引用本文： 梁相辰, 孫建華, 卞正君, 邵輝, 黃朝慶, 李相晨, 于洋. 兔纖維環細胞復合KLD-12多肽納米纖維凝膠體外三維培養的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(3): 303-308. doi: 10.7507/1002-1892.20160060 復制
腰椎間盤退變是引發下腰部疼痛的主要病因[1]；其主要病理表現為髓核、纖維環等椎間盤組織中細胞凋亡、細胞減少，組織含水量及蛋白多糖等細胞外基質含量減少[2-4]。纖維環細胞是構成纖維環組織的細胞，其生物學特性與髓核細胞類似[5]，且在體外培養時穩定性較髓核細胞更強[6]，因此在椎間盤組織工程中常被用作種子細胞。KLD-12多肽是一種新型的組織工程支架材料，具有自組裝特性和良好的生物相容性，能為椎間盤組織工程種子細胞提供適合生長的三維空間[7-8]。本實驗旨在檢測復合培養后纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中的生物活性，以期為椎間盤退變的生物學治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡新西蘭大白兔1只，雌雄不限，體質量2.5?kg，由石河子大學醫學院實驗動物中心提供。
L-DMEM培養基、FBS（HyClone公司，美國）；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、PBS緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；TGF-β1（Pepro Tech公司，美國）；KLD-12多肽（上海生工生物工程股份有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；武漢博士德生物科技有限公司）；阿爾新藍、硫酸軟骨素鈉（Sigma公司，美國）；Ⅱ型膠原抗體（Themo Fisher公司，美國）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；SYBR Green PCR Kit（Qiagen公司，德國）；PCR引物（Takara公司，日本）。5%CO2培養箱（Themo Fisher公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；共聚焦顯微鏡（Zeiss公司，德國）；酶標儀（Bio-Rad公司，美國）；ABI7500實時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）。
1.2 兔纖維環細胞的分離培養
按文獻[6]方法分離培養纖維環細胞。取6月齡新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射5 mL空氣處死，作背部正中切口，無菌條件下取腰段脊柱。先后浸泡聚維酮碘溶液及乙醇溶液各15 min消毒后，沿椎間盤上緣切開纖維環，切取內1/3纖維環組織，放入預先加入2 mL L-DMEM培養基的玻璃瓶內，眼科剪剪碎至0.5 cm3大小；加入4 mL 0.25%胰蛋白酶，37℃消化25 min，棄胰蛋白酶，加入5?mL 0.25%Ⅱ型膠原酶，37℃消化3.5 h，棄Ⅱ型膠原酶；加入3 mL L-DMEM培養基，以離心半徑13?cm、1?000 r/min離心5 min，棄上清；加入2 mL含10%FBS的L-DMEM培養基，按1×105個/mL密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。每4天換液1次，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況；待細胞生長至80%～90%融合時，按1:3比例傳代培養。
1.3 KLD-12多肽納米纖維凝膠與兔纖維環細胞復合培養
用10%蔗糖溶液溶解10 mg KLD-12多肽凍干粉劑，配制成濃度為0.56%（w/v）的多肽溶液，置于渦旋式振蕩器上反復振蕩30 min。用0.25%胰蛋白酶消化第3代兔纖維環細胞，制成密度為1×107個/mL的細胞懸液。將細胞懸液與KLD-12多肽溶液復合，振蕩混勻，形成KLD-12多肽/纖維環細胞懸液復合物。向KLD-12多肽/纖維環細胞懸液復合物中加入PBS液，37℃誘發自組裝20 min，去除上層PBS液[9]，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，制備KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠。定期更換培養基。倒置顯微鏡下觀察細胞在凝膠內分布及細胞形態。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞增殖活性檢測
采用CCK-8法檢測細胞增殖能力[10]。分別取KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠（實驗組）和空白KLD-12多肽凝膠（對照組）置于96孔培養板，每3天更換1次培養基。分別于培養2、5、8、11、14?d，每組取6孔，避光加入CCK-8試劑10μL，37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中孵育4 h，酶標儀檢測激發光波長490 nm處的吸光度（A）值。
1.4.2 鈣黃綠素（Calcein-AM）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙熒光染色
取KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠置于48孔培養板，每2天更換1次培養基。于培養5、14 d分別取6孔凝膠行Calcein-AM/PI染色[11]，具體步驟：PBS清洗2遍后，培養孔內加入Calcein-AM/PI混合染液，37℃避光孵育30?min，棄染液，PBS漂洗2遍。倒置熒光顯微鏡藍色激發光（490 nm）下觀察，活細胞細胞質呈綠色熒光，死細胞細胞質無熒光；死細胞細胞核經PI染色呈紅色熒光，活細胞細胞核無熒光。鏡下每孔選5個區域，于40倍視野下分別計數活、死細胞，按以下公式計算活細胞比率：活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%。
1.4.3 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量檢測
取KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠（實驗組）和空白KLD-12多肽凝膠（對照組）置于24孔培養板，每組復5孔。每3天更換1次培養基，于培養2、5、8、11、14 d收集兩組培養基，采用阿爾新藍法[12]檢測培養基內GAG含量，以實驗組與對照組A值比值進行統計分析。
1.4.4 Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察
取KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠置于共聚焦培養皿（實驗組），每3天更換1次培養基。于培養14 d行Ⅱ型膠原免疫熒光染色，同時對細胞核行PI染色[13]，染色在暗盒內進行。以未加一抗的標本（KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠）作為陰性對照組，每組復5孔。激光共聚焦顯微鏡下（藍色激發光490 nm）觀察纖維環細胞Ⅱ型膠原表達情況。
1.4.5 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測
取KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠置于6孔培養板，于培養5、14?d分別取4孔凝膠，采用RT-qPCR法[14]檢測凝膠內纖維環細胞Ⅱ型膠原和蛋白聚糖（Aggrecan）基因相對表達量（采用2-ΔΔCt法計算）。引物序列：Ⅱ型膠原上游5' -GTCTCCATAGCTGAAGTGG-3' ，下游5' -CCATGCAGTACATGGGGG-3' ，產物大小386 bp；Aggrecan上游5' -GCTACGGAGACAAGGATGAGT-TC-3' ，下游5' -CGTAAAAGACCTCACCCTCCAT-3' ，產物大小114 bp；β-actin上游5' -TGCTTCTAGGCGGACTGTTA-3' ，下游5' -CGTCACATGGCATCTCA-CGA-3' ，產物大小314 bp。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察
纖維環細胞接種于6孔培養板中呈圓形懸浮于培養基各層，24 h后呈圓形貼壁，48 h后細胞伸出偽足，呈長梭形或多角形；8 d后細胞開始大量增殖，細胞在群落中呈漩渦狀或柵欄狀分布；20 d后細胞融合可達80%。傳至第3代，細胞體積較第1代增大，形態為長梭形。纖維環細胞與KLD-12多肽復合培養24 h后呈圓形貼壁，在凝膠邊緣處貼壁細胞呈長梭形或多角形；3 d后可見啞鈴狀增殖期細胞。14 d后，貼壁細胞互相接觸達80%。見圖 1。
圖1
兔纖維環細胞形態學觀察（倒置顯微鏡×10） ? 第3代細胞呈長梭形 ? 與KLD-12多肽復合培養14 d在凝膠中呈圓形 圖 2 CCK-8法檢測纖維環細胞增殖活性 圖 3培養各時間點Calcein-AM/PI雙熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×40） ? 5?d ? 14 d 圖 4培養各時間點GAG含量檢測 圖 5培養14 d兩組Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×40） ? 實驗組 ? 陰性對照組
Figure1.
Morphology observation of annulus fibrosus cells (Inverted microscope×10) ? Annulus fibrosus cells at passage 3, showing long spindle shape ? Annulus fibrosus cells on KLD-12 polypeptide nanofiber gel, showing round shape at 14 days Fig. 2 Proliferation of annulus fibrosus cells at different time points after culture by CCK-8 Fig. 3 The morphology of annulus fibrosus cells by Calcein-AM/PI fluorescent staining (Inverted fluorescence microscope×40) ? At 5?days ? At 14 days Fig. 4 The content of GAG at different time points after cluture Fig. 5 Immunofluorescence staining of collagen type II at 14?days (Laser confocal microscope×40) ? Experimental group ? Negative control group
2.2 細胞增殖活性檢測
實驗組細胞增殖活性隨培養時間延長呈總體增加趨勢，培養2 d A值顯著低于其余各時間點，14 d顯著高于其余各時間點，差異均有統計學意義（P < 0.05）；5、8、11 d間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。培養各時間點，實驗組A值均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2。
2.3 Calcein-AM/PI雙熒光染色觀察
倒置熒光顯微鏡觀察示，培養5 d，細胞在凝膠中生長狀況良好，可見大量活細胞存在，并維持圓形細胞形態，部分于凝膠邊緣處貼壁的細胞呈多角形，僅見極少死細胞存在；培養14 d，啞鈴形的分裂期細胞數量增多。見圖 3。培養5、14 d凝膠內細胞活細胞比率分別89.32%±8.58%和97.81%±1.09%，比較差異無統計學意義（t=-1.962，P=0.097）。
2.4 GAG含量檢測
細胞中GAG含量隨培養時間延長逐漸增加，8 d時達峰值，之后逐漸下降。培養5、8、11 d時GAG含量顯著高于2、14 d時，差異有統計學意義（P < 0.05）；2、14 d之間比較以及5、8、11 d之間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 4。
2.5 Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察
激光共聚焦顯微鏡觀察示，實驗組培養14 d，細胞在凝膠中生長狀況良好，Ⅱ型膠原呈綠色熒光，細胞核呈紅色熒光，可見Ⅱ型膠原在細胞質中圍繞細胞核大量存在，且離核越近表達量越高；陰性對照組細胞中未見綠色熒光。見圖 5。
2.6 RT-qPCR檢測基因表達情況
培養5、14 d凝膠內纖維環細胞均可見Ⅱ型膠原和Aggrecan基因表達，5、14 d時Ⅱ型膠原基因相對表達量分別為1.001±0.013和2.591±0.063，比較差異有統計學意義（t=-2.732，P=0.008）；Aggrecan基因相對表達量分別為1.001±0.021和2.039±0.036，比較差異有統計學意義（t=-2.090，P=0.041）。
3 討論
腰椎間盤退變是引起下腰痛的主要原因之一，主要以保守治療、物理治療和手術治療為主。但對于早期椎間盤退變，臨床上尚無較好治療方法。椎間盤組織工程為治療椎間盤早期退變及填充髓核摘除術后空腔提供了可能。種子細胞與支架材料是椎間盤組織工程的核心內容，作為椎間盤組織工程的種子細胞，應具備合成Ⅱ型膠原、Aggrecan等椎間盤基質成分的能力。椎間盤組織工程種子細胞的來源主要為椎間盤細胞、軟骨細胞和MSCs，本實驗使用的纖維環細胞為椎間盤細胞的一種，主要存在于椎間盤纖維環組織中。相比于BMSCs，纖維環細胞是一種分化成熟的椎間盤細胞，在無需進行體外轉化培養的情況下，即可大量合成Aggrecan及Ⅱ型膠原等椎間盤基質成分。此生物學特性與同為椎間盤細胞的髓核細胞極為類似。有研究顯示[6]，在體外培養實驗中，髓核細胞培養5 d后開始貼壁，17 d可進行傳代，傳至第2代時細胞活力由98%下降至80%；而纖維環細胞培養4 d后開始貼壁，12 d可進行傳代，傳至第2代時細胞活力仍然可保持在98%。因此可以認為，在體外培養實驗中纖維環細胞顯示出了比髓核細胞更強的穩定性，更適合作為椎間盤組織工程種子細胞。
良好的支架材料能夠維持細胞形態、功能和表型，為種子細胞生長提供合適的微環境。Turner等[15]研究表明，以多聚氨基甲酸酯納米纖維制備的支架可以促進纖維環細胞生長；其他研究[16-20]也已證明支架提供的三維培養模式可以促進纖維環細胞對Ⅱ型膠原、Aggrecan以及GAG等細胞基質的分泌。目前研究較多的支架材料有藻酸鹽、蠶絲、殼聚糖、聚羥基乙酸等，但均未在可降解性和生物力學維持方面獲得滿意的效果[21-22]。以藻酸鹽、殼聚糖類材料為代表的天然來源支架材料缺乏結構完整性，不能隨意控制和設計其理化性質，故而力學性能較差，降解性差，且不易大量制備。KLD-12多肽納米纖維凝膠是一種新型可注射支架材料，由Ksiday等設計合成，用于軟骨缺損修復。體外實驗證實[23]，復合于KLD-12多肽納米纖維凝膠內的軟骨細胞生長良好，可維持穩定的軟骨細胞表型，合成并分泌Aggrecan和Ⅱ型膠原等軟骨基質成分，凝膠生物力學性能隨基質的聚積而增強。本課題組前期成功構建了含有ACN-KLDLKLDLKLDL-CNH2片段的KLD-12多肽分子，并對KLD-12多肽自組裝特性、生物相容性及作為椎間盤組織工程支架材料的可行性進行了研究[7-8]，結果表明KLD-12多肽分子能自組裝形成結構完整的水凝膠及納米纖維網狀結構。KLD-12多肽及其降解產物不誘導宿主免疫排斥反應及溶血反應，且無毒副作用，不影響作為椎間盤種子細胞的纖維環細胞生物活性，具有良好的生物相容性[24]，適合作為椎間盤組織工程的支架材料。
本實驗以兔纖維環細胞為種子細胞，以KLD-12多肽納米纖維凝膠為支架材料，研究體外環境下纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中的增殖、功能和表型變化。復合培養14 d，倒置顯微鏡下觀察示凝膠內纖維環細胞呈圓形，凝膠邊緣處細胞則以長梭形貼壁生長。CCK-8法檢測結果顯示，凝膠內纖維環細胞增殖活性隨時間延長而增長，培養至5?d時細胞活性快速增加，之后活性逐漸減弱；11 d后細胞活性又大幅增加。整個過程細胞增殖活性雖有波動，但一直處于上升趨勢。增殖活性波動可能與KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠培養方式改變有關。Calcein-AM/PI雙熒光染色結果表明，細胞在凝膠內大量存活，僅少數死亡，同時出現啞鈴形分裂期細胞，說明細胞可正常分裂增殖。培養5、14 d時活細胞比率比較差異無統計學意義。從以上兩項指標來看，纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中能夠正常增殖，但增殖能力欠穩定，這可能與培養環境改變及缺少促生長因子有關。
GAG含量檢測示，培養基內可檢測到GAG。細胞中GAG含量隨培養時間延長逐漸增加，8 d時達峰值，之后逐漸下降。可見纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中可以正常分泌GAG，但GAG分泌功能欠穩定和持久，可能與KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠內缺乏促生長因子有關。免疫熒光染色顯示凝膠內培養的纖維環細胞能夠正常分泌Ⅱ型膠原，且離細胞核越近Ⅱ型膠原越多，此現象符合正常纖維環細胞分泌Ⅱ型膠原的規律。RT-qPCR檢測示，培養于凝膠內的纖維環細胞可正常表達Ⅱ型膠原和Aggrecan，培養14 d的基因相對表達量均高于5 d時。以上結果顯示，KLD-12多肽納米纖維凝膠中纖維環細胞在基因水平及分子水平上，可以保持正常的細胞基質分泌功能，維持細胞表型。椎間盤退變時由于椎間盤細胞數量減少，細胞外基質也隨之減少，由此造成椎間盤結構彈性下降；纖維環結構形態因彈性下降極易發生改變，當椎體間壓力升高時，容易造成椎間盤膨出甚至突出。纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中大量分泌細胞外基質，可以補充因細胞數量減少而缺少的細胞外基質，維持椎間盤彈性和纖維環形態，從而緩解椎管內壓力，減輕神經刺激癥狀，緩解疼痛。
綜上述，KLD-12多肽納米纖維凝膠能為纖維環細胞生長提供良好的三維環境，凝膠內的纖維環細胞可保持正常細胞形態和增殖能力，在基因及分子水平維持纖維環細胞表型及功能穩定，為填補髓核摘除術后空腔、緩解因椎間盤細胞減少造成的椎間盤退變的臨床癥狀提供了新的研究思路。但本實驗僅探討了體外環境下纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中的生長情況，還需要進一步進行體內實驗，以驗證在動物體內環境纖維環細胞復合KLD-12多肽納米纖維凝膠后是否仍具有良好的增殖生長能力及椎間盤基質分泌能力。
腰椎間盤退變是引發下腰部疼痛的主要病因[1]；其主要病理表現為髓核、纖維環等椎間盤組織中細胞凋亡、細胞減少，組織含水量及蛋白多糖等細胞外基質含量減少[2-4]。纖維環細胞是構成纖維環組織的細胞，其生物學特性與髓核細胞類似[5]，且在體外培養時穩定性較髓核細胞更強[6]，因此在椎間盤組織工程中常被用作種子細胞。KLD-12多肽是一種新型的組織工程支架材料，具有自組裝特性和良好的生物相容性，能為椎間盤組織工程種子細胞提供適合生長的三維空間[7-8]。本實驗旨在檢測復合培養后纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中的生物活性，以期為椎間盤退變的生物學治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡新西蘭大白兔1只，雌雄不限，體質量2.5?kg，由石河子大學醫學院實驗動物中心提供。
L-DMEM培養基、FBS（HyClone公司，美國）；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、PBS緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；TGF-β1（Pepro Tech公司，美國）；KLD-12多肽（上海生工生物工程股份有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；武漢博士德生物科技有限公司）；阿爾新藍、硫酸軟骨素鈉（Sigma公司，美國）；Ⅱ型膠原抗體（Themo Fisher公司，美國）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；SYBR Green PCR Kit（Qiagen公司，德國）；PCR引物（Takara公司，日本）。5%CO2培養箱（Themo Fisher公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；共聚焦顯微鏡（Zeiss公司，德國）；酶標儀（Bio-Rad公司，美國）；ABI7500實時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）。
1.2 兔纖維環細胞的分離培養
按文獻[6]方法分離培養纖維環細胞。取6月齡新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射5 mL空氣處死，作背部正中切口，無菌條件下取腰段脊柱。先后浸泡聚維酮碘溶液及乙醇溶液各15 min消毒后，沿椎間盤上緣切開纖維環，切取內1/3纖維環組織，放入預先加入2 mL L-DMEM培養基的玻璃瓶內，眼科剪剪碎至0.5 cm3大小；加入4 mL 0.25%胰蛋白酶，37℃消化25 min，棄胰蛋白酶，加入5?mL 0.25%Ⅱ型膠原酶，37℃消化3.5 h，棄Ⅱ型膠原酶；加入3 mL L-DMEM培養基，以離心半徑13?cm、1?000 r/min離心5 min，棄上清；加入2 mL含10%FBS的L-DMEM培養基，按1×105個/mL密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。每4天換液1次，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況；待細胞生長至80%～90%融合時，按1:3比例傳代培養。
1.3 KLD-12多肽納米纖維凝膠與兔纖維環細胞復合培養
用10%蔗糖溶液溶解10 mg KLD-12多肽凍干粉劑，配制成濃度為0.56%（w/v）的多肽溶液，置于渦旋式振蕩器上反復振蕩30 min。用0.25%胰蛋白酶消化第3代兔纖維環細胞，制成密度為1×107個/mL的細胞懸液。將細胞懸液與KLD-12多肽溶液復合，振蕩混勻，形成KLD-12多肽/纖維環細胞懸液復合物。向KLD-12多肽/纖維環細胞懸液復合物中加入PBS液，37℃誘發自組裝20 min，去除上層PBS液[9]，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，制備KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠。定期更換培養基。倒置顯微鏡下觀察細胞在凝膠內分布及細胞形態。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞增殖活性檢測
采用CCK-8法檢測細胞增殖能力[10]。分別取KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠（實驗組）和空白KLD-12多肽凝膠（對照組）置于96孔培養板，每3天更換1次培養基。分別于培養2、5、8、11、14?d，每組取6孔，避光加入CCK-8試劑10μL，37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中孵育4 h，酶標儀檢測激發光波長490 nm處的吸光度（A）值。
1.4.2 鈣黃綠素（Calcein-AM）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙熒光染色
取KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠置于48孔培養板，每2天更換1次培養基。于培養5、14 d分別取6孔凝膠行Calcein-AM/PI染色[11]，具體步驟：PBS清洗2遍后，培養孔內加入Calcein-AM/PI混合染液，37℃避光孵育30?min，棄染液，PBS漂洗2遍。倒置熒光顯微鏡藍色激發光（490 nm）下觀察，活細胞細胞質呈綠色熒光，死細胞細胞質無熒光；死細胞細胞核經PI染色呈紅色熒光，活細胞細胞核無熒光。鏡下每孔選5個區域，于40倍視野下分別計數活、死細胞，按以下公式計算活細胞比率：活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%。
1.4.3 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量檢測
取KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠（實驗組）和空白KLD-12多肽凝膠（對照組）置于24孔培養板，每組復5孔。每3天更換1次培養基，于培養2、5、8、11、14 d收集兩組培養基，采用阿爾新藍法[12]檢測培養基內GAG含量，以實驗組與對照組A值比值進行統計分析。
1.4.4 Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察
取KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠置于共聚焦培養皿（實驗組），每3天更換1次培養基。于培養14 d行Ⅱ型膠原免疫熒光染色，同時對細胞核行PI染色[13]，染色在暗盒內進行。以未加一抗的標本（KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠）作為陰性對照組，每組復5孔。激光共聚焦顯微鏡下（藍色激發光490 nm）觀察纖維環細胞Ⅱ型膠原表達情況。
1.4.5 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測
取KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠置于6孔培養板，于培養5、14?d分別取4孔凝膠，采用RT-qPCR法[14]檢測凝膠內纖維環細胞Ⅱ型膠原和蛋白聚糖（Aggrecan）基因相對表達量（采用2-ΔΔCt法計算）。引物序列：Ⅱ型膠原上游5' -GTCTCCATAGCTGAAGTGG-3' ，下游5' -CCATGCAGTACATGGGGG-3' ，產物大小386 bp；Aggrecan上游5' -GCTACGGAGACAAGGATGAGT-TC-3' ，下游5' -CGTAAAAGACCTCACCCTCCAT-3' ，產物大小114 bp；β-actin上游5' -TGCTTCTAGGCGGACTGTTA-3' ，下游5' -CGTCACATGGCATCTCA-CGA-3' ，產物大小314 bp。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察
纖維環細胞接種于6孔培養板中呈圓形懸浮于培養基各層，24 h后呈圓形貼壁，48 h后細胞伸出偽足，呈長梭形或多角形；8 d后細胞開始大量增殖，細胞在群落中呈漩渦狀或柵欄狀分布；20 d后細胞融合可達80%。傳至第3代，細胞體積較第1代增大，形態為長梭形。纖維環細胞與KLD-12多肽復合培養24 h后呈圓形貼壁，在凝膠邊緣處貼壁細胞呈長梭形或多角形；3 d后可見啞鈴狀增殖期細胞。14 d后，貼壁細胞互相接觸達80%。見圖 1。
圖1
兔纖維環細胞形態學觀察（倒置顯微鏡×10） ? 第3代細胞呈長梭形 ? 與KLD-12多肽復合培養14 d在凝膠中呈圓形 圖 2 CCK-8法檢測纖維環細胞增殖活性 圖 3培養各時間點Calcein-AM/PI雙熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×40） ? 5?d ? 14 d 圖 4培養各時間點GAG含量檢測 圖 5培養14 d兩組Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×40） ? 實驗組 ? 陰性對照組
Figure1.
Morphology observation of annulus fibrosus cells (Inverted microscope×10) ? Annulus fibrosus cells at passage 3, showing long spindle shape ? Annulus fibrosus cells on KLD-12 polypeptide nanofiber gel, showing round shape at 14 days Fig. 2 Proliferation of annulus fibrosus cells at different time points after culture by CCK-8 Fig. 3 The morphology of annulus fibrosus cells by Calcein-AM/PI fluorescent staining (Inverted fluorescence microscope×40) ? At 5?days ? At 14 days Fig. 4 The content of GAG at different time points after cluture Fig. 5 Immunofluorescence staining of collagen type II at 14?days (Laser confocal microscope×40) ? Experimental group ? Negative control group
2.2 細胞增殖活性檢測
實驗組細胞增殖活性隨培養時間延長呈總體增加趨勢，培養2 d A值顯著低于其余各時間點，14 d顯著高于其余各時間點，差異均有統計學意義（P < 0.05）；5、8、11 d間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。培養各時間點，實驗組A值均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2。
2.3 Calcein-AM/PI雙熒光染色觀察
倒置熒光顯微鏡觀察示，培養5 d，細胞在凝膠中生長狀況良好，可見大量活細胞存在，并維持圓形細胞形態，部分于凝膠邊緣處貼壁的細胞呈多角形，僅見極少死細胞存在；培養14 d，啞鈴形的分裂期細胞數量增多。見圖 3。培養5、14 d凝膠內細胞活細胞比率分別89.32%±8.58%和97.81%±1.09%，比較差異無統計學意義（t=-1.962，P=0.097）。
2.4 GAG含量檢測
細胞中GAG含量隨培養時間延長逐漸增加，8 d時達峰值，之后逐漸下降。培養5、8、11 d時GAG含量顯著高于2、14 d時，差異有統計學意義（P < 0.05）；2、14 d之間比較以及5、8、11 d之間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 4。
2.5 Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察
激光共聚焦顯微鏡觀察示，實驗組培養14 d，細胞在凝膠中生長狀況良好，Ⅱ型膠原呈綠色熒光，細胞核呈紅色熒光，可見Ⅱ型膠原在細胞質中圍繞細胞核大量存在，且離核越近表達量越高；陰性對照組細胞中未見綠色熒光。見圖 5。
2.6 RT-qPCR檢測基因表達情況
培養5、14 d凝膠內纖維環細胞均可見Ⅱ型膠原和Aggrecan基因表達，5、14 d時Ⅱ型膠原基因相對表達量分別為1.001±0.013和2.591±0.063，比較差異有統計學意義（t=-2.732，P=0.008）；Aggrecan基因相對表達量分別為1.001±0.021和2.039±0.036，比較差異有統計學意義（t=-2.090，P=0.041）。
3 討論
腰椎間盤退變是引起下腰痛的主要原因之一，主要以保守治療、物理治療和手術治療為主。但對于早期椎間盤退變，臨床上尚無較好治療方法。椎間盤組織工程為治療椎間盤早期退變及填充髓核摘除術后空腔提供了可能。種子細胞與支架材料是椎間盤組織工程的核心內容，作為椎間盤組織工程的種子細胞，應具備合成Ⅱ型膠原、Aggrecan等椎間盤基質成分的能力。椎間盤組織工程種子細胞的來源主要為椎間盤細胞、軟骨細胞和MSCs，本實驗使用的纖維環細胞為椎間盤細胞的一種，主要存在于椎間盤纖維環組織中。相比于BMSCs，纖維環細胞是一種分化成熟的椎間盤細胞，在無需進行體外轉化培養的情況下，即可大量合成Aggrecan及Ⅱ型膠原等椎間盤基質成分。此生物學特性與同為椎間盤細胞的髓核細胞極為類似。有研究顯示[6]，在體外培養實驗中，髓核細胞培養5 d后開始貼壁，17 d可進行傳代，傳至第2代時細胞活力由98%下降至80%；而纖維環細胞培養4 d后開始貼壁，12 d可進行傳代，傳至第2代時細胞活力仍然可保持在98%。因此可以認為，在體外培養實驗中纖維環細胞顯示出了比髓核細胞更強的穩定性，更適合作為椎間盤組織工程種子細胞。
良好的支架材料能夠維持細胞形態、功能和表型，為種子細胞生長提供合適的微環境。Turner等[15]研究表明，以多聚氨基甲酸酯納米纖維制備的支架可以促進纖維環細胞生長；其他研究[16-20]也已證明支架提供的三維培養模式可以促進纖維環細胞對Ⅱ型膠原、Aggrecan以及GAG等細胞基質的分泌。目前研究較多的支架材料有藻酸鹽、蠶絲、殼聚糖、聚羥基乙酸等，但均未在可降解性和生物力學維持方面獲得滿意的效果[21-22]。以藻酸鹽、殼聚糖類材料為代表的天然來源支架材料缺乏結構完整性，不能隨意控制和設計其理化性質，故而力學性能較差，降解性差，且不易大量制備。KLD-12多肽納米纖維凝膠是一種新型可注射支架材料，由Ksiday等設計合成，用于軟骨缺損修復。體外實驗證實[23]，復合于KLD-12多肽納米纖維凝膠內的軟骨細胞生長良好，可維持穩定的軟骨細胞表型，合成并分泌Aggrecan和Ⅱ型膠原等軟骨基質成分，凝膠生物力學性能隨基質的聚積而增強。本課題組前期成功構建了含有ACN-KLDLKLDLKLDL-CNH2片段的KLD-12多肽分子，并對KLD-12多肽自組裝特性、生物相容性及作為椎間盤組織工程支架材料的可行性進行了研究[7-8]，結果表明KLD-12多肽分子能自組裝形成結構完整的水凝膠及納米纖維網狀結構。KLD-12多肽及其降解產物不誘導宿主免疫排斥反應及溶血反應，且無毒副作用，不影響作為椎間盤種子細胞的纖維環細胞生物活性，具有良好的生物相容性[24]，適合作為椎間盤組織工程的支架材料。
本實驗以兔纖維環細胞為種子細胞，以KLD-12多肽納米纖維凝膠為支架材料，研究體外環境下纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中的增殖、功能和表型變化。復合培養14 d，倒置顯微鏡下觀察示凝膠內纖維環細胞呈圓形，凝膠邊緣處細胞則以長梭形貼壁生長。CCK-8法檢測結果顯示，凝膠內纖維環細胞增殖活性隨時間延長而增長，培養至5?d時細胞活性快速增加，之后活性逐漸減弱；11 d后細胞活性又大幅增加。整個過程細胞增殖活性雖有波動，但一直處于上升趨勢。增殖活性波動可能與KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠培養方式改變有關。Calcein-AM/PI雙熒光染色結果表明，細胞在凝膠內大量存活，僅少數死亡，同時出現啞鈴形分裂期細胞，說明細胞可正常分裂增殖。培養5、14 d時活細胞比率比較差異無統計學意義。從以上兩項指標來看，纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中能夠正常增殖，但增殖能力欠穩定，這可能與培養環境改變及缺少促生長因子有關。
GAG含量檢測示，培養基內可檢測到GAG。細胞中GAG含量隨培養時間延長逐漸增加，8 d時達峰值，之后逐漸下降。可見纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中可以正常分泌GAG，但GAG分泌功能欠穩定和持久，可能與KLD-12多肽/纖維環細胞凝膠內缺乏促生長因子有關。免疫熒光染色顯示凝膠內培養的纖維環細胞能夠正常分泌Ⅱ型膠原，且離細胞核越近Ⅱ型膠原越多，此現象符合正常纖維環細胞分泌Ⅱ型膠原的規律。RT-qPCR檢測示，培養于凝膠內的纖維環細胞可正常表達Ⅱ型膠原和Aggrecan，培養14 d的基因相對表達量均高于5 d時。以上結果顯示，KLD-12多肽納米纖維凝膠中纖維環細胞在基因水平及分子水平上，可以保持正常的細胞基質分泌功能，維持細胞表型。椎間盤退變時由于椎間盤細胞數量減少，細胞外基質也隨之減少，由此造成椎間盤結構彈性下降；纖維環結構形態因彈性下降極易發生改變，當椎體間壓力升高時，容易造成椎間盤膨出甚至突出。纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中大量分泌細胞外基質，可以補充因細胞數量減少而缺少的細胞外基質，維持椎間盤彈性和纖維環形態，從而緩解椎管內壓力，減輕神經刺激癥狀，緩解疼痛。
綜上述，KLD-12多肽納米纖維凝膠能為纖維環細胞生長提供良好的三維環境，凝膠內的纖維環細胞可保持正常細胞形態和增殖能力，在基因及分子水平維持纖維環細胞表型及功能穩定，為填補髓核摘除術后空腔、緩解因椎間盤細胞減少造成的椎間盤退變的臨床癥狀提供了新的研究思路。但本實驗僅探討了體外環境下纖維環細胞在KLD-12多肽納米纖維凝膠中的生長情況，還需要進一步進行體內實驗，以驗證在動物體內環境纖維環細胞復合KLD-12多肽納米纖維凝膠后是否仍具有良好的增殖生長能力及椎間盤基質分泌能力。
