引用本文： 許飛翔, 趙勁松, 郭斌, 馬健超, 黃嵐峰. 利用溫敏膠原動態培養構建組織工程復合物的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(3): 309-313. doi: 10.7507/1002-1892.20160061 復制
利用組織工程方法體外構建細胞-支架復合物，移植修復組織器官缺損是目前再生醫學領域的研究熱點，但體外構建的復合物中細胞數量不足、分布不均以及不能良好表達生物活性等問題仍未得到有效解決。利用生物反應器等動態培養的體外構建方式可以增強細胞的生物活性，改善復合物的功能特征[1]。單一成分的細胞外基質支架不能滿足各種工程化組織體外構建的需求，將多種具有良好生物相容性的天然與合成生物活性材料相結合具有一定研究和應用前景[2-3]。本研究將BMSCs作為種子細胞，聚乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）纖維編織材料作為細胞外基質支架，構建網狀空間結構，利用溫敏膠原（thermosensitive collagen hydrogel，TCH）作為細胞黏附基質，并在動態培養條件下構建組織工程復合物，觀察復合物的形態學特征，檢測種子細胞生長增殖狀態，為組織工程復合物體外構建提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級7周齡雄性Fischer 344大鼠10只，平均體質量250 g，由吉林大學實驗動物中心提供。
TCH培養試劑盒（Nitta-gelatin公司，日本），由豬來源的Ⅰ型膠原、不含NaHCO3的10倍濃縮DMEM培養液和緩沖液（260 mmol/L NaHCO3、50?mmol/L NaOH、200 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸）構成；10℃以下保持為流動態，37℃凝膠化。
PLLA支架材料由直徑10μm的PLLA纖維編織而成，支架材料直徑3.0 mm，牽拉速度為100?mm/min時的斷裂強度為366 N，材料使用前用70%乙醇和DMEM培養液進行親水性處理。
DNA提取試劑盒（Wako公司，日本）；RNA提取試劑盒（Osaka公司，日本）。
1.2 BMSCs的分離培養及鑒定
取Fischer 344大鼠以過量乙醚麻醉后，無菌條件下分離雙側脛骨和股骨，去除骨端，用裝有DMEM培養液的5 mL注射器沖洗骨髓腔；取骨髓液于4℃，以離心半徑10 cm、1 500 r/min離心10 min；棄上清，以DMEM培養液懸浮后置于T-75培養瓶，用含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養基培養，37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養。4 d后首次換液，待細胞融合生長至80%，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，以1:2比例擴增傳代[4]。取第3代細胞，分別經成骨、成脂誘導分化鑒定為BMSCs[5-8]。
1.3 實驗分組及方法
用DMEM培養液按照9:1的體積比稀釋TCH原液制備細胞培養用TCH溶液，然后加入BMSCs制備細胞懸液；通過注射方式將濃度為1×106個/mL的BMSCs懸液接種于PLLA支架材料，將細胞-支架復合物置于底面直徑6 mm、高10?mm的圓柱形培養槽中，以防止細胞流失；于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中預培養30 min，使膠原呈凝膠狀，然后將細胞-支架復合物移入動態培養裝置中作為實驗組。動態培養裝置通過一特殊設計的平板擺動裝置使培養瓶中的DMEM培養液往復流動，擺動角度為70°（水平面上、下各35°），擺動頻率0.5 Hz，細胞-支架復合物在培養瓶中隨培養液往復滾動，每天更換培養液。另外，將細胞-支架復合物采用普通靜止平板，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養作為對照組。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體及掃描電鏡觀察
體外培養7 d后，取兩組細胞-支架復合物行大體觀察。然后沿縱軸或橫軸剖開，PBS沖洗，臨界點干燥、噴金，掃描電鏡觀察復合物表面、橫斷面和縱斷面的形態學特征[9]。
1.4.2 細胞-支架復合物總DNA定量分析
隨機選取體外培養0、1、3、7 d的兩組細胞-支架復合物（n=5），采用DNA/RNA提取試劑盒定量分析總DNA含量。按照試劑盒說明書操作，首先將復合物剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎塊，用超聲細胞破碎機處理后，以離心半徑10 cm、1 000 r/min離心5 min，收集上清采用紫外分光光度計檢測波長260 nm處的吸光度（A）值，以單純第3代BMSCs制作DNA濃度標準曲線[10]。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內手術前后比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體及掃描電鏡觀察
兩組兩種方式培養后膠原均包繞PLLA支架材料，并收縮形成半透明凝膠狀致密膜狀結構。
掃描電鏡觀察示，兩組細胞-支架復合物表面均形成了由復層細胞構成的膜狀結構（圖 1a），實驗組材料表面可見大量細胞呈梭形并沿材料縱軸致密整齊排列，細胞活性良好，表面可見較多絨毛凸起（圖 1b）；對照組材料表面細胞伸展扁平（圖 1c）。實驗組縱斷面可見大量細胞黏附于PLLA纖維和膠原纖維網架中（圖 1d），對照組縱斷面黏附細胞較少（圖 1e）。實驗組和對照組橫斷面均可見大量膠原纖維充滿PLLA網架中，形成多孔網架的三維空間結構（圖 1f），兩組無明顯差異。
圖1
體外培養7 d兩組細胞-支架復合物掃描電鏡觀察 ? 實驗組表面觀察（×300）黑箭頭示細胞構成的膜狀結構，白箭頭示PLLA纖維 ? 實驗組表面觀察（×1 000） ? 對照組表面觀察（×1 000） ? 實驗組縱斷面觀察（×600）黑箭頭示PLLA纖維，白箭頭示細胞 ? 對照組縱斷面觀察（×600）黑箭頭示PLLA纖維，白箭頭示細胞 ? 實驗組橫斷面觀察（×600）黑箭頭示PLLA纖維，白箭頭示膠原纖維
Figure1.
SEM observation of BMSCs-ECM scaffold composites in 2 groups after 7 days of culture ? Surface observation in the experimental group (×300) Black arrow indicated the membranous structure, white arrow indicated PLLA fiber ? Surface observation in the experimental group (×1 000) ? Surface observation in the control group (×1 000) ? Vertical section observation in the experimental group (×600) Black arrow indicated PLLA fiber, white arrow indicated cells ? Vertical section observation in the control group (×600) Black arrow indicated PLLA fiber, white arrow indicated cells ? Cross s ection observation in the experimental group (×600) Black arrow indicated PLLA fiber, white arrow indicated collagen fiber
2.2 細胞-支架復合物總DNA含量分析
除0 d外，體外培養1、3、7 d實驗組細胞-支架復合物中總DNA含量均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。與培養0 d比較，兩組培養1、3、7 d的總DNA含量均逐漸升高，但僅7 d時總DNA含量與培養0 d時比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
兩組細胞-支架復合物體外培養各時間點總DNA含量比較（n=5，3 討論
近年來，利用組織工程技術采用種子細胞與生物材料體外構建組織工程復合物修復組織缺損，已成為再生醫學的研究熱點[11]。研究者們認為具有一定分化潛能的細胞、可生物降解支架材料以及各種細胞因子是組織工程再生的必要條件[12-15]。本研究采用經典的組織工程技術方法，以具有多向分化潛能的BMSCs作為種子細胞，TCH與PLLA纖維支架材料聯合制作復合細胞外基質，在動態培養環境中構建組織工程復合物，對其形態學特征和細胞在動態環境中的增殖能力進行初步研究。
TCH主要由Ⅰ型膠原構成，是一種天然材料，在組織工程研究中具有較大優勢。將TCH與PLLA或其他生物降解材料相結合，可獲得既有良好生物相容性，又有一定機械強度的復合細胞外基質[16-18]。Ⅰ型膠原是人體中分布最廣和最重要的蛋白質之一，膠原凝膠的多孔結構以及保有大量水分的生物學特征，有助于復合物中細胞的新陳代謝[19-20]。本研究以TCH水凝膠作為細胞黏附基質，可有效保持種植細胞數量，一定程度上限制種植細胞的流動性，減少了種植初期細胞流失，使支架材料中擁有充足的原始細胞數量和良好的分布，縮短了細胞需要爬行長入多孔材料內部的過程。有研究表明，一定數量規模的細胞成分在組織工程復合物體外構建中具有重要作用[4, 21-22]。在培養過程中，復合物逐漸收縮，使細胞間更加致密，這種特征可能與膠原成分以及含有一定數量的細胞成分有關，有研究認為復合物中的細胞成分會促進復合物的培養收縮特性[18, 23]，并且可能有益于細胞間的相互作用，發揮組織協同功效，構建具有一定功能活性的組織。
利用生物反應器可有效促進細胞在體外構建的具有三維結構的復合物中生長，促進細胞表達生物活性[24-26]。動態培養裝置產生的流體動力學刺激可以提供更好的細胞生存環境，促進種子細胞黏附于支架材料表面，提高細胞的生物活性[24]。本研究結果表明，與靜態培養相比，動態培養條件下的細胞黏附和生長良好，總DNA含量明顯增加。在構建的復合物中，細胞排列對于細胞的生物學行為具有非常重要的意義。在神經組織再生研究中發現，軸突再生過程中在周圍神經和中樞神經損傷區域，神經細胞自發地與雪旺細胞平行排列[27-28]，在移植重建中，細胞具有一定排列規律的特征有助于組織形成并促進組織再生[29-30]，可使組織細胞在軸向生長方面具有一定優勢[29, 31]。本研究掃描電鏡觀察發現，動態培養7 d復合物表面BMSCs呈平行排列，并且在表面形成了一層膜狀結構，將種子細胞和生物降解材料包繞在一個相對穩定的環境中，并能夠保持營養物質的交換，這種特征在移植后能夠保證種子細胞的純度和數量，為組織化改建奠定基礎。這種組織化的特征可能對周圍神經和肌腱組織工程研究具有重要意義。
生物降解材料與膠原相結合聯合構建細胞外基質可使復合物具有多孔三維結構，并可以有效提高材料的細胞相容性，通過預培養能夠在一定程度上限制細胞的流動性，減少在構建初級階段細胞的流失，提高種子細胞的種植效率，改善細胞在三維多孔材料中的分布。通過動態培養，使細胞受到流體力學的刺激，改善細胞在材料表面的排列和材料內部的分布，增加了細胞活性，促進種子細胞增殖，良好地滿足了組織工程復合物體外構建的最根本要求。
本研究著眼于組織工程復合物的體外構建，尚未涉及構建復合物的具體組織研究方向，所以只針對種子細胞進行了多分化潛能的誘導，未針對復合物中的細胞成分進行深入地生物活性研究。這種組織工程復合物的構建方式可用于多種組織工程研究，為周圍神經再生、肌腱組織工程等組織工程復合物的體外構建提供參考。
利用組織工程方法體外構建細胞-支架復合物，移植修復組織器官缺損是目前再生醫學領域的研究熱點，但體外構建的復合物中細胞數量不足、分布不均以及不能良好表達生物活性等問題仍未得到有效解決。利用生物反應器等動態培養的體外構建方式可以增強細胞的生物活性，改善復合物的功能特征[1]。單一成分的細胞外基質支架不能滿足各種工程化組織體外構建的需求，將多種具有良好生物相容性的天然與合成生物活性材料相結合具有一定研究和應用前景[2-3]。本研究將BMSCs作為種子細胞，聚乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）纖維編織材料作為細胞外基質支架，構建網狀空間結構，利用溫敏膠原（thermosensitive collagen hydrogel，TCH）作為細胞黏附基質，并在動態培養條件下構建組織工程復合物，觀察復合物的形態學特征，檢測種子細胞生長增殖狀態，為組織工程復合物體外構建提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級7周齡雄性Fischer 344大鼠10只，平均體質量250 g，由吉林大學實驗動物中心提供。
TCH培養試劑盒（Nitta-gelatin公司，日本），由豬來源的Ⅰ型膠原、不含NaHCO3的10倍濃縮DMEM培養液和緩沖液（260 mmol/L NaHCO3、50?mmol/L NaOH、200 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸）構成；10℃以下保持為流動態，37℃凝膠化。
PLLA支架材料由直徑10μm的PLLA纖維編織而成，支架材料直徑3.0 mm，牽拉速度為100?mm/min時的斷裂強度為366 N，材料使用前用70%乙醇和DMEM培養液進行親水性處理。
DNA提取試劑盒（Wako公司，日本）；RNA提取試劑盒（Osaka公司，日本）。
1.2 BMSCs的分離培養及鑒定
取Fischer 344大鼠以過量乙醚麻醉后，無菌條件下分離雙側脛骨和股骨，去除骨端，用裝有DMEM培養液的5 mL注射器沖洗骨髓腔；取骨髓液于4℃，以離心半徑10 cm、1 500 r/min離心10 min；棄上清，以DMEM培養液懸浮后置于T-75培養瓶，用含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養基培養，37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養。4 d后首次換液，待細胞融合生長至80%，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，以1:2比例擴增傳代[4]。取第3代細胞，分別經成骨、成脂誘導分化鑒定為BMSCs[5-8]。
1.3 實驗分組及方法
用DMEM培養液按照9:1的體積比稀釋TCH原液制備細胞培養用TCH溶液，然后加入BMSCs制備細胞懸液；通過注射方式將濃度為1×106個/mL的BMSCs懸液接種于PLLA支架材料，將細胞-支架復合物置于底面直徑6 mm、高10?mm的圓柱形培養槽中，以防止細胞流失；于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中預培養30 min，使膠原呈凝膠狀，然后將細胞-支架復合物移入動態培養裝置中作為實驗組。動態培養裝置通過一特殊設計的平板擺動裝置使培養瓶中的DMEM培養液往復流動，擺動角度為70°（水平面上、下各35°），擺動頻率0.5 Hz，細胞-支架復合物在培養瓶中隨培養液往復滾動，每天更換培養液。另外，將細胞-支架復合物采用普通靜止平板，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養作為對照組。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體及掃描電鏡觀察
體外培養7 d后，取兩組細胞-支架復合物行大體觀察。然后沿縱軸或橫軸剖開，PBS沖洗，臨界點干燥、噴金，掃描電鏡觀察復合物表面、橫斷面和縱斷面的形態學特征[9]。
1.4.2 細胞-支架復合物總DNA定量分析
隨機選取體外培養0、1、3、7 d的兩組細胞-支架復合物（n=5），采用DNA/RNA提取試劑盒定量分析總DNA含量。按照試劑盒說明書操作，首先將復合物剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎塊，用超聲細胞破碎機處理后，以離心半徑10 cm、1 000 r/min離心5 min，收集上清采用紫外分光光度計檢測波長260 nm處的吸光度（A）值，以單純第3代BMSCs制作DNA濃度標準曲線[10]。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內手術前后比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體及掃描電鏡觀察
兩組兩種方式培養后膠原均包繞PLLA支架材料，并收縮形成半透明凝膠狀致密膜狀結構。
掃描電鏡觀察示，兩組細胞-支架復合物表面均形成了由復層細胞構成的膜狀結構（圖 1a），實驗組材料表面可見大量細胞呈梭形并沿材料縱軸致密整齊排列，細胞活性良好，表面可見較多絨毛凸起（圖 1b）；對照組材料表面細胞伸展扁平（圖 1c）。實驗組縱斷面可見大量細胞黏附于PLLA纖維和膠原纖維網架中（圖 1d），對照組縱斷面黏附細胞較少（圖 1e）。實驗組和對照組橫斷面均可見大量膠原纖維充滿PLLA網架中，形成多孔網架的三維空間結構（圖 1f），兩組無明顯差異。
圖1
體外培養7 d兩組細胞-支架復合物掃描電鏡觀察 ? 實驗組表面觀察（×300）黑箭頭示細胞構成的膜狀結構，白箭頭示PLLA纖維 ? 實驗組表面觀察（×1 000） ? 對照組表面觀察（×1 000） ? 實驗組縱斷面觀察（×600）黑箭頭示PLLA纖維，白箭頭示細胞 ? 對照組縱斷面觀察（×600）黑箭頭示PLLA纖維，白箭頭示細胞 ? 實驗組橫斷面觀察（×600）黑箭頭示PLLA纖維，白箭頭示膠原纖維
Figure1.
SEM observation of BMSCs-ECM scaffold composites in 2 groups after 7 days of culture ? Surface observation in the experimental group (×300) Black arrow indicated the membranous structure, white arrow indicated PLLA fiber ? Surface observation in the experimental group (×1 000) ? Surface observation in the control group (×1 000) ? Vertical section observation in the experimental group (×600) Black arrow indicated PLLA fiber, white arrow indicated cells ? Vertical section observation in the control group (×600) Black arrow indicated PLLA fiber, white arrow indicated cells ? Cross s ection observation in the experimental group (×600) Black arrow indicated PLLA fiber, white arrow indicated collagen fiber
2.2 細胞-支架復合物總DNA含量分析
除0 d外，體外培養1、3、7 d實驗組細胞-支架復合物中總DNA含量均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。與培養0 d比較，兩組培養1、3、7 d的總DNA含量均逐漸升高，但僅7 d時總DNA含量與培養0 d時比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
兩組細胞-支架復合物體外培養各時間點總DNA含量比較（n=5，3 討論
近年來，利用組織工程技術采用種子細胞與生物材料體外構建組織工程復合物修復組織缺損，已成為再生醫學的研究熱點[11]。研究者們認為具有一定分化潛能的細胞、可生物降解支架材料以及各種細胞因子是組織工程再生的必要條件[12-15]。本研究采用經典的組織工程技術方法，以具有多向分化潛能的BMSCs作為種子細胞，TCH與PLLA纖維支架材料聯合制作復合細胞外基質，在動態培養環境中構建組織工程復合物，對其形態學特征和細胞在動態環境中的增殖能力進行初步研究。
TCH主要由Ⅰ型膠原構成，是一種天然材料，在組織工程研究中具有較大優勢。將TCH與PLLA或其他生物降解材料相結合，可獲得既有良好生物相容性，又有一定機械強度的復合細胞外基質[16-18]。Ⅰ型膠原是人體中分布最廣和最重要的蛋白質之一，膠原凝膠的多孔結構以及保有大量水分的生物學特征，有助于復合物中細胞的新陳代謝[19-20]。本研究以TCH水凝膠作為細胞黏附基質，可有效保持種植細胞數量，一定程度上限制種植細胞的流動性，減少了種植初期細胞流失，使支架材料中擁有充足的原始細胞數量和良好的分布，縮短了細胞需要爬行長入多孔材料內部的過程。有研究表明，一定數量規模的細胞成分在組織工程復合物體外構建中具有重要作用[4, 21-22]。在培養過程中，復合物逐漸收縮，使細胞間更加致密，這種特征可能與膠原成分以及含有一定數量的細胞成分有關，有研究認為復合物中的細胞成分會促進復合物的培養收縮特性[18, 23]，并且可能有益于細胞間的相互作用，發揮組織協同功效，構建具有一定功能活性的組織。
利用生物反應器可有效促進細胞在體外構建的具有三維結構的復合物中生長，促進細胞表達生物活性[24-26]。動態培養裝置產生的流體動力學刺激可以提供更好的細胞生存環境，促進種子細胞黏附于支架材料表面，提高細胞的生物活性[24]。本研究結果表明，與靜態培養相比，動態培養條件下的細胞黏附和生長良好，總DNA含量明顯增加。在構建的復合物中，細胞排列對于細胞的生物學行為具有非常重要的意義。在神經組織再生研究中發現，軸突再生過程中在周圍神經和中樞神經損傷區域，神經細胞自發地與雪旺細胞平行排列[27-28]，在移植重建中，細胞具有一定排列規律的特征有助于組織形成并促進組織再生[29-30]，可使組織細胞在軸向生長方面具有一定優勢[29, 31]。本研究掃描電鏡觀察發現，動態培養7 d復合物表面BMSCs呈平行排列，并且在表面形成了一層膜狀結構，將種子細胞和生物降解材料包繞在一個相對穩定的環境中，并能夠保持營養物質的交換，這種特征在移植后能夠保證種子細胞的純度和數量，為組織化改建奠定基礎。這種組織化的特征可能對周圍神經和肌腱組織工程研究具有重要意義。
生物降解材料與膠原相結合聯合構建細胞外基質可使復合物具有多孔三維結構，并可以有效提高材料的細胞相容性，通過預培養能夠在一定程度上限制細胞的流動性，減少在構建初級階段細胞的流失，提高種子細胞的種植效率，改善細胞在三維多孔材料中的分布。通過動態培養，使細胞受到流體力學的刺激，改善細胞在材料表面的排列和材料內部的分布，增加了細胞活性，促進種子細胞增殖，良好地滿足了組織工程復合物體外構建的最根本要求。
本研究著眼于組織工程復合物的體外構建，尚未涉及構建復合物的具體組織研究方向，所以只針對種子細胞進行了多分化潛能的誘導，未針對復合物中的細胞成分進行深入地生物活性研究。這種組織工程復合物的構建方式可用于多種組織工程研究，為周圍神經再生、肌腱組織工程等組織工程復合物的體外構建提供參考。
