促進破骨細胞前體細胞相互融合并分化為成熟破骨細胞[16]。而 RANKL是TNF超家族成員之一，主要由成骨細胞系、T細胞和B細胞分泌[17]。但也有一系列研究表明，成骨細胞并不在破骨細胞的形成過程擔當必要角色，而骨細胞在破骨細胞的形成和活化過程中可能具有重要作用，進而影響骨重建過程[18]。近年發現，在松質骨中骨細胞分泌的RANKL才是調節破骨細胞形成的主要來源[19]，因此也有學者認為骨細胞對破骨細胞具有重要調節作用。本研究結果也進一步表明，通過采用一定濃度M-CSF與RANKL誘導，可有效促進破骨細胞形成。
成骨過程除與血運等條件有關外，其主要機制主要涉及破骨細胞與成骨細胞的協同作用，尤其對于骨缺損修復這一過程，需要破骨細胞吞噬填充材料及成骨細胞不斷成骨這一過程連續進行；同種異體骨具有一定免疫原性，因此更能激活機體免疫系統，進而激活破骨細胞這一體內唯一具有吞噬骨功能的特殊類型“巨噬細胞”吞噬同種異體骨，從而使同種異體骨無法行使其骨傳導作用，導致骨缺損治療失敗。而FTY-720P除能通過促進血管形成促進骨骼生長外，極有可能通過影響破骨-成骨系統起到保護同種異體骨骨傳導的作用。Ryu等[20]研究認為，在成骨細胞與破骨細胞共培養環境下，S1P的存在可通過結合成骨細胞表面受體而提高成骨細胞分泌的RANK，從而使破骨細胞的分化降低。而FTY-720P作為S1P受體的特異性抑制劑，是否能夠通過影響破骨細胞的作用，從而減少破骨細胞對同種異體骨的吞噬作用，進而減少機體將同種異體骨作為“異物”提前清除，減低其骨誘導作用，目前相關研究較少。本研究通過細胞學實驗表明，一定濃度的FTY-720P可有效作用于BMMs，抑制細胞分化為成熟破骨細胞，并且通過破骨細胞吞噬骨板實驗表明FTY-720P可有效抑制破骨細胞吞噬骨的能力，從而減少同種異體骨骨量丟失，使其作為生物支架起到良好的骨傳導作用，促進骨缺損修復。但FTY-720P具體如何影響BMMs誘導形成破骨細胞及FTY-720P如何影響破骨細胞的吞噬功能，本研究尚不能完全闡述清楚，還需進一步進行基因及蛋白質研究。
綜上述，本研究通過動物實驗及細胞學實驗表明，FTY-720P可通過抑制破骨細胞的分化及功能減少同種異體骨骨量丟失，進而達到與自體骨移植相似的效果，但具體機制尚不明確，需要進一步研究及探索。
