引用本文： 康獻剛, 趙智遠, 吳旭芝, 沈慶欣, 王志強, 康悅, 邢振廣, 張濤. 殼聚糖-同種異體骨粉復合多孔支架修復大鼠骨缺損的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(3): 298-302. doi: 10.7507/1002-1892.20160059 復制
骨缺損修復重建一直是骨外科、整形外科等領域的常見難題，針對臨床不同需求構建不同類型組織工程骨是目前研究方向[1-5]。支架材料是構建組織工程骨的主要因素之一，基于楊志明[6]對支架材料基本要求和性能的闡述，以及目前對殼聚糖、同種異體骨的認識[7-8]，我們以殼聚糖和同種異體骨粉制備復合支架材料，以克服單一殼聚糖支架不具備成骨作用的缺陷。經預實驗發現，殼聚糖與直徑74～125μm的骨粉以質量比1:5混合制備的復合多孔支架材料，具有良好孔隙率，能促進骨傳導及爬行替代。本次實驗將制備的支架材料植入大鼠體內，探討其修復骨缺損以及作為骨組織工程支架材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康8月齡雄性SD大鼠40只，體質量250～300 g，由華北理工大學實驗動物中心提供。殼聚糖（分子量3.5×106，脫乙酰度85%；Sigma公司，美國）；SD大鼠同種異體骨粉（直徑74～125μm；山西省醫用組織庫）。兔抗大鼠骨保護素（osteoprotegerin，OPG）一抗、通用型SP免疫組織化學試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）。JSM-6360LV掃描電鏡（JEOL公司，日本）；DMLB2熒光/光學顯微鏡及數碼攝像系統（Leica公司，德國）。
1.2 殼聚糖-同種異體骨粉復合多孔支架制備及觀測
1.2.1 支架制備
取SD大鼠同種異體骨粉，EDTA脫鈣液脫鈣；脫鈣終點判斷采用Von Kossa染色法，以脫鈣區域透明不著色，未脫鈣區域著黑色為準。經12、24、48、72 h鏡下觀察，顯示72?h時骨粉完全脫鈣，呈透明狀（圖 1）；蒸餾水沖洗，PBS液反復沖洗，去除酸性物質，測其pH值為7.3，凍干備用。以1%乙酸溶液稀釋殼聚糖，制成質量分數為5%的殼聚糖溶液；按照質量比1:5比例加入脫鈣骨粉；充分混合均勻，靜止脫泡，注入直徑為5.5 mm的筒狀模具中，—?50℃冷凍干燥成形，脫掉模具，置于PBS液中浸泡，使pH值達7.3左右；—?50℃冷凍干燥，密封包裝，60Co-γ射線輻照（劑量25?kGy），備用。同上法制備單純殼聚糖支架，作為對照。
圖1
同種異體骨粉脫鈣72 h Von Kossa染色觀察（×100） 圖 2兩種支架大體觀察左：復合多孔支架右：單純殼聚糖支架 圖 3掃描電鏡觀察兩種支架（×100） ? 復合多孔支架 ? 單純殼聚糖支架 圖 4兩組術后支架植入區大體觀察左：實驗組右：對照組 ? 術后2周 ? 術后12周 圖 5術后各時間點兩組組織學觀察（HE×200） ? 實驗組2周 ? 對照組2周 ? 實驗組8周 ? 對照組8周 ? 實驗組12周 ? 對照組12周 圖 6術后各時間點兩組OPG免疫組織化學染色觀察（×200） ? 實驗組8周 ? 對照組8周 ? 實驗組12周 ? 對照組12周
Figure1.
Von Kossa staining of decalcified allogeneic bone powder at 72 hours (×100) Fig. 2 Gross observation of 2 scaffolds Left: Composite porous scaffold Right: Pure chitosan scaffold Fig. 3 SEM observation of 2 scaffolds (×100) ? Composite porous scaffold ? Pure chitosan scaffold Fig. 4 Gross observation of 2 groups after operation Left: Experimental group Right: Control group ? At 2 weeks after operation ? At 12 weeks after operation Fig. 5 Histological observation of 2 groups at different time points after operation (HE×200) ? Experimental group at 2 weeks after operation ? Control group at 2 weeks after operation ? Experimental group at 8 weeks after operation ? Control group at 8 weeks after operation ? Experimental group at 12 weeks after operation ? Control group at 12 weeks after operation Fig. 6 OPG immunohistochemical observation of 2 groups at different time points after operation (×200) ? Experimental group at 8 weeks after operation ? Control group at 8 weeks after operation ? Experimental group at 12 weeks after operation ? Control group at 12?weeks after operation
1.2.2 支架觀測
①大體觀察兩種支架色澤、質地。②將兩種支架修剪為底部直徑3.5 mm、高5 mm的圓柱體，真空噴金，掃描電鏡下觀察并測量支架材料孔徑。③采用乙醇替代法測定兩種支架孔隙率。將材料放入含8 mL無水乙醇（V1）的10 mL量筒內，抽真空后測支架體積（V2），取出材料測量剩余乙醇體積（V3），根據公式計算孔隙率（p），p=（V1－V3）/（V2－V3）×100%。實驗重復8次。
1.3 體內植入實驗
1.3.1 實驗分組及方法
取40只SD大鼠經腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，在雙側股骨內上髁用醫用鉆各鉆一直徑為3.5 mm的孔，左側植入殼聚糖-同種異體骨粉復合多孔支架（實驗組），右側植入單純殼聚糖支架（對照組），逐層縫合。術后不限活動，正常飼養。
1.3.2 觀測指標
①一般情況：術后觀察大鼠存活以及切口愈合情況。②大體觀察：術后2、4、8、12周分別取10只大鼠，同上法麻醉后，觀察缺損區新骨長入情況及炎性反應程度。③組織學觀察：大體觀察后取出股骨，常規脫鈣，石蠟包埋，連續切片，片厚5μm。HE染色，光鏡下觀察骨缺損區修復情況。取兩組術后4、8、12周標本各6張切片，數碼相機照相，采用北航自動圖像分析系統測量單位視野成骨面積。④免疫組織化學染色觀察：術后4、8、12周，兩組各取10張切片，按SP免疫組織化學試劑盒說明書操作，兔抗大鼠OPG為一抗，染色前切片于56℃烤箱烘烤3 h左右。光鏡下觀察，OPG陽性表達呈棕黃色染色，位于細胞質。每張切片隨機選取5個高倍視野（×200），采用CMIAS真彩色醫學圖像分析系統對其中1個具有代表意義陽性結果視野的棕色顆粒進行標記，以此標準自動檢測所有視野的陽性結果，以參數平均吸光度（A）值代表其顆粒密度（即OPG陽性表達量）。以人骨肉瘤標本作為陽性對照，PBS替代一抗作為陰性對照。
1.4 統計學方法
采用SPSS11.5統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架觀測
2.1.1 大體觀察
二次冷凍干燥后，復合多孔支架色澤微黃，質地較脆，易折斷；單純殼聚糖支架呈灰白色，硬度低于復合多孔支架（圖 2）。
2.1.2 掃描電鏡觀察及孔隙率測定
掃描電鏡下見復合多孔支架存在孔徑大小不等（100～450?μm）的孔隙，大部分孔隙孔徑為200～300μm，孔隙內可見脫鈣骨粉。單純殼聚糖支架孔隙孔徑較復合多孔支架大（圖 3）。復合多孔支架及單純殼聚糖支架孔隙率分別為76.8%±1.1%及78.4%±1.4%，比較差異無統計學意義（t=-2.10，P=0.09）。
2.2 體內植入實驗
2.2.1 一般情況
術后大鼠均存活至實驗完成，切口均愈合良好，無感染發生。
2.2.2 大體觀察
術后2周，兩組股骨內上髁鉆孔大小無明顯變化，局部無感染；4、8周鉆孔逐步變小，兩組材料均開始吸收；12周，兩組鉆孔較前顯著變小，新生骨填充缺損區，且實驗組明顯多于對照組。見圖 4。
2.2.3 組織學觀察
術后2周，兩組觀察情況一致，可見炎性細胞浸潤及多核巨細胞，血腫機化，并可見完整的均質支架材料（圖 5a?、b）。4周時，實驗組支架材料內纖維結締組織長入，骨粉開始被分割吸收，周圍可見骨樣組織生成，并由缺損區周邊向中央長入；對照組亦見纖維組織長入支架材料，少量類骨樣組織。8周時，兩組支架炎性反應基本結束，支架材料部分降解吸收，新生骨樣組織明顯增多，沿支架材料長入，成骨細胞沿殼聚糖支架排列，并可見軟骨細胞團（圖 5c、d）。12周時，大量新生骨基質及軟骨細胞團與支架材料相互穿插包繞，新生附加骨生成分割支架材料，其中實驗組新生骨較對照組更明顯（圖 5e、f）。術后4、8、12周實驗組單位視野成骨面積均大于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
兩組術后各時間點單位視野成骨面積比較（n=10，μm2，2.2.4 免疫組織化學染色觀察
術后4周，兩組支架材料周圍大部分成骨細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞的細胞質內出現棕褐色陽性顆粒，8周時陽性表達更明顯（圖 6a、b），12周時仍見陽性顆粒，但陽性表達增加程度低于8周時（圖 6c、d）。各時間點實驗組OPG陽性表達量均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
兩組術后各時間點OPG陽性表達量比較（n=10，3 討論
既往楊樹青等[9]采用殼聚糖復合同種異體骨顆粒制備骨棒，修復兔橈骨節段缺損。結果顯示，骨棒雖有一定強度，但孔隙率低、孔徑小，不符合正常松質骨結構。研究表明，脫鈣骨基質具有一定生物活性，有良好的骨誘導及骨傳導作用[10-12]。本實驗利用脫鈣骨基質的優點，復合殼聚糖，通過冷凍干燥技術，制備成復合多孔支架，以便更好地修復骨缺損。實驗觀察顯示，殼聚糖復合同種異體骨粉制備的復合多孔支架具有良好的孔隙率及孔徑，更接近人體骨質結構，為細胞爬行替代、骨誘導奠定了良好基礎。
Kumar等[13]用殼聚糖與透輝石顆粒復合制備多孔支架，植入大鼠體內后觀察發現，該支架材料具有良好生物相容性，能促進或誘導成骨細胞增殖和擴展。本實驗也選擇SD大鼠進行植入觀察。組織學觀察示，各時間點實驗組均無明顯免疫排斥反應，4周后可見骨樣組織形成，之后大量軟骨細胞團形成，支架材料開始降解，4～8周為骨組織形成旺盛期，骨小梁成骨面積明顯增加。12周時材料大部分吸收降解，軟骨細胞團與支架材料相互穿插，骨粉周圍也可見大量軟骨細胞形成，有明顯骨誘導作用。
OPG是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，OPG配體（OPG ligand，OPGL）是Yasuda等[14]從成骨細胞上克隆得到的另一種骨代謝因子，又名核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL）。OPGL可增強破骨細胞運動能力，并抑制破骨細胞凋亡，間接促進骨吸收。成骨細胞表達RANKL與破骨細胞表面RANK結合，促進破骨細胞分化成熟。OPG可結合RANKL以消弱破骨細胞分化能力及活性，限制破骨細胞活性[15]。劉健等[16]通過比較不同濃度OPG對破骨細胞活性影響程度表明，OPG濃度越大，對破骨細胞抑制性就越強，充分表明了OPG在成骨中的作用。本實驗中，實驗組和對照組細胞質內均有OPG陽性表達，但實驗組陽性表達量更高，提示在缺損區成骨效應顯著，4～8周OPG表達增加速度快，說明在此期成骨效應及骨形成量最多，至12周時陽性表達增長減慢。
綜上述，采用殼聚糖與同種異體骨粉制備的復合多孔支架修復大鼠骨缺損可行，有望作為骨組織工程支架材料。但通過二次冷凍干燥技術制備的多孔材料孔隙間連通性欠佳，是該復合多孔支架不足之處。目前，有研究報道3D打印技術制備支架材料具有孔隙孔徑可控、孔隙間連通性好的優勢[17]。而且已有研究團隊成功打印鈦合金多孔支架材料，并通過羊椎體植入實驗證實大量骨組織長入支架材料內[18]。因此，我們下一步擬通過3D打印技術制備復合多孔支架，進一步提升支架材料的優勢。
骨缺損修復重建一直是骨外科、整形外科等領域的常見難題，針對臨床不同需求構建不同類型組織工程骨是目前研究方向[1-5]。支架材料是構建組織工程骨的主要因素之一，基于楊志明[6]對支架材料基本要求和性能的闡述，以及目前對殼聚糖、同種異體骨的認識[7-8]，我們以殼聚糖和同種異體骨粉制備復合支架材料，以克服單一殼聚糖支架不具備成骨作用的缺陷。經預實驗發現，殼聚糖與直徑74～125μm的骨粉以質量比1:5混合制備的復合多孔支架材料，具有良好孔隙率，能促進骨傳導及爬行替代。本次實驗將制備的支架材料植入大鼠體內，探討其修復骨缺損以及作為骨組織工程支架材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康8月齡雄性SD大鼠40只，體質量250～300 g，由華北理工大學實驗動物中心提供。殼聚糖（分子量3.5×106，脫乙酰度85%；Sigma公司，美國）；SD大鼠同種異體骨粉（直徑74～125μm；山西省醫用組織庫）。兔抗大鼠骨保護素（osteoprotegerin，OPG）一抗、通用型SP免疫組織化學試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）。JSM-6360LV掃描電鏡（JEOL公司，日本）；DMLB2熒光/光學顯微鏡及數碼攝像系統（Leica公司，德國）。
1.2 殼聚糖-同種異體骨粉復合多孔支架制備及觀測
1.2.1 支架制備
取SD大鼠同種異體骨粉，EDTA脫鈣液脫鈣；脫鈣終點判斷采用Von Kossa染色法，以脫鈣區域透明不著色，未脫鈣區域著黑色為準。經12、24、48、72 h鏡下觀察，顯示72?h時骨粉完全脫鈣，呈透明狀（圖 1）；蒸餾水沖洗，PBS液反復沖洗，去除酸性物質，測其pH值為7.3，凍干備用。以1%乙酸溶液稀釋殼聚糖，制成質量分數為5%的殼聚糖溶液；按照質量比1:5比例加入脫鈣骨粉；充分混合均勻，靜止脫泡，注入直徑為5.5 mm的筒狀模具中，—?50℃冷凍干燥成形，脫掉模具，置于PBS液中浸泡，使pH值達7.3左右；—?50℃冷凍干燥，密封包裝，60Co-γ射線輻照（劑量25?kGy），備用。同上法制備單純殼聚糖支架，作為對照。
圖1
同種異體骨粉脫鈣72 h Von Kossa染色觀察（×100） 圖 2兩種支架大體觀察左：復合多孔支架右：單純殼聚糖支架 圖 3掃描電鏡觀察兩種支架（×100） ? 復合多孔支架 ? 單純殼聚糖支架 圖 4兩組術后支架植入區大體觀察左：實驗組右：對照組 ? 術后2周 ? 術后12周 圖 5術后各時間點兩組組織學觀察（HE×200） ? 實驗組2周 ? 對照組2周 ? 實驗組8周 ? 對照組8周 ? 實驗組12周 ? 對照組12周 圖 6術后各時間點兩組OPG免疫組織化學染色觀察（×200） ? 實驗組8周 ? 對照組8周 ? 實驗組12周 ? 對照組12周
Figure1.
Von Kossa staining of decalcified allogeneic bone powder at 72 hours (×100) Fig. 2 Gross observation of 2 scaffolds Left: Composite porous scaffold Right: Pure chitosan scaffold Fig. 3 SEM observation of 2 scaffolds (×100) ? Composite porous scaffold ? Pure chitosan scaffold Fig. 4 Gross observation of 2 groups after operation Left: Experimental group Right: Control group ? At 2 weeks after operation ? At 12 weeks after operation Fig. 5 Histological observation of 2 groups at different time points after operation (HE×200) ? Experimental group at 2 weeks after operation ? Control group at 2 weeks after operation ? Experimental group at 8 weeks after operation ? Control group at 8 weeks after operation ? Experimental group at 12 weeks after operation ? Control group at 12 weeks after operation Fig. 6 OPG immunohistochemical observation of 2 groups at different time points after operation (×200) ? Experimental group at 8 weeks after operation ? Control group at 8 weeks after operation ? Experimental group at 12 weeks after operation ? Control group at 12?weeks after operation
1.2.2 支架觀測
①大體觀察兩種支架色澤、質地。②將兩種支架修剪為底部直徑3.5 mm、高5 mm的圓柱體，真空噴金，掃描電鏡下觀察并測量支架材料孔徑。③采用乙醇替代法測定兩種支架孔隙率。將材料放入含8 mL無水乙醇（V1）的10 mL量筒內，抽真空后測支架體積（V2），取出材料測量剩余乙醇體積（V3），根據公式計算孔隙率（p），p=（V1－V3）/（V2－V3）×100%。實驗重復8次。
1.3 體內植入實驗
1.3.1 實驗分組及方法
取40只SD大鼠經腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，在雙側股骨內上髁用醫用鉆各鉆一直徑為3.5 mm的孔，左側植入殼聚糖-同種異體骨粉復合多孔支架（實驗組），右側植入單純殼聚糖支架（對照組），逐層縫合。術后不限活動，正常飼養。
1.3.2 觀測指標
①一般情況：術后觀察大鼠存活以及切口愈合情況。②大體觀察：術后2、4、8、12周分別取10只大鼠，同上法麻醉后，觀察缺損區新骨長入情況及炎性反應程度。③組織學觀察：大體觀察后取出股骨，常規脫鈣，石蠟包埋，連續切片，片厚5μm。HE染色，光鏡下觀察骨缺損區修復情況。取兩組術后4、8、12周標本各6張切片，數碼相機照相，采用北航自動圖像分析系統測量單位視野成骨面積。④免疫組織化學染色觀察：術后4、8、12周，兩組各取10張切片，按SP免疫組織化學試劑盒說明書操作，兔抗大鼠OPG為一抗，染色前切片于56℃烤箱烘烤3 h左右。光鏡下觀察，OPG陽性表達呈棕黃色染色，位于細胞質。每張切片隨機選取5個高倍視野（×200），采用CMIAS真彩色醫學圖像分析系統對其中1個具有代表意義陽性結果視野的棕色顆粒進行標記，以此標準自動檢測所有視野的陽性結果，以參數平均吸光度（A）值代表其顆粒密度（即OPG陽性表達量）。以人骨肉瘤標本作為陽性對照，PBS替代一抗作為陰性對照。
1.4 統計學方法
采用SPSS11.5統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架觀測
2.1.1 大體觀察
二次冷凍干燥后，復合多孔支架色澤微黃，質地較脆，易折斷；單純殼聚糖支架呈灰白色，硬度低于復合多孔支架（圖 2）。
2.1.2 掃描電鏡觀察及孔隙率測定
掃描電鏡下見復合多孔支架存在孔徑大小不等（100～450?μm）的孔隙，大部分孔隙孔徑為200～300μm，孔隙內可見脫鈣骨粉。單純殼聚糖支架孔隙孔徑較復合多孔支架大（圖 3）。復合多孔支架及單純殼聚糖支架孔隙率分別為76.8%±1.1%及78.4%±1.4%，比較差異無統計學意義（t=-2.10，P=0.09）。
2.2 體內植入實驗
2.2.1 一般情況
術后大鼠均存活至實驗完成，切口均愈合良好，無感染發生。
2.2.2 大體觀察
術后2周，兩組股骨內上髁鉆孔大小無明顯變化，局部無感染；4、8周鉆孔逐步變小，兩組材料均開始吸收；12周，兩組鉆孔較前顯著變小，新生骨填充缺損區，且實驗組明顯多于對照組。見圖 4。
2.2.3 組織學觀察
術后2周，兩組觀察情況一致，可見炎性細胞浸潤及多核巨細胞，血腫機化，并可見完整的均質支架材料（圖 5a?、b）。4周時，實驗組支架材料內纖維結締組織長入，骨粉開始被分割吸收，周圍可見骨樣組織生成，并由缺損區周邊向中央長入；對照組亦見纖維組織長入支架材料，少量類骨樣組織。8周時，兩組支架炎性反應基本結束，支架材料部分降解吸收，新生骨樣組織明顯增多，沿支架材料長入，成骨細胞沿殼聚糖支架排列，并可見軟骨細胞團（圖 5c、d）。12周時，大量新生骨基質及軟骨細胞團與支架材料相互穿插包繞，新生附加骨生成分割支架材料，其中實驗組新生骨較對照組更明顯（圖 5e、f）。術后4、8、12周實驗組單位視野成骨面積均大于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
兩組術后各時間點單位視野成骨面積比較（n=10，μm2，2.2.4 免疫組織化學染色觀察
術后4周，兩組支架材料周圍大部分成骨細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞的細胞質內出現棕褐色陽性顆粒，8周時陽性表達更明顯（圖 6a、b），12周時仍見陽性顆粒，但陽性表達增加程度低于8周時（圖 6c、d）。各時間點實驗組OPG陽性表達量均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
兩組術后各時間點OPG陽性表達量比較（n=10，3 討論
既往楊樹青等[9]采用殼聚糖復合同種異體骨顆粒制備骨棒，修復兔橈骨節段缺損。結果顯示，骨棒雖有一定強度，但孔隙率低、孔徑小，不符合正常松質骨結構。研究表明，脫鈣骨基質具有一定生物活性，有良好的骨誘導及骨傳導作用[10-12]。本實驗利用脫鈣骨基質的優點，復合殼聚糖，通過冷凍干燥技術，制備成復合多孔支架，以便更好地修復骨缺損。實驗觀察顯示，殼聚糖復合同種異體骨粉制備的復合多孔支架具有良好的孔隙率及孔徑，更接近人體骨質結構，為細胞爬行替代、骨誘導奠定了良好基礎。
Kumar等[13]用殼聚糖與透輝石顆粒復合制備多孔支架，植入大鼠體內后觀察發現，該支架材料具有良好生物相容性，能促進或誘導成骨細胞增殖和擴展。本實驗也選擇SD大鼠進行植入觀察。組織學觀察示，各時間點實驗組均無明顯免疫排斥反應，4周后可見骨樣組織形成，之后大量軟骨細胞團形成，支架材料開始降解，4～8周為骨組織形成旺盛期，骨小梁成骨面積明顯增加。12周時材料大部分吸收降解，軟骨細胞團與支架材料相互穿插，骨粉周圍也可見大量軟骨細胞形成，有明顯骨誘導作用。
OPG是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，OPG配體（OPG ligand，OPGL）是Yasuda等[14]從成骨細胞上克隆得到的另一種骨代謝因子，又名核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL）。OPGL可增強破骨細胞運動能力，并抑制破骨細胞凋亡，間接促進骨吸收。成骨細胞表達RANKL與破骨細胞表面RANK結合，促進破骨細胞分化成熟。OPG可結合RANKL以消弱破骨細胞分化能力及活性，限制破骨細胞活性[15]。劉健等[16]通過比較不同濃度OPG對破骨細胞活性影響程度表明，OPG濃度越大，對破骨細胞抑制性就越強，充分表明了OPG在成骨中的作用。本實驗中，實驗組和對照組細胞質內均有OPG陽性表達，但實驗組陽性表達量更高，提示在缺損區成骨效應顯著，4～8周OPG表達增加速度快，說明在此期成骨效應及骨形成量最多，至12周時陽性表達增長減慢。
綜上述，采用殼聚糖與同種異體骨粉制備的復合多孔支架修復大鼠骨缺損可行，有望作為骨組織工程支架材料。但通過二次冷凍干燥技術制備的多孔材料孔隙間連通性欠佳，是該復合多孔支架不足之處。目前，有研究報道3D打印技術制備支架材料具有孔隙孔徑可控、孔隙間連通性好的優勢[17]。而且已有研究團隊成功打印鈦合金多孔支架材料，并通過羊椎體植入實驗證實大量骨組織長入支架材料內[18]。因此，我們下一步擬通過3D打印技術制備復合多孔支架，進一步提升支架材料的優勢。
