引用本文： 賈瀛嫻, 李尚為, 汪燕. MSCs在女性生育力保存中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(3): 314-319. doi: 10.7507/1002-1892.20160062 復制
生殖醫學和深低溫生物學的發展，使得女性生育力保存（fertility preservation，FP）技術得以實施。FP所涵蓋范圍較廣泛，它不僅指推遲生育年齡的健康人，也包括因某些疾病影響生育的患者。目前最新的《美國臨床腫瘤學會臨床實踐指南》已將腫瘤患者的FP納入參考[1]。根據荷蘭的一項問卷調查結果，雖然分診至FP中心的總體人數在上升，但獲得治療的患者僅占極少部分[2]，諸多原因使需要保存生育力的女性患者未得到有效的FP治療，導致其推遲或失去生育機會，對生活質量產生長期不良影響。除了社會因素外，疾病本身比如各種因素導致的卵泡耗竭、間質纖維化和血管損傷等，也可能使卵巢功能嚴重受損。如何修復受損的卵巢功能和保存女性生育能力成為國內外學者研究的重點。
自21世紀以來，人們對MSCs在組織修復再生、恢復功能、免疫抑制等諸多方面的應用進行了探究。目前，MSCs已用于治療多種組織損傷性疾病，如神經[3-4]、心肌[5-6]、肝[7]、肺[8]、骨骼[9]、肌肉[10]等；另外，MSCs還可在特定條件下向生殖干細胞（oogonial stem cells，OSCs）或卵母細胞樣細胞分化[11-13]，顯示了其強大的臨床應用價值。現對MSCs在FP中的研究進展進行綜述，為優化該技術，提高患者生育力的研究提供參考，為預防和解決卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）、保存和恢復女性生殖內分泌功能探索新的思路。
1 女性FP的背景
1.1 女性生育力下降的原因
1.1.1 醫源性因素
調查數據顯示，美國每年有60萬女性被確診為癌癥，其中10%患者年齡在40歲以下，12%乳腺癌患者年齡在35歲以下[14]，提示惡性腫瘤發病呈年輕化趨勢。另外，目前癌癥女性患者5年生存率達64%[15]，通過腫瘤診斷和治療技術的發展顯著提高了腫瘤患者的平均壽命。但卵巢組織對有細胞毒性的治療，特別是烷化劑（如環磷酰胺）和放療非常敏感，可導致生育能力和生殖內分泌功能喪失，使這些接受治療的女性患者發生POF的風險增加。由于癌癥患者對FP認識的缺乏，以及腫瘤醫師未充分考慮治療方案對生育力的影響等原因[16]，也可能導致女性患者錯失保存生育力的機會[17]。除了腫瘤患者，因各種結締組織疾病（如系統性紅斑狼瘡）、血液系統疾病（如接受自體或同種異體骨髓移植者）、神經系統疾病（如多發性硬化病）也需要服用大劑量烷化劑等化療和/或放療進行預處理的患者，同樣面臨著卵泡耗竭的危險。經造血干細胞移植、骨髓移植治療后，患者發生生育力下降和卵巢功能不足的風險超過80%[18]。此外，利用卵巢抗原作為免疫避孕疫苗或卵巢相關疾病（如卵巢巧克力囊腫剝除）術后[19]也可能造成醫源性卵巢損傷，最終導致女性生育力下降。
1.1.2 其他原因
目前，由于經濟壓力、晚婚率和離婚率逐漸升高等原因，使得很多國家女性推遲生育的現象越來越普遍。據統計，這類女性將生育計劃安排至35歲以后甚至更大年齡。美國生殖醫學協會統計顯示，2003年－2009年年齡40歲以上因不孕癥就診的女性數量從9%增長至41%[20]。高齡女性發生生理性卵巢儲備低下以卵巢功能衰退為主要內分泌改變，引起一系列生理、病理變化，對這類健康女性的生育力造成不可逆轉的影響。此外，越來越多研究發現環境污染對人生育力的不良影響[21-23]。目前，全球不孕癥患病率達9%，其中15%病因不明[24]。由于損失時間短，不能用基因改變來解釋，因此發病趨勢可能與環境污染物有關[25]。學者將進入機體后能干擾體內正常內分泌物質合成、釋放、轉運、代謝、結合、作用和排出等過程的外源性化學物質統稱為環境內分泌干擾物（endocrine disruptors，EDs）[26]。EDs在自然界中廣泛存在，可通過食品、水、空氣等多種途徑進入食物鏈，因具有脂溶性及不易降解的特點，使其在人體和動物體內長期蓄積并通過食物鏈富集。這些有害物質可以受體激動劑或拮抗劑作用方式，模擬激活或阻斷靶細胞對相應激素的反應，對女性生育力造成損害。研究發現[21, 27-29]，EDs可能通過改變卵泡微環境，使卵子質量下降，影響卵泡發育、卵母細胞成熟及卵巢功能，造成機體生殖能力下降，可見EDs毒性作用嚴重影響女性生殖健康。
綜上述，女性生育力下降可能是一個或多個因素造成。這些因素使女性卵巢儲備下降，出現竇卵泡數減少、閉經、月經期縮短、黃體功能不足等卵巢功能損傷表現，最終對生育力造成不可逆轉的后果，嚴重影響患者生活質量。
1.2 女性FP技術介紹
目前，保存女性生育力的主要技術包括：卵子冷凍、胚胎冷凍、卵巢移位、不成熟卵母細胞的體外培養成熟、卵巢組織冷凍保存（ovarian tissue cryopreservation，OTC）及再植等[30]。其中，OTC手術操作相對簡便，能一次性獲得大量各階段卵泡，且不受有無配偶的限制。其手術創傷小，患者術后即可開始腫瘤治療（包括盆腔放療），不延誤病情，還可避免促排卵過程中引起的其他不良后果，如腫瘤惡化、腫瘤轉移、卵巢過度刺激等。卵巢組織通過移植可重新啟動卵泡的生長發育、月經期規律、正常性激素水平，恢復卵巢功能。有生育要求的患者多可自然受孕或求助于輔助生殖技術獲得后代，對其日后生理、心理健康意義重大[31]。OTC技術也可用于其他原因引起的卵巢功能減退健康女性，最終改善其生育能力。近年來，凍存卵巢組織移植已取得了較大進展，全世界經OCT技術后的活產報道已有42例[26-27, 32-33]。但是，卵巢組織復蘇后如何經體外培養獲得健康成熟的卵子、如何減輕免疫排斥反應和移植后組織缺血再灌注損傷，從而促使移植物功能的早期恢復，延長移植物的生存年限等問題，仍是OTC技術有待解決的主要難點。
2 MSCs與生殖細胞損傷修復
2.1 MSCs的來源及功能
干細胞是近年來細胞生物學和醫學研究中最熱門的課題之一。干細胞是來自胚胎、胎兒或成人的一類特殊細胞，具有長期自我復制能力和多向分化潛能。其中，MSCs因來源豐富（幾乎包括所有的器官和組織，如骨髓、肌肉、脂肪、臍帶血、胎盤等[34]），易于分離獲得及體外擴增[35]，具有多向分化潛能[36]、遷移能力、再生潛力，并因其在倫理道德、法律法規等方面的優勢，成為目前應用最多的干細胞及細胞移植理想的種子細胞。目前MSCs臨床應用廣泛，如用于肺纖維化修復、類風濕和肝硬化后肝功能修復等，并可作為基因治療的載體細胞[37-39]。由于MSCs無免疫原性，能避免移植排斥反應，可作為免疫調節劑[40]。
2.2 MSCs對生殖細胞修復應用的研究及作用機制
大多數腫瘤化療藥物都具有腺毒性。例如，順鉑是一類具有較強毒性的化療藥物，不僅抑制DNA的合成，導致DNA損害，還可引起細胞凋亡。Borovskaya等[41]發現順鉑可導致卵泡形態學破壞，細胞核裂解，卵泡上皮細胞死亡。臨床上放化療在極大程度緩解癌癥病情同時，也對卵巢組織造成嚴重不可逆損傷，導致POF，最終使腫瘤治療后患者生育力下降。
由于MSCs具有對受損組織細胞的修復作用，近年來許多研究提出采用MSCs對化療藥物損傷的卵巢組織進行干預，其中來源于骨髓的BMSCs應用最廣泛。Abd-Allah等[42]將BMSCs移植至接受環磷酰胺誘導POF的兔體內，發現卵巢體積、各級卵泡數等均較未移植細胞對照組明顯增加。Guo等[43]將BMSCs和卵巢顆粒細胞共培養，發現BMSCs可降低順鉑導致的大鼠顆粒細胞凋亡，將BMSCs移植至卵巢可降低圍絕經期大鼠卵巢顆粒細胞凋亡。這一作用可能與BMSCs分泌IGF-1、肝細胞生長因子和VEGF等有關。這一結論與Xu等[44]研究結果一致。Ghadami等[45]通過給促卵泡激素受體基因敲除小鼠靜脈移植BMSCs，發現其能到達小鼠卵巢，恢復卵泡成熟和類固醇激素產生。此外，有學者認為，BMSCs還可通過上調抗凋亡基因的表達，預防化療藥物對正常機體細胞的毒副作用[46]。
目前認為MSCs修復損傷后卵巢組織的機制可能為：①通過分泌細胞因子抑制靶細胞凋亡，修復受損組織細胞；②可采用多種分泌方式，表達相關因子，促進卵泡生長；③在特定微環境誘導下分化為受損組織的細胞，部分補償或替代其功能。
2.3 MSCs與卵巢組織移植后的血管重建
據文獻報道，卵巢組織凍融過程中有7%卵泡丟失，而在移植后血管再形成中可有65%卵泡丟失[47]。卵泡丟失的主要原因是移植后卵巢組織缺血缺氧，說明卵巢組織移植成功的關鍵在于移植后血管的再形成。卵巢組織移植是一種無血管吻合的卵巢組織皮質移植，由于沒有血管吻合，移植后卵巢組織的血供完全依靠周圍毛細血管的生長，在移植后48 h內組織處于缺血缺氧狀態，會造成大量卵泡破壞損傷。而血管生成是生理性創傷修復中的一個重要環節，包括新生血管網的增殖、成熟、退化3個階段，與一系列血管生成調節因子共同表達和參與有關，且受到嚴格調控。VEGF、FGF、TGF-β等多種生長因子均參與卵巢血管形成[48]。卵巢組織移植后，應盡早恢復對卵巢的供血和供氧，減少缺血再灌注損傷中的過量活性氧生成，可防止移植物功能恢復的延遲和功能衰竭，也是卵泡能否再發育的關鍵。
為尋找更有效方法誘導和加速移植卵巢組織的新生血管化過程，減少移植卵巢組織的缺血損傷，有研究者在卵巢培養系統中加入相關因子（如VEGF、bFGF[49]），結果顯示可明顯促進卵巢組織的新生血管生成、促進卵泡發育[50]。然而由于這些因子半衰期短、易降解且長期使用存在安全性因素等問題，限制了其今后在FP方面的應用。另外，研究發現促性腺激素（如重組人促卵泡刺激素、孕馬血清促性腺激素[51-52]）可調節卵巢內血管生長因子水平、促進卵泡發育，但目前關于外源性促性腺激素對同種異種卵巢組織移植后卵泡發育的作用及安全性尚存在爭議[51]。因此，應用生長相關因子或外源性激素促進移植后卵巢組織功能的方法有待進一步研究明確。
近年來，研究發現移植MSCs后能分泌如VEGF、bFGF、血管生成素、IL-6等多種促血管新生因子[53-56]。BMSCs與卵巢組織共培養后可明顯改善卵巢組織血管再生、促進卵泡生長[53]，從而改善其功能恢復，且BMSCs作用較添加生長相關因子更顯著。張芍等[57]將大鼠MSCs與竇前卵泡共培養，結果發現卵泡輪廓清楚，基底膜完整，卵母細胞中可見生發泡（germinal vesicle，GV），且較對照組（正常培養的竇前卵泡）獲得了更高的GV出現率，提示MSCs可促進卵泡中的卵母細胞生長、發育，抑制早期閉鎖，并能向成熟卵母細胞轉化。另外，有研究發現臍帶MSCs可特異性遷移歸巢至炎癥組織，通過旁分泌、定向分化等機制改善炎癥環境，對損傷組織進行修復[58-59]。當組織損傷或引起慢性炎癥時，損傷部位或炎癥區域會釋放特殊的內分泌信號，局部表達及分泌多種趨化因子、黏附因子、生長因子，這一系列微環境改變是MSCs歸巢的始動因素，導致MSCs向損傷部位遷移[60]，同時表達特異性受體或配體引導MSCs移動并黏附于損傷處[61]。因此，向缺血或損傷組織歸巢是MSCs重要的特征。
目前認為，MSCs促進血管生成主要有兩方面作用：①產生多種細胞因子和生長因子，如VEGF、bFGF、肝細胞生長因子、IL-1等，誘導血管發生[62-64]；②通過多種受體趨化，定向移動并可能分化為血管內皮細胞，參與缺血組織的血管形成，還可通過旁分泌作用刺激周圍內皮細胞增殖和遷移[64-65]。
2.4 MSCs的OSCs分化潛能
傳統發育生物學認為，雌性哺乳動物只具備有限的卵母細胞儲備池，卵母細胞主要發生在胎兒卵巢中，在胎兒發育期就失去了產生卵母細胞的能力，因此許多POF患者由于缺乏卵子，尚不能通過輔助生殖技術或其他治療手段使其生育具有母源性遺傳物質的子代。然而，最近一些研究結果顛覆了這一傳統觀點，認為動物卵巢內卵泡的數量并非完全固定，在某些條件下卵泡是可以再生的[66]。因此研究者推測與雄性動物相似，雌性動物出生后也有OSCs維持卵子發生[67-69]。但不能確定產生新卵母細胞的OSCs定位于何處。
MSCs具有多向分化潛能，在體外合適的誘導條件下可分化為中胚層及其他胚層細胞。最新研究結果表明，胚胎干細胞和成體干細胞（如BMSCs等）在特定培養條件下可向卵母細胞樣細胞分化[11, 70-71]。研究還發現臍帶MSCs也具有分化為卵母細胞樣細胞的潛能，首先八聚體結合蛋白4、生殖胚胎干細胞富集蛋白、干擾素介導跨膜蛋白3等生殖系標記物在臍帶MSCs表面有不同程度的表達，在含有5%、10%、20%等不同濃度卵泡液的誘導條件下，臍帶MSCs可聚集分化形成卵母細胞樣細胞的結構[13]。也有研究先將臍帶MSCs進行懸滴培養，使其能夠形成類胚體，進而采用類胚體與人或小鼠卵巢顆粒細胞共培養后，均能表達生殖細胞早期分化特異性標記物特殊期胚胎抗原（stage-specific embyronic antigen 1，SSEA-1）、聯會復合體蛋白3和生長分化因子9 [12]。許多研究通過移植標記后的臍帶MSCs[72-73]，發現其可遷移至卵巢，提示臍帶MSCs移植后可在體內定位和增殖，具有修復卵巢組織并可能向生殖細胞分化的潛能。有研究從小鼠BMSCs中分離出能表達SSEA-1的多能干細胞，加入BMP-4后成功誘導其向原始生殖細胞（primordialgermcells，PGCs）分化，但未能將PGCs進一步誘導形成晚期生殖細胞[11-13]。如在體外和體內微環境條件下將MSCs誘導分化為有功能的卵母細胞，則有可能通過輔助生殖技術使POF患者重獲生育能力，保存物種的多樣性，并在更大程度上滿足人類研究與再生醫學治療的需要。
3 小結與展望
目前，MSCs的應用逐漸廣泛，其不論是作為干預因素改善卵巢組織損傷，還是作為OSCs來源誘導分化為卵母細胞樣細胞，都在再生醫學、生殖技術方面表現出應用潛力，為FP技術研究提供了新思路。另外，由于MSCs具有低免疫原性及免疫耐受、免疫調節等功能，是否有助于提升子宮內膜的容受性以增加不孕者的自然受孕率和輔助生殖技術的成功率，針對臨床上習慣性流產尤其是免疫性流產患者的治療，MSCs是否具有保護和治療作用，相關研究正在積極開展。然而，將MSCs最終應用于臨床仍是一漫長復雜的過程，存在許多問題有待進一步解決，如MSCs的作用是否會增加感染和腫瘤的風險，如何提高MSCs向靶器官的歸巢能力，MSCs向卵母細胞樣細胞分化的啟動機制，如何使MSCs更易于獲取和純化鑒定，MSCs長期使用的安全性及倫理性等。相信隨著基礎研究的逐步深入及臨床試驗資料的完善，MSCs將作為一種潛力強大的細胞源，為女性改善生育力開辟一條新的技術路線。
生殖醫學和深低溫生物學的發展，使得女性生育力保存（fertility preservation，FP）技術得以實施。FP所涵蓋范圍較廣泛，它不僅指推遲生育年齡的健康人，也包括因某些疾病影響生育的患者。目前最新的《美國臨床腫瘤學會臨床實踐指南》已將腫瘤患者的FP納入參考[1]。根據荷蘭的一項問卷調查結果，雖然分診至FP中心的總體人數在上升，但獲得治療的患者僅占極少部分[2]，諸多原因使需要保存生育力的女性患者未得到有效的FP治療，導致其推遲或失去生育機會，對生活質量產生長期不良影響。除了社會因素外，疾病本身比如各種因素導致的卵泡耗竭、間質纖維化和血管損傷等，也可能使卵巢功能嚴重受損。如何修復受損的卵巢功能和保存女性生育能力成為國內外學者研究的重點。
自21世紀以來，人們對MSCs在組織修復再生、恢復功能、免疫抑制等諸多方面的應用進行了探究。目前，MSCs已用于治療多種組織損傷性疾病，如神經[3-4]、心肌[5-6]、肝[7]、肺[8]、骨骼[9]、肌肉[10]等；另外，MSCs還可在特定條件下向生殖干細胞（oogonial stem cells，OSCs）或卵母細胞樣細胞分化[11-13]，顯示了其強大的臨床應用價值。現對MSCs在FP中的研究進展進行綜述，為優化該技術，提高患者生育力的研究提供參考，為預防和解決卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）、保存和恢復女性生殖內分泌功能探索新的思路。
1 女性FP的背景
1.1 女性生育力下降的原因
1.1.1 醫源性因素
調查數據顯示，美國每年有60萬女性被確診為癌癥，其中10%患者年齡在40歲以下，12%乳腺癌患者年齡在35歲以下[14]，提示惡性腫瘤發病呈年輕化趨勢。另外，目前癌癥女性患者5年生存率達64%[15]，通過腫瘤診斷和治療技術的發展顯著提高了腫瘤患者的平均壽命。但卵巢組織對有細胞毒性的治療，特別是烷化劑（如環磷酰胺）和放療非常敏感，可導致生育能力和生殖內分泌功能喪失，使這些接受治療的女性患者發生POF的風險增加。由于癌癥患者對FP認識的缺乏，以及腫瘤醫師未充分考慮治療方案對生育力的影響等原因[16]，也可能導致女性患者錯失保存生育力的機會[17]。除了腫瘤患者，因各種結締組織疾病（如系統性紅斑狼瘡）、血液系統疾病（如接受自體或同種異體骨髓移植者）、神經系統疾病（如多發性硬化病）也需要服用大劑量烷化劑等化療和/或放療進行預處理的患者，同樣面臨著卵泡耗竭的危險。經造血干細胞移植、骨髓移植治療后，患者發生生育力下降和卵巢功能不足的風險超過80%[18]。此外，利用卵巢抗原作為免疫避孕疫苗或卵巢相關疾病（如卵巢巧克力囊腫剝除）術后[19]也可能造成醫源性卵巢損傷，最終導致女性生育力下降。
1.1.2 其他原因
目前，由于經濟壓力、晚婚率和離婚率逐漸升高等原因，使得很多國家女性推遲生育的現象越來越普遍。據統計，這類女性將生育計劃安排至35歲以后甚至更大年齡。美國生殖醫學協會統計顯示，2003年－2009年年齡40歲以上因不孕癥就診的女性數量從9%增長至41%[20]。高齡女性發生生理性卵巢儲備低下以卵巢功能衰退為主要內分泌改變，引起一系列生理、病理變化，對這類健康女性的生育力造成不可逆轉的影響。此外，越來越多研究發現環境污染對人生育力的不良影響[21-23]。目前，全球不孕癥患病率達9%，其中15%病因不明[24]。由于損失時間短，不能用基因改變來解釋，因此發病趨勢可能與環境污染物有關[25]。學者將進入機體后能干擾體內正常內分泌物質合成、釋放、轉運、代謝、結合、作用和排出等過程的外源性化學物質統稱為環境內分泌干擾物（endocrine disruptors，EDs）[26]。EDs在自然界中廣泛存在，可通過食品、水、空氣等多種途徑進入食物鏈，因具有脂溶性及不易降解的特點，使其在人體和動物體內長期蓄積并通過食物鏈富集。這些有害物質可以受體激動劑或拮抗劑作用方式，模擬激活或阻斷靶細胞對相應激素的反應，對女性生育力造成損害。研究發現[21, 27-29]，EDs可能通過改變卵泡微環境，使卵子質量下降，影響卵泡發育、卵母細胞成熟及卵巢功能，造成機體生殖能力下降，可見EDs毒性作用嚴重影響女性生殖健康。
綜上述，女性生育力下降可能是一個或多個因素造成。這些因素使女性卵巢儲備下降，出現竇卵泡數減少、閉經、月經期縮短、黃體功能不足等卵巢功能損傷表現，最終對生育力造成不可逆轉的后果，嚴重影響患者生活質量。
1.2 女性FP技術介紹
目前，保存女性生育力的主要技術包括：卵子冷凍、胚胎冷凍、卵巢移位、不成熟卵母細胞的體外培養成熟、卵巢組織冷凍保存（ovarian tissue cryopreservation，OTC）及再植等[30]。其中，OTC手術操作相對簡便，能一次性獲得大量各階段卵泡，且不受有無配偶的限制。其手術創傷小，患者術后即可開始腫瘤治療（包括盆腔放療），不延誤病情，還可避免促排卵過程中引起的其他不良后果，如腫瘤惡化、腫瘤轉移、卵巢過度刺激等。卵巢組織通過移植可重新啟動卵泡的生長發育、月經期規律、正常性激素水平，恢復卵巢功能。有生育要求的患者多可自然受孕或求助于輔助生殖技術獲得后代，對其日后生理、心理健康意義重大[31]。OTC技術也可用于其他原因引起的卵巢功能減退健康女性，最終改善其生育能力。近年來，凍存卵巢組織移植已取得了較大進展，全世界經OCT技術后的活產報道已有42例[26-27, 32-33]。但是，卵巢組織復蘇后如何經體外培養獲得健康成熟的卵子、如何減輕免疫排斥反應和移植后組織缺血再灌注損傷，從而促使移植物功能的早期恢復，延長移植物的生存年限等問題，仍是OTC技術有待解決的主要難點。
2 MSCs與生殖細胞損傷修復
2.1 MSCs的來源及功能
干細胞是近年來細胞生物學和醫學研究中最熱門的課題之一。干細胞是來自胚胎、胎兒或成人的一類特殊細胞，具有長期自我復制能力和多向分化潛能。其中，MSCs因來源豐富（幾乎包括所有的器官和組織，如骨髓、肌肉、脂肪、臍帶血、胎盤等[34]），易于分離獲得及體外擴增[35]，具有多向分化潛能[36]、遷移能力、再生潛力，并因其在倫理道德、法律法規等方面的優勢，成為目前應用最多的干細胞及細胞移植理想的種子細胞。目前MSCs臨床應用廣泛，如用于肺纖維化修復、類風濕和肝硬化后肝功能修復等，并可作為基因治療的載體細胞[37-39]。由于MSCs無免疫原性，能避免移植排斥反應，可作為免疫調節劑[40]。
2.2 MSCs對生殖細胞修復應用的研究及作用機制
大多數腫瘤化療藥物都具有腺毒性。例如，順鉑是一類具有較強毒性的化療藥物，不僅抑制DNA的合成，導致DNA損害，還可引起細胞凋亡。Borovskaya等[41]發現順鉑可導致卵泡形態學破壞，細胞核裂解，卵泡上皮細胞死亡。臨床上放化療在極大程度緩解癌癥病情同時，也對卵巢組織造成嚴重不可逆損傷，導致POF，最終使腫瘤治療后患者生育力下降。
由于MSCs具有對受損組織細胞的修復作用，近年來許多研究提出采用MSCs對化療藥物損傷的卵巢組織進行干預，其中來源于骨髓的BMSCs應用最廣泛。Abd-Allah等[42]將BMSCs移植至接受環磷酰胺誘導POF的兔體內，發現卵巢體積、各級卵泡數等均較未移植細胞對照組明顯增加。Guo等[43]將BMSCs和卵巢顆粒細胞共培養，發現BMSCs可降低順鉑導致的大鼠顆粒細胞凋亡，將BMSCs移植至卵巢可降低圍絕經期大鼠卵巢顆粒細胞凋亡。這一作用可能與BMSCs分泌IGF-1、肝細胞生長因子和VEGF等有關。這一結論與Xu等[44]研究結果一致。Ghadami等[45]通過給促卵泡激素受體基因敲除小鼠靜脈移植BMSCs，發現其能到達小鼠卵巢，恢復卵泡成熟和類固醇激素產生。此外，有學者認為，BMSCs還可通過上調抗凋亡基因的表達，預防化療藥物對正常機體細胞的毒副作用[46]。
目前認為MSCs修復損傷后卵巢組織的機制可能為：①通過分泌細胞因子抑制靶細胞凋亡，修復受損組織細胞；②可采用多種分泌方式，表達相關因子，促進卵泡生長；③在特定微環境誘導下分化為受損組織的細胞，部分補償或替代其功能。
2.3 MSCs與卵巢組織移植后的血管重建
據文獻報道，卵巢組織凍融過程中有7%卵泡丟失，而在移植后血管再形成中可有65%卵泡丟失[47]。卵泡丟失的主要原因是移植后卵巢組織缺血缺氧，說明卵巢組織移植成功的關鍵在于移植后血管的再形成。卵巢組織移植是一種無血管吻合的卵巢組織皮質移植，由于沒有血管吻合，移植后卵巢組織的血供完全依靠周圍毛細血管的生長，在移植后48 h內組織處于缺血缺氧狀態，會造成大量卵泡破壞損傷。而血管生成是生理性創傷修復中的一個重要環節，包括新生血管網的增殖、成熟、退化3個階段，與一系列血管生成調節因子共同表達和參與有關，且受到嚴格調控。VEGF、FGF、TGF-β等多種生長因子均參與卵巢血管形成[48]。卵巢組織移植后，應盡早恢復對卵巢的供血和供氧，減少缺血再灌注損傷中的過量活性氧生成，可防止移植物功能恢復的延遲和功能衰竭，也是卵泡能否再發育的關鍵。
為尋找更有效方法誘導和加速移植卵巢組織的新生血管化過程，減少移植卵巢組織的缺血損傷，有研究者在卵巢培養系統中加入相關因子（如VEGF、bFGF[49]），結果顯示可明顯促進卵巢組織的新生血管生成、促進卵泡發育[50]。然而由于這些因子半衰期短、易降解且長期使用存在安全性因素等問題，限制了其今后在FP方面的應用。另外，研究發現促性腺激素（如重組人促卵泡刺激素、孕馬血清促性腺激素[51-52]）可調節卵巢內血管生長因子水平、促進卵泡發育，但目前關于外源性促性腺激素對同種異種卵巢組織移植后卵泡發育的作用及安全性尚存在爭議[51]。因此，應用生長相關因子或外源性激素促進移植后卵巢組織功能的方法有待進一步研究明確。
近年來，研究發現移植MSCs后能分泌如VEGF、bFGF、血管生成素、IL-6等多種促血管新生因子[53-56]。BMSCs與卵巢組織共培養后可明顯改善卵巢組織血管再生、促進卵泡生長[53]，從而改善其功能恢復，且BMSCs作用較添加生長相關因子更顯著。張芍等[57]將大鼠MSCs與竇前卵泡共培養，結果發現卵泡輪廓清楚，基底膜完整，卵母細胞中可見生發泡（germinal vesicle，GV），且較對照組（正常培養的竇前卵泡）獲得了更高的GV出現率，提示MSCs可促進卵泡中的卵母細胞生長、發育，抑制早期閉鎖，并能向成熟卵母細胞轉化。另外，有研究發現臍帶MSCs可特異性遷移歸巢至炎癥組織，通過旁分泌、定向分化等機制改善炎癥環境，對損傷組織進行修復[58-59]。當組織損傷或引起慢性炎癥時，損傷部位或炎癥區域會釋放特殊的內分泌信號，局部表達及分泌多種趨化因子、黏附因子、生長因子，這一系列微環境改變是MSCs歸巢的始動因素，導致MSCs向損傷部位遷移[60]，同時表達特異性受體或配體引導MSCs移動并黏附于損傷處[61]。因此，向缺血或損傷組織歸巢是MSCs重要的特征。
目前認為，MSCs促進血管生成主要有兩方面作用：①產生多種細胞因子和生長因子，如VEGF、bFGF、肝細胞生長因子、IL-1等，誘導血管發生[62-64]；②通過多種受體趨化，定向移動并可能分化為血管內皮細胞，參與缺血組織的血管形成，還可通過旁分泌作用刺激周圍內皮細胞增殖和遷移[64-65]。
2.4 MSCs的OSCs分化潛能
傳統發育生物學認為，雌性哺乳動物只具備有限的卵母細胞儲備池，卵母細胞主要發生在胎兒卵巢中，在胎兒發育期就失去了產生卵母細胞的能力，因此許多POF患者由于缺乏卵子，尚不能通過輔助生殖技術或其他治療手段使其生育具有母源性遺傳物質的子代。然而，最近一些研究結果顛覆了這一傳統觀點，認為動物卵巢內卵泡的數量并非完全固定，在某些條件下卵泡是可以再生的[66]。因此研究者推測與雄性動物相似，雌性動物出生后也有OSCs維持卵子發生[67-69]。但不能確定產生新卵母細胞的OSCs定位于何處。
MSCs具有多向分化潛能，在體外合適的誘導條件下可分化為中胚層及其他胚層細胞。最新研究結果表明，胚胎干細胞和成體干細胞（如BMSCs等）在特定培養條件下可向卵母細胞樣細胞分化[11, 70-71]。研究還發現臍帶MSCs也具有分化為卵母細胞樣細胞的潛能，首先八聚體結合蛋白4、生殖胚胎干細胞富集蛋白、干擾素介導跨膜蛋白3等生殖系標記物在臍帶MSCs表面有不同程度的表達，在含有5%、10%、20%等不同濃度卵泡液的誘導條件下，臍帶MSCs可聚集分化形成卵母細胞樣細胞的結構[13]。也有研究先將臍帶MSCs進行懸滴培養，使其能夠形成類胚體，進而采用類胚體與人或小鼠卵巢顆粒細胞共培養后，均能表達生殖細胞早期分化特異性標記物特殊期胚胎抗原（stage-specific embyronic antigen 1，SSEA-1）、聯會復合體蛋白3和生長分化因子9 [12]。許多研究通過移植標記后的臍帶MSCs[72-73]，發現其可遷移至卵巢，提示臍帶MSCs移植后可在體內定位和增殖，具有修復卵巢組織并可能向生殖細胞分化的潛能。有研究從小鼠BMSCs中分離出能表達SSEA-1的多能干細胞，加入BMP-4后成功誘導其向原始生殖細胞（primordialgermcells，PGCs）分化，但未能將PGCs進一步誘導形成晚期生殖細胞[11-13]。如在體外和體內微環境條件下將MSCs誘導分化為有功能的卵母細胞，則有可能通過輔助生殖技術使POF患者重獲生育能力，保存物種的多樣性，并在更大程度上滿足人類研究與再生醫學治療的需要。
3 小結與展望
目前，MSCs的應用逐漸廣泛，其不論是作為干預因素改善卵巢組織損傷，還是作為OSCs來源誘導分化為卵母細胞樣細胞，都在再生醫學、生殖技術方面表現出應用潛力，為FP技術研究提供了新思路。另外，由于MSCs具有低免疫原性及免疫耐受、免疫調節等功能，是否有助于提升子宮內膜的容受性以增加不孕者的自然受孕率和輔助生殖技術的成功率，針對臨床上習慣性流產尤其是免疫性流產患者的治療，MSCs是否具有保護和治療作用，相關研究正在積極開展。然而，將MSCs最終應用于臨床仍是一漫長復雜的過程，存在許多問題有待進一步解決，如MSCs的作用是否會增加感染和腫瘤的風險，如何提高MSCs向靶器官的歸巢能力，MSCs向卵母細胞樣細胞分化的啟動機制，如何使MSCs更易于獲取和純化鑒定，MSCs長期使用的安全性及倫理性等。相信隨著基礎研究的逐步深入及臨床試驗資料的完善，MSCs將作為一種潛力強大的細胞源，為女性改善生育力開辟一條新的技術路線。