引用本文： 王植, 田曉紅, 柏樹令. 脂肪來源干細胞復合3D打印支架構建工程化組織的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(3): 320-322. doi: 10.7507/1002-1892.20160063 復制
3D打印技術是一種分層加工、疊加成型技術，通過連續的物理層疊加，逐層添加材料制備3D實體[1-4]。該技術在醫學領域也得到廣泛應用，通過獲取患者病變/缺損組織CT、MRI等數據，運用數控成型和軟件分層離散方法構建3D模型，然后打印機按照所獲得的虛擬“切片”，用合適的生物材料逐層打印并堆積，制造組織器官、醫療輔助用具和人工支架等生物醫學產品[5-7]。
Zuk等[8]首先發現脂肪組織中一種成纖維細胞樣的細胞群體在體外具有多向分化潛能，之后國際脂肪利用科技學會定義從脂肪組織中分離出來并具有多向分化潛能的干細胞群稱為脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）。目前ADSCs已作為理想的種子細胞廣泛用于組織工程研究。
隨著組織工程學的發展，為解決臨床移植供體器官緊缺問題，學者們開始將3D打印支架與ADSCs結合，構建工程化組織或進行細胞治療，以期修復重建人體組織器官。現對其在脂肪組織、骨、軟骨、血管修復重建及肝細胞方面的相關研究作一綜述。
1 脂肪組織
自體脂肪移植可用于軟組織重建、創傷修復等，但脂肪植入體內后存在不能長時間耐受缺氧環境以及容易發生液化、惡變等問題。為解決自體脂肪移植的上述問題，有學者嘗試采用ADSCs-材料復合物移植修復脂肪組織。Pati等[9]采用生物支架材料聚己內酯[poly（ε-caprolactone），PCL]和裝載ADSCs的人脫細胞脂肪組織（decellularized adipose tissue，DAT）預凝膠進行3D生物打印，制備ADSCs-PCL復合物，然后將其植入成年裸鼠背部皮膚。結果顯示，支架中的ADSCs成脂肪細胞分化，而且支架內有血管生成，展現出良好的結構和功能。提示通過3D生物打印獲得的ADSCs-PCL復合物有望作為脂肪組織的替代品，滿足體內重構脂肪組織的需求。
Yu等[10]將由大鼠皮下脂肪組織分離培養的ADSCs，接種于3D打印制備的DAT支架，體外培養后經油紅O染色顯示，DAT支架具有脂肪傳導性和脂肪誘導性。然后將ADSCs-DAT復合物植入大鼠背部皮下，發現有功能性血管和成熟脂肪細胞生成。提示ADSCs-DAT復合物具有促進軟組織再生和修復重建的潛力。
以上研究提示ADSCs種植于3D打印支架有望用于脂肪組織修復重建，但是研究采用的DAT中仍有少量細胞外基質，會引起機體炎性反應；此外PCL硬度大于脂肪組織，由該材料制備的支架與脂肪組織機械性不匹配，容易導致并發癥。所以，下一步研究應著眼于減少ADSCs-材料復合物的炎性反應和并發癥，并進行臨床試驗研究。
2 骨
構建功能和結構與天然骨相似的支架材料是骨組織工程研究重點之一。Lee等[11]將ADSCs接種至3D打印制備的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]支架上，然后用其修復成年Lewis大鼠下頜骨5 mm缺損模型。植入12周后觀察見下頜骨缺損處愈合，提示ADSCs-PLGA復合物具有修復重建大鼠口顎部缺損的潛力。Caetano等[12]采用3D打印技術制備PCL多孔支架，然后將人ADSCs接種至支架上，并誘導其向成骨細胞方向分化；21 d后觀察見ADSCs已進入支架內部，且茜素紅S染色提示有含鈣物質產生，表明其已向成骨細胞方向分化。
由于鈦具有優異的耐腐蝕性、良好的生物適應性以及對MRI無干擾等特點，被認為是理想的骨植入材料。因此，Guneta等[13]選擇鈦粉作為3D打印材料制備多孔支架，然后接種ADSCs；觀察發現支架中細胞生存力明顯提高，提示可以選擇鈦材料制備與骨組織性質匹配的多孔支架，以及個體化金屬骨移植物。
近年，有關3D打印支架復合ADSCs誘導分化為骨組織的研究越來越多，使用可吸收、降解材料進行3D打印，并加強體內實驗，是骨組織工程研究的方向。
3 軟骨
關節軟骨自我修復再生能力有限，采用組織工程技術構建組織工程軟骨修復軟骨缺損已成為研究熱點。3D結構設計可以模仿天然軟骨環境，為軟骨再生奠定基礎。Ye等[14]將骨關節炎患者髕下脂肪墊中分離培養的ADSCs接種于3D打印制備的多孔殼聚糖支架上，并進行成軟骨誘導培養。4周后支架上可見珠狀亮白色軟骨樣組織，且Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖表達顯著增多。表明3D打印制備的多孔殼聚糖支架可作為一種傳遞介質，加強ADSCs黏附、增殖和分化成軟骨細胞，促進軟骨修復，有望應用于骨關節炎患者的臨床治療。Ahtiainen等[15]將由新西蘭白兔脂肪組織分離培養的ADSCs，分別接種于3D打印制備的含或不含殼聚糖支架上，并進行成軟骨誘導培養。結果發現，在含有殼聚糖的支架上，ADSCs分化過程更快，成本效率更高，實驗更安全，為體內軟骨移植提供了參考。
目前，3D打印殼聚糖支架復合ADSCs在關節軟骨缺損修復方面的研究已較多，但殼聚糖支架在體內發揮的作用尚未明確，需要進一步研究完善。
4 血管
一個有效的血管網絡是工程化組織成功移植的前提。Zhao等[16]將SD大鼠附睪皮下脂肪組織分離培養的ADSCs與膠原纖維等混合后，注入3D打印制備的PLGA支架。培養7 d后將細胞分為3組，每天于培養基中加入定量VEGF和bFGF，分別重復3、5、7 d，誘導ADSCs向血管內皮細胞方向分化；再加入向平滑肌細胞方向誘導的TGF-β、FGF等生長因子。結果顯示，經誘導培養后大部分ADSCs存活，且混合物與支架無分離；而且加入VEGF和bFGF次數越多，ADSCs越趨向于向血管內皮細胞方向分化。在加入VEGF和bFGF 5?d組，內皮細胞和平滑肌細胞的結構比例接近于正常血管。
Temple等[17]將人皮下脂肪分離培養的ADSCs接種于3D打印制備的PCL支架上，向血管方向誘導培養14?d后移植至7周齡雄性裸鼠背部皮下；14?d后觀察顯示支架結構完整，支架內出現血管網狀細胞，血管密度增加，說明ADSCs可在3D打印支架上誘導形成血管，為工程化組織的體內植入實驗奠定基礎。
除在構建的工程化組織中誘導生成血管外，由于各種原因造成的血管損傷，如動脈粥樣硬化、壞死、血管栓塞，也需要修復再生，因此通過ADSCs復合3D打印支架構建工程化血管也是目前研究發展方向。
5 肝細胞
功能性肝細胞是細胞移植、肝臟組織工程、藥物代謝及毒性等研究的重要細胞來源。通常采用原代肝細胞（primary hepatocytes，PHs）進行研究，但PHs存在來源有限、在體外培養過程中容易突變等不足[18]。因此，用經3D打印支架-ADSCs培養體系誘導獲得的功能性肝細胞替代PHs，成為當前重要研究目標。
Lee等[19]以草酸鹽、膠原蛋白/細胞外基質作為生物墨水，與人ADSCs一并經3D生物打印技術構建復合物，并在肝細胞誘導介質培養基上進行培養。結果表明，在支架中檢測到白蛋白、色氨酸2，3-加雙氧酶等物質，提示存在肝細胞特異性基因表達。表明3D打印技術為肝組織再生提供了一個新的研究方向。
目前，關于ADSCs復合3D打印支架在肝細胞方面的研究較少，需深入研究其替代PHs進行損傷肝細胞修復的可行性，進而探討培養具有正常功能人工肝臟的可能性。
6 存在的問題
由于3D打印支架尚處于研究初期，其在ADSCs接種后的增殖分化和形態功能形成過程中發揮的作用尚不清楚。研究發現[20-21]ADSCs在多孔支架中分布不均勻，中央區域細胞明顯較少，而表面部分區域細胞成簇出現，但未與支架融合。另外，一些特異性標志物僅存在于支架表面，并且與微載體技術相比，與3D打印支架復合培養所用ADSCs數量較多。此外，目前3D打印支架復合ADSCs的相關研究以體外觀察為主，僅有少量動物體內植入實驗，且缺乏對照研究，因此其能否用于臨床治療有待進一步研究明確。隨著組織工程學及相關學科的發展，3D打印支架-ADSCs復合物的相關研究也會越來越深入，以期改變傳統組織、器官修復方式，進而解決器官移植供體緊缺等問題。
3D打印技術是一種分層加工、疊加成型技術，通過連續的物理層疊加，逐層添加材料制備3D實體[1-4]。該技術在醫學領域也得到廣泛應用，通過獲取患者病變/缺損組織CT、MRI等數據，運用數控成型和軟件分層離散方法構建3D模型，然后打印機按照所獲得的虛擬“切片”，用合適的生物材料逐層打印并堆積，制造組織器官、醫療輔助用具和人工支架等生物醫學產品[5-7]。
Zuk等[8]首先發現脂肪組織中一種成纖維細胞樣的細胞群體在體外具有多向分化潛能，之后國際脂肪利用科技學會定義從脂肪組織中分離出來并具有多向分化潛能的干細胞群稱為脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）。目前ADSCs已作為理想的種子細胞廣泛用于組織工程研究。
隨著組織工程學的發展，為解決臨床移植供體器官緊缺問題，學者們開始將3D打印支架與ADSCs結合，構建工程化組織或進行細胞治療，以期修復重建人體組織器官。現對其在脂肪組織、骨、軟骨、血管修復重建及肝細胞方面的相關研究作一綜述。
1 脂肪組織
自體脂肪移植可用于軟組織重建、創傷修復等，但脂肪植入體內后存在不能長時間耐受缺氧環境以及容易發生液化、惡變等問題。為解決自體脂肪移植的上述問題，有學者嘗試采用ADSCs-材料復合物移植修復脂肪組織。Pati等[9]采用生物支架材料聚己內酯[poly（ε-caprolactone），PCL]和裝載ADSCs的人脫細胞脂肪組織（decellularized adipose tissue，DAT）預凝膠進行3D生物打印，制備ADSCs-PCL復合物，然后將其植入成年裸鼠背部皮膚。結果顯示，支架中的ADSCs成脂肪細胞分化，而且支架內有血管生成，展現出良好的結構和功能。提示通過3D生物打印獲得的ADSCs-PCL復合物有望作為脂肪組織的替代品，滿足體內重構脂肪組織的需求。
Yu等[10]將由大鼠皮下脂肪組織分離培養的ADSCs，接種于3D打印制備的DAT支架，體外培養后經油紅O染色顯示，DAT支架具有脂肪傳導性和脂肪誘導性。然后將ADSCs-DAT復合物植入大鼠背部皮下，發現有功能性血管和成熟脂肪細胞生成。提示ADSCs-DAT復合物具有促進軟組織再生和修復重建的潛力。
以上研究提示ADSCs種植于3D打印支架有望用于脂肪組織修復重建，但是研究采用的DAT中仍有少量細胞外基質，會引起機體炎性反應；此外PCL硬度大于脂肪組織，由該材料制備的支架與脂肪組織機械性不匹配，容易導致并發癥。所以，下一步研究應著眼于減少ADSCs-材料復合物的炎性反應和并發癥，并進行臨床試驗研究。
2 骨
構建功能和結構與天然骨相似的支架材料是骨組織工程研究重點之一。Lee等[11]將ADSCs接種至3D打印制備的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]支架上，然后用其修復成年Lewis大鼠下頜骨5 mm缺損模型。植入12周后觀察見下頜骨缺損處愈合，提示ADSCs-PLGA復合物具有修復重建大鼠口顎部缺損的潛力。Caetano等[12]采用3D打印技術制備PCL多孔支架，然后將人ADSCs接種至支架上，并誘導其向成骨細胞方向分化；21 d后觀察見ADSCs已進入支架內部，且茜素紅S染色提示有含鈣物質產生，表明其已向成骨細胞方向分化。
由于鈦具有優異的耐腐蝕性、良好的生物適應性以及對MRI無干擾等特點，被認為是理想的骨植入材料。因此，Guneta等[13]選擇鈦粉作為3D打印材料制備多孔支架，然后接種ADSCs；觀察發現支架中細胞生存力明顯提高，提示可以選擇鈦材料制備與骨組織性質匹配的多孔支架，以及個體化金屬骨移植物。
近年，有關3D打印支架復合ADSCs誘導分化為骨組織的研究越來越多，使用可吸收、降解材料進行3D打印，并加強體內實驗，是骨組織工程研究的方向。
3 軟骨
關節軟骨自我修復再生能力有限，采用組織工程技術構建組織工程軟骨修復軟骨缺損已成為研究熱點。3D結構設計可以模仿天然軟骨環境，為軟骨再生奠定基礎。Ye等[14]將骨關節炎患者髕下脂肪墊中分離培養的ADSCs接種于3D打印制備的多孔殼聚糖支架上，并進行成軟骨誘導培養。4周后支架上可見珠狀亮白色軟骨樣組織，且Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖表達顯著增多。表明3D打印制備的多孔殼聚糖支架可作為一種傳遞介質，加強ADSCs黏附、增殖和分化成軟骨細胞，促進軟骨修復，有望應用于骨關節炎患者的臨床治療。Ahtiainen等[15]將由新西蘭白兔脂肪組織分離培養的ADSCs，分別接種于3D打印制備的含或不含殼聚糖支架上，并進行成軟骨誘導培養。結果發現，在含有殼聚糖的支架上，ADSCs分化過程更快，成本效率更高，實驗更安全，為體內軟骨移植提供了參考。
目前，3D打印殼聚糖支架復合ADSCs在關節軟骨缺損修復方面的研究已較多，但殼聚糖支架在體內發揮的作用尚未明確，需要進一步研究完善。
4 血管
一個有效的血管網絡是工程化組織成功移植的前提。Zhao等[16]將SD大鼠附睪皮下脂肪組織分離培養的ADSCs與膠原纖維等混合后，注入3D打印制備的PLGA支架。培養7 d后將細胞分為3組，每天于培養基中加入定量VEGF和bFGF，分別重復3、5、7 d，誘導ADSCs向血管內皮細胞方向分化；再加入向平滑肌細胞方向誘導的TGF-β、FGF等生長因子。結果顯示，經誘導培養后大部分ADSCs存活，且混合物與支架無分離；而且加入VEGF和bFGF次數越多，ADSCs越趨向于向血管內皮細胞方向分化。在加入VEGF和bFGF 5?d組，內皮細胞和平滑肌細胞的結構比例接近于正常血管。
Temple等[17]將人皮下脂肪分離培養的ADSCs接種于3D打印制備的PCL支架上，向血管方向誘導培養14?d后移植至7周齡雄性裸鼠背部皮下；14?d后觀察顯示支架結構完整，支架內出現血管網狀細胞，血管密度增加，說明ADSCs可在3D打印支架上誘導形成血管，為工程化組織的體內植入實驗奠定基礎。
除在構建的工程化組織中誘導生成血管外，由于各種原因造成的血管損傷，如動脈粥樣硬化、壞死、血管栓塞，也需要修復再生，因此通過ADSCs復合3D打印支架構建工程化血管也是目前研究發展方向。
5 肝細胞
功能性肝細胞是細胞移植、肝臟組織工程、藥物代謝及毒性等研究的重要細胞來源。通常采用原代肝細胞（primary hepatocytes，PHs）進行研究，但PHs存在來源有限、在體外培養過程中容易突變等不足[18]。因此，用經3D打印支架-ADSCs培養體系誘導獲得的功能性肝細胞替代PHs，成為當前重要研究目標。
Lee等[19]以草酸鹽、膠原蛋白/細胞外基質作為生物墨水，與人ADSCs一并經3D生物打印技術構建復合物，并在肝細胞誘導介質培養基上進行培養。結果表明，在支架中檢測到白蛋白、色氨酸2，3-加雙氧酶等物質，提示存在肝細胞特異性基因表達。表明3D打印技術為肝組織再生提供了一個新的研究方向。
目前，關于ADSCs復合3D打印支架在肝細胞方面的研究較少，需深入研究其替代PHs進行損傷肝細胞修復的可行性，進而探討培養具有正常功能人工肝臟的可能性。
6 存在的問題
由于3D打印支架尚處于研究初期，其在ADSCs接種后的增殖分化和形態功能形成過程中發揮的作用尚不清楚。研究發現[20-21]ADSCs在多孔支架中分布不均勻，中央區域細胞明顯較少，而表面部分區域細胞成簇出現，但未與支架融合。另外，一些特異性標志物僅存在于支架表面，并且與微載體技術相比，與3D打印支架復合培養所用ADSCs數量較多。此外，目前3D打印支架復合ADSCs的相關研究以體外觀察為主，僅有少量動物體內植入實驗，且缺乏對照研究，因此其能否用于臨床治療有待進一步研究明確。隨著組織工程學及相關學科的發展，3D打印支架-ADSCs復合物的相關研究也會越來越深入，以期改變傳統組織、器官修復方式，進而解決器官移植供體緊缺等問題。