引用本文： 譚偉偉, 何升華, 孫志濤, 王業廣, 王建, 賴居易. 微創針刺旋切制備兔椎間盤退變模型. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(3): 343-347. doi: 10.7507/1002-1892.20160067 復制
腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是骨科常見病、多發病，以一側下肢疼痛麻木或腰部疼痛為主要臨床癥狀，多認為是椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）引起髓核突出，從而壓迫神經產生癥狀，但對于IDD的確切發生機制目前尚未明確。因此，需要通過一種安全有效的IDD動物模型來研究相關病變機制。但目前對IDD動物模型建立方法尚未達成共識，近年多采用纖維環穿刺法和穿刺后抽吸髓核組織法，均存在一些不足[1-3]。我們設計了微創針刺旋切建立兔IDD模型的方法，本次實驗旨在探討該方法可行性，以期為研究LDH病變機制提供一種新的造模方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡新西蘭大白兔40只，雌雄不限，體質量（2.9±0.3）kg，MRI檢查椎間盤均正常，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。利多卡因注射液（山西晉新雙鶴藥業有限責任公司）；戊巴比妥鈉（Sigma公司，美國）；注射用生理鹽水（安徽豐源藥業股份有限公司）；注射用青霉素鈉（廣州白云山天心制藥股份有限公司）；Masson染色試劑盒（上海博谷生物科技有限公司）；甲醛液（上海瀘震實業有限公司）；番紅O染色液（北京索萊寶科技有限公司）。18G穿刺針、C臂X線機（ZIEM公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
將實驗動物隨機分為2組，每組20只。實驗組采用微創穿刺后旋切髓核組織建立IDD模型，具體步驟：動物四肢固定后俯臥于桌面上，軟墊墊高腹部，一側下肢肌肉注射青霉素鈉（40萬U/只）預防感染。于髂嵴最高點平L7棘突，定位L4、L5、L6棘突及關節突，局麻后取18G穿刺針以右外側約45°角度進針，C臂X線機透視下經椎間盤后外側刺入L4、5、L5、6椎間隙，針尖位于髓核內；采用針體旋轉法帶動針尖旋切髓核組織，順、逆時針旋轉360°各1次，以促使其退變。退出穿刺針、消毒，動物常規飼養。對照組不作任何處理。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察實驗組動物術后存活情況以及精神狀態、四肢活動度。
1.3.2 MRI觀察
術前及術后4、8、12、16周每組各取10只動物行MRI檢測。具體方法：觀察前禁食、水24?h，動物肌肉注射3%戊巴比妥鈉（1.2?mL/kg）麻醉，四肢固定于木板上（耳內塞入少許棉花以減少MRI噪聲的刺激），行MRI觀察。T2加權像：脈沖重復間隔時間/回波時間3 000 ms/125 ms，層厚2?mm，層間距1 mm。以Pfirrmann分級法[4]評價椎間盤退變程度。
1.3.3 大體及組織學觀察
術后各時間點MRI觀察后，各組隨機取2只動物采用耳緣靜脈注射空氣處死。取背部正中切口，分離棘突兩旁肌肉組織，暴露L1～7棘突及關節突，剪下L1～7整個脊柱，無菌生理鹽水沖洗，自腹側取出整個椎間盤。大體觀察髓核組織含水量及顏色、光澤。然后將椎間盤置于甲醛固定，常規脫水包埋，切片，行Masson染色和番紅O染色，鏡下觀察椎間盤纖維環及髓核變化。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。等級資料組間比較采用秩和檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗組所有動物術后均存活，術后2 d四肢活動度好，精神狀態較術前未見明顯改變。
2.2 MRI觀察
對照組MRI T2加權像示觀察早期椎間盤信號強度未見明顯改變，后期略減弱；實驗組椎間盤信號強度隨時間延長呈減弱趨勢。見圖 1。根據Pfirrmann分級法評價椎間盤退變程度顯示，隨時間延長，兩組椎間盤退變程度均逐漸加重，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。兩組間比較除術后4周差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余術后各時間點實驗組椎間盤退變程度均重于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
圖1
術后各時間點兩組MRI觀察??箭頭示實驗節段 ? 實驗組4周 ? 實驗組8周 ? 實驗組12周 ? 實驗組16周 ? 對照組4周 ? 對照組8周 ? 對照組12周 ? 對照組16周
Figure1.
MRI results of 2 groups at each time point postoperatively Arrow indicated experimental disc ? Experimental group at 4 weeks ? Experimental group at 8 weeks ? Experimental group at 12 weeks ? Experimental group at 16 weeks ? Control group at 4 weeks ? Control group at 8 weeks ? Control group at 12 weeks ? Control group at 16 weeks
表1
術后各時間點兩組Pfirrmann分級比較
Table1.
Pfirrmann grading comparison between 2 groups after operation
2.3 大體觀察
術后4周，對照組髓核透亮、含水量豐富，實驗組髓核顏色稍暗淡。8、12周時對照組髓核含水量略減少，顏色稍暗淡；實驗組髓核含水量明顯減少，顏色呈淡黃色。16周時對照組髓核含水量減少，實驗組髓核含水量較對照組明顯減少，呈干癟樣。
2.4 組織學觀察
2.4.1 Masson染色
對照組術后4、8周時椎間盤纖維環是以髓核為中心的同心圓形分層結構，排列整齊；12、16周纖維環出現排列不規整，但分層結構仍完整。實驗組術后4周椎間盤纖維環的同心圓形分層結構尚排列規整；8周排列出現部分紊亂，有少量裂隙存在；12周纖維環排列紊亂加重，裂隙增多；16周纖維環排列紊亂程度進一步加重，甚至出現斷裂不能連續現象。見圖 2。
圖2
各時間點兩組椎間盤纖維環Masson染色觀察（×200）箭頭示纖維環排列情況 ? 實驗組4周 ? 實驗組8周 ? 實驗組12周 ? 實驗組16周 ? 對照組4周 ? 對照組8周 ? 對照組12周 ? 對照組16周 圖 3各時間點兩組椎間盤髓核番紅O染色觀察（×400）箭頭示髓核細胞 ? 實驗組4周 ? 實驗組8周 ? 實驗組12周 ? 實驗組16周 ? 對照組4周 ? 對照組8周 ? 對照組12周 ? 對照組16周
Figure2.
Masson staining observations of annulus in 2 groups at each time point postoperatively (×200) Arrow indicated the arrangement of the annulus ? Experimental group at 4 weeks ? Experimental group at 8 weeks ? Experimental group at 12 weeks ? Experimental group at 16?weeks ? Control group at 4 weeks ? Control group at 8 weeks ? Control group at 12 weeks ? Control group at 16 weeks Fig. 3 Safranin O staining observations of nucleus pulposus in 2 groups at each time point postoperatively (×400) Arrow indicated the nucleus pulposus cells ? Experimental group at 4 weeks ? Experimental group at 8 weeks ? Experimental group at 12 weeks ? Experimental group at 16 weeks ? Control group at 4 weeks ? Control group at 8 weeks ? Control group at 12 weeks ? Control group at 16 weeks
2.4.2 番紅O染色
對照組術后4、8、12周椎間盤髓核細胞呈紫紅色，分布均勻，染色均一；16周髓核細胞略減少。實驗組術后4周椎間盤髓核細胞呈紫紅色，分布情況尚可；8周髓核細胞略減少，仍呈紫紅色；12周髓核細胞染色變淡，并出現分布不均；16周髓核細胞明顯減少，染色更淡。見圖 3。
3 討論
隨著人們生活方式的改變，臨床上LDH患者急劇增加，并向低齡化發展。因LDH不易治愈，且易反復發作，成為了臨床一大難題。對其發病機制，目前多認為是IDD導致髓核突出或脫出，壓迫神經根而產生疼痛麻木等不適，亦可能是炎性反應所致，但確切機制尚未明了。動物模型是研究IDD發生機制及LDH發病機制的實驗基礎，目前制作IDD動物模型的方法主要分為自然退變和實驗誘導。自然退變有高鹽飲食制造地中海沙鼠IDD模型[5]、采用截除雙前肢建立雙后肢大鼠IDD模型[6]、隨年齡增長椎間盤自發性退變改變[7]等。實驗誘導包括改變脊柱力學特性和破壞椎間盤組織模型，具體方法有增加椎體間剪切應力[8]或改變椎間盤血供[9]以促使椎間盤退變，其中以纖維穿刺法較為常用[10-11]。既往多采用腹部切開直視下進行纖維環穿刺破壞，這種方法創傷較大，與人類椎間盤的自然退變不相符，不能體現IDD的客觀規律[12-13]。因此，近年來有學者研究通過微創手術建立IDD模型[3, 14]，主要通過針刺后抽吸髓核組織來促使其退變[1-2]，但此方法需將髓核組織部分抽出，不能體現髓核組織的退變過程。
Kim等[15]分別使用16G、18G、21G穿刺針穿刺纖維環制備IDD動物模型，發現21G穿刺針造模后未能引起椎間盤退變，而18G和16G穿刺針穿刺均成功制備模型，提示穿刺針直徑會影響模型制備。吳健等[16]采用21G穿刺針穿刺并抽吸部分髓核組織方法成功制備IDD動物模型。本實驗采用18G穿刺針穿刺纖維環后，不抽吸髓核組織，而是在C臂X線機定位監測下使穿刺針進入椎間隙，穿過纖維環到達髓核組織，然后旋轉針體，使針尖切割髓核組織以促使其退變，術后MRI和組織學觀察提示，IDD模型制備成功。我們認為本實驗采用的方法解決了切開暴露范圍較大的問題，減少了手術時間，減輕對實驗動物的創傷，降低死亡率和感染風險。術后實驗組動物均存活至實驗完成。
正常椎間盤由外圍的纖維環、內部的髓核及上、下軟骨終板構成。MRI T2加權像能夠清晰顯示椎間盤信號強度，以反映髓核內的水分及蛋白多糖含量[2]，故臨床上常將MRI檢測作為診斷IDD的金標準。有研究[3]采用經皮微創穿刺L3、4、L4、5、L5、6纖維環制備兔IDD模型，以自身L2、3、L6、7作對照，處理后4、8、12周行MRI檢測，結果也發現造模組椎間盤信號強度明顯降低，且隨時間延長，降低強度呈加重趨勢。參考文獻[17]方法，本實驗以術后4周作為觀察起始點，通過MRI觀察術后不同時間點IDD情況。結果顯示，隨時間延長，實驗組椎間盤在MRI T2加權像上信號呈現逐漸降低趨勢，而對照組信號強度降低不明顯，與以上研究報道結果相同。
本實驗選用Masson染色和番紅O染色行組織學觀察，Masson染色可使膠原纖維、軟骨染成藍色，肌纖維、細胞質染成紅色，細胞核染成藍褐色，可清晰觀察纖維環膠原纖維的變化；番紅O染色可以反映蛋白聚糖含量及其分布[18-19]。Masson染色示實驗組術后4周膠原纖維排列尚整齊，呈同心圓狀；8周開始即出現少許紊亂現象，說明椎間盤開始退變；12周時退變進一步加重，纖維環排列紊亂，層次開始模糊不清，裂隙增大增寬；至16周時已無明顯分層現象，纖維環膠原纖維甚至斷裂，提示退變嚴重。而對照組纖維環至16周時仍可見同心圓狀排列，部分膠原纖維出現小裂隙，提示椎間盤僅有部分退變，與MRI檢測結果相符。番紅O染色示實驗組髓核細胞在術后4周染色仍呈深紅色，從8周開始染色逐漸變淺，12、16周染色明顯變淺；而對照組至16周才有部分髓核細胞減少。
綜上述，C臂X線機引導下采用微創針刺旋切法可成功建立兔IDD模型。其局限在于操作者經皮穿刺纖維環有一定難度，正確穿刺、避免反復操作是減少創傷、降低脊髓神經誤傷率和實驗動物死亡率的關鍵。
腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是骨科常見病、多發病，以一側下肢疼痛麻木或腰部疼痛為主要臨床癥狀，多認為是椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）引起髓核突出，從而壓迫神經產生癥狀，但對于IDD的確切發生機制目前尚未明確。因此，需要通過一種安全有效的IDD動物模型來研究相關病變機制。但目前對IDD動物模型建立方法尚未達成共識，近年多采用纖維環穿刺法和穿刺后抽吸髓核組織法，均存在一些不足[1-3]。我們設計了微創針刺旋切建立兔IDD模型的方法，本次實驗旨在探討該方法可行性，以期為研究LDH病變機制提供一種新的造模方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡新西蘭大白兔40只，雌雄不限，體質量（2.9±0.3）kg，MRI檢查椎間盤均正常，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。利多卡因注射液（山西晉新雙鶴藥業有限責任公司）；戊巴比妥鈉（Sigma公司，美國）；注射用生理鹽水（安徽豐源藥業股份有限公司）；注射用青霉素鈉（廣州白云山天心制藥股份有限公司）；Masson染色試劑盒（上海博谷生物科技有限公司）；甲醛液（上海瀘震實業有限公司）；番紅O染色液（北京索萊寶科技有限公司）。18G穿刺針、C臂X線機（ZIEM公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
將實驗動物隨機分為2組，每組20只。實驗組采用微創穿刺后旋切髓核組織建立IDD模型，具體步驟：動物四肢固定后俯臥于桌面上，軟墊墊高腹部，一側下肢肌肉注射青霉素鈉（40萬U/只）預防感染。于髂嵴最高點平L7棘突，定位L4、L5、L6棘突及關節突，局麻后取18G穿刺針以右外側約45°角度進針，C臂X線機透視下經椎間盤后外側刺入L4、5、L5、6椎間隙，針尖位于髓核內；采用針體旋轉法帶動針尖旋切髓核組織，順、逆時針旋轉360°各1次，以促使其退變。退出穿刺針、消毒，動物常規飼養。對照組不作任何處理。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察實驗組動物術后存活情況以及精神狀態、四肢活動度。
1.3.2 MRI觀察
術前及術后4、8、12、16周每組各取10只動物行MRI檢測。具體方法：觀察前禁食、水24?h，動物肌肉注射3%戊巴比妥鈉（1.2?mL/kg）麻醉，四肢固定于木板上（耳內塞入少許棉花以減少MRI噪聲的刺激），行MRI觀察。T2加權像：脈沖重復間隔時間/回波時間3 000 ms/125 ms，層厚2?mm，層間距1 mm。以Pfirrmann分級法[4]評價椎間盤退變程度。
1.3.3 大體及組織學觀察
術后各時間點MRI觀察后，各組隨機取2只動物采用耳緣靜脈注射空氣處死。取背部正中切口，分離棘突兩旁肌肉組織，暴露L1～7棘突及關節突，剪下L1～7整個脊柱，無菌生理鹽水沖洗，自腹側取出整個椎間盤。大體觀察髓核組織含水量及顏色、光澤。然后將椎間盤置于甲醛固定，常規脫水包埋，切片，行Masson染色和番紅O染色，鏡下觀察椎間盤纖維環及髓核變化。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。等級資料組間比較采用秩和檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗組所有動物術后均存活，術后2 d四肢活動度好，精神狀態較術前未見明顯改變。
2.2 MRI觀察
對照組MRI T2加權像示觀察早期椎間盤信號強度未見明顯改變，后期略減弱；實驗組椎間盤信號強度隨時間延長呈減弱趨勢。見圖 1。根據Pfirrmann分級法評價椎間盤退變程度顯示，隨時間延長，兩組椎間盤退變程度均逐漸加重，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。兩組間比較除術后4周差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余術后各時間點實驗組椎間盤退變程度均重于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
圖1
術后各時間點兩組MRI觀察??箭頭示實驗節段 ? 實驗組4周 ? 實驗組8周 ? 實驗組12周 ? 實驗組16周 ? 對照組4周 ? 對照組8周 ? 對照組12周 ? 對照組16周
Figure1.
MRI results of 2 groups at each time point postoperatively Arrow indicated experimental disc ? Experimental group at 4 weeks ? Experimental group at 8 weeks ? Experimental group at 12 weeks ? Experimental group at 16 weeks ? Control group at 4 weeks ? Control group at 8 weeks ? Control group at 12 weeks ? Control group at 16 weeks
表1
術后各時間點兩組Pfirrmann分級比較
Table1.
Pfirrmann grading comparison between 2 groups after operation
2.3 大體觀察
術后4周，對照組髓核透亮、含水量豐富，實驗組髓核顏色稍暗淡。8、12周時對照組髓核含水量略減少，顏色稍暗淡；實驗組髓核含水量明顯減少，顏色呈淡黃色。16周時對照組髓核含水量減少，實驗組髓核含水量較對照組明顯減少，呈干癟樣。
2.4 組織學觀察
2.4.1 Masson染色
對照組術后4、8周時椎間盤纖維環是以髓核為中心的同心圓形分層結構，排列整齊；12、16周纖維環出現排列不規整，但分層結構仍完整。實驗組術后4周椎間盤纖維環的同心圓形分層結構尚排列規整；8周排列出現部分紊亂，有少量裂隙存在；12周纖維環排列紊亂加重，裂隙增多；16周纖維環排列紊亂程度進一步加重，甚至出現斷裂不能連續現象。見圖 2。
圖2
各時間點兩組椎間盤纖維環Masson染色觀察（×200）箭頭示纖維環排列情況 ? 實驗組4周 ? 實驗組8周 ? 實驗組12周 ? 實驗組16周 ? 對照組4周 ? 對照組8周 ? 對照組12周 ? 對照組16周 圖 3各時間點兩組椎間盤髓核番紅O染色觀察（×400）箭頭示髓核細胞 ? 實驗組4周 ? 實驗組8周 ? 實驗組12周 ? 實驗組16周 ? 對照組4周 ? 對照組8周 ? 對照組12周 ? 對照組16周
Figure2.
Masson staining observations of annulus in 2 groups at each time point postoperatively (×200) Arrow indicated the arrangement of the annulus ? Experimental group at 4 weeks ? Experimental group at 8 weeks ? Experimental group at 12 weeks ? Experimental group at 16?weeks ? Control group at 4 weeks ? Control group at 8 weeks ? Control group at 12 weeks ? Control group at 16 weeks Fig. 3 Safranin O staining observations of nucleus pulposus in 2 groups at each time point postoperatively (×400) Arrow indicated the nucleus pulposus cells ? Experimental group at 4 weeks ? Experimental group at 8 weeks ? Experimental group at 12 weeks ? Experimental group at 16 weeks ? Control group at 4 weeks ? Control group at 8 weeks ? Control group at 12 weeks ? Control group at 16 weeks
2.4.2 番紅O染色
對照組術后4、8、12周椎間盤髓核細胞呈紫紅色，分布均勻，染色均一；16周髓核細胞略減少。實驗組術后4周椎間盤髓核細胞呈紫紅色，分布情況尚可；8周髓核細胞略減少，仍呈紫紅色；12周髓核細胞染色變淡，并出現分布不均；16周髓核細胞明顯減少，染色更淡。見圖 3。
3 討論
隨著人們生活方式的改變，臨床上LDH患者急劇增加，并向低齡化發展。因LDH不易治愈，且易反復發作，成為了臨床一大難題。對其發病機制，目前多認為是IDD導致髓核突出或脫出，壓迫神經根而產生疼痛麻木等不適，亦可能是炎性反應所致，但確切機制尚未明了。動物模型是研究IDD發生機制及LDH發病機制的實驗基礎，目前制作IDD動物模型的方法主要分為自然退變和實驗誘導。自然退變有高鹽飲食制造地中海沙鼠IDD模型[5]、采用截除雙前肢建立雙后肢大鼠IDD模型[6]、隨年齡增長椎間盤自發性退變改變[7]等。實驗誘導包括改變脊柱力學特性和破壞椎間盤組織模型，具體方法有增加椎體間剪切應力[8]或改變椎間盤血供[9]以促使椎間盤退變，其中以纖維穿刺法較為常用[10-11]。既往多采用腹部切開直視下進行纖維環穿刺破壞，這種方法創傷較大，與人類椎間盤的自然退變不相符，不能體現IDD的客觀規律[12-13]。因此，近年來有學者研究通過微創手術建立IDD模型[3, 14]，主要通過針刺后抽吸髓核組織來促使其退變[1-2]，但此方法需將髓核組織部分抽出，不能體現髓核組織的退變過程。
Kim等[15]分別使用16G、18G、21G穿刺針穿刺纖維環制備IDD動物模型，發現21G穿刺針造模后未能引起椎間盤退變，而18G和16G穿刺針穿刺均成功制備模型，提示穿刺針直徑會影響模型制備。吳健等[16]采用21G穿刺針穿刺并抽吸部分髓核組織方法成功制備IDD動物模型。本實驗采用18G穿刺針穿刺纖維環后，不抽吸髓核組織，而是在C臂X線機定位監測下使穿刺針進入椎間隙，穿過纖維環到達髓核組織，然后旋轉針體，使針尖切割髓核組織以促使其退變，術后MRI和組織學觀察提示，IDD模型制備成功。我們認為本實驗采用的方法解決了切開暴露范圍較大的問題，減少了手術時間，減輕對實驗動物的創傷，降低死亡率和感染風險。術后實驗組動物均存活至實驗完成。
正常椎間盤由外圍的纖維環、內部的髓核及上、下軟骨終板構成。MRI T2加權像能夠清晰顯示椎間盤信號強度，以反映髓核內的水分及蛋白多糖含量[2]，故臨床上常將MRI檢測作為診斷IDD的金標準。有研究[3]采用經皮微創穿刺L3、4、L4、5、L5、6纖維環制備兔IDD模型，以自身L2、3、L6、7作對照，處理后4、8、12周行MRI檢測，結果也發現造模組椎間盤信號強度明顯降低，且隨時間延長，降低強度呈加重趨勢。參考文獻[17]方法，本實驗以術后4周作為觀察起始點，通過MRI觀察術后不同時間點IDD情況。結果顯示，隨時間延長，實驗組椎間盤在MRI T2加權像上信號呈現逐漸降低趨勢，而對照組信號強度降低不明顯，與以上研究報道結果相同。
本實驗選用Masson染色和番紅O染色行組織學觀察，Masson染色可使膠原纖維、軟骨染成藍色，肌纖維、細胞質染成紅色，細胞核染成藍褐色，可清晰觀察纖維環膠原纖維的變化；番紅O染色可以反映蛋白聚糖含量及其分布[18-19]。Masson染色示實驗組術后4周膠原纖維排列尚整齊，呈同心圓狀；8周開始即出現少許紊亂現象，說明椎間盤開始退變；12周時退變進一步加重，纖維環排列紊亂，層次開始模糊不清，裂隙增大增寬；至16周時已無明顯分層現象，纖維環膠原纖維甚至斷裂，提示退變嚴重。而對照組纖維環至16周時仍可見同心圓狀排列，部分膠原纖維出現小裂隙，提示椎間盤僅有部分退變，與MRI檢測結果相符。番紅O染色示實驗組髓核細胞在術后4周染色仍呈深紅色，從8周開始染色逐漸變淺，12、16周染色明顯變淺；而對照組至16周才有部分髓核細胞減少。
綜上述，C臂X線機引導下采用微創針刺旋切法可成功建立兔IDD模型。其局限在于操作者經皮穿刺纖維環有一定難度，正確穿刺、避免反復操作是減少創傷、降低脊髓神經誤傷率和實驗動物死亡率的關鍵。
