引用本文： 李東, 張振輝, 鄭程程, 趙濱, 孫凱, 年爭好, 張西正, 李瑞欣, 李暉. 低溫3D打印聯合冷凍干燥技術制備組織工程骨支架的研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(3): 292-297. doi: 10.7507/1002-1892.20160058 復制
大塊骨缺損修復一直是臨床骨科難題，組織工程學的發展為骨缺損修復提供了新思路，組織工程骨有望取代傳統自體或同種異體骨，避免患者二次創傷[1]。組織工程骨支架材料及制備也成為了研究熱點。目前，較成熟的支架制備方法包括瀝除制孔法、冷凍干燥技術、靜電紡絲法等，以上方法制備的支架雖能滿足細胞生長的基本要求，但由于材料孔徑不可控以及孔隙連通性較差，使支架有效面積不足或營養物質供應不良，導致細胞在植入早期增殖、分化受影響。3D打印技術可以精確調控支架孔徑、孔隙率、連通性以及比表面積，還可以實現支架個體化。而低溫3D打印技術既可以避免激光固化成型技術對光敏材料的要求，也可以避免高溫熔融工藝的高溫環境對材料生物活性的影響，有望解決傳統支架制備方法存在的一系列問題[2-4]。研究表明，膠原蛋白（collagen，COL）、絲素蛋白（silk fibroin，SF）和納米羥基磷灰石（nano-hydroxyapatite，nHA）相結合可以模擬正常骨組織有機成分和無機成分，實現骨組織成分的仿生。為此，本研究選擇以COL、SF、nHA為支架材料，采用低溫3D打印聯合冷凍干燥技術制備組織工程骨支架，初步分析其細胞相容性，探討該技術制備組織工程骨支架的可行性及優勢。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1購自北京協和細胞資源中心。新鮮牛肌腱、胰蛋白酶、家蠶生絲（北京索萊寶生物科技有限公司）；α-MEM培養基（HyClone公司，美國）；FBS、青霉素及鏈霉素混合液（天津潤泰科技發展有限公司）；nHA（南京埃普瑞公司）；BCA蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。
計算機輔助軟件SolidWorks2014（Dassault Systemes公司，法國）；低溫生物3D打印機（杭州捷諾飛生物科技有限公司）；78646-2826型CO2細胞培養箱（Forma Scientifis公司，美國）；低溫冷凍干燥機、酶標儀（Thermo公司，美國）；倒置顯微鏡及照相系統（Olympus公司，日本）；S3000N掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；Instron5865力學試驗機（Instron公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 COL及SF制備
①COL制備：新鮮牛肌腱剝凈外膜，清除脂肪，粉碎后以0.05 mol/L Tris緩沖液浸泡24 h；收集沉淀，加入含有胃蛋白酶的醋酸溶液，收集上清液；加入3.5 mol/L NaCl溶液，收集鹽析沉淀物，4℃去離子水透析5 d，測定COL溶液濃度，重復3次，取均值。
②SF制備：參照文獻[5]方法制備SF。取家蠶生絲置于0.5%無水Na2CO3溶液煮沸后，溶解于CaCl2·CH3CH2OH·H2O三元溶液進行脫膠，置入透析袋中用去離子水透析，采用40%聚乙二醇濃縮，以離心半徑10 cm、8 000 r/min離心20 min，測定SF溶液濃度，重復3次，取均值。
1.2.2 COL/SF/nHA復合支架制備
采用計算機輔助軟件SolidWorks2014設計大小為9 mm×9 mm×3 mm、孔徑為500μm的支架模型（圖 1），將數據以STL格式導入3D打印控制軟件中，設置打印參數：材料沉積速度10 mm/s，打印層厚0.5 mm，平臺成型溫度—?20℃，擠出速度0.09 mm/min，設備針頭直徑0.36 mm。根據預實驗結果，按照質量比9:3:2混合COL、SF和nHA，裝入低溫打印機料筒后開始打印，初步成型后—?20℃保存，真空冷凍干燥成型穩定；用無水乙醇和0.5%NaOH溶液分別浸泡24 h，去離子水浸泡30 min，60Co滅菌后備用。
圖1
計算機輔助軟件SolidWorks2014設計COL/SF/nHA復合支架模型圖 圖 2 COL/SF/nHA復合支架實物外觀 圖 3 COL/SF/nHA復合支架掃描電鏡觀察 ? ×100 ? ×1 500 圖 4細胞與支架共培養后各時間點倒置顯微鏡觀察（×40） ? 1?d ? 7?d ? 14?d ? 21?d 圖 5 MTT法檢測細胞與支架共培養后各時間點A值 圖 6細胞與支架共培養后各時間點掃描電鏡觀察 ? 7 d（×200） ? 14?d（×200） ? 21?d（×300） ? 21 d（×2?000）
Figure1.
COL/SF/nHA composite scaffold model by SolidWorks2014 software Fig. 2 Gross morphology of COL/SF/nHA composite scaffold Fig. 3 The SEM observation of COL/SF/nHA composite scaffold ? ×100 ? ×1 500 Fig. 4 The inverted microscope observation of cells on the COL/SF/nHA composite scaffold at different time points (×40) ? At 1 day ? At 7 days ? At 14 days ? At 21 days Fig. 5 Activity of MC3T3-E1 cells cultured on COL/SF/nHA composite scaffold by MTT Fig. 6 The SEM observation of cells on the COL/SF/nHA composite scaffold at different time points ? At 7 days (×200) ? At 14 days (×200) ? At 21 days (×300) ? At 21 days (×2 000)
1.3 觀測指標
1.3.1 支架形態及表征觀測
肉眼觀察COL/SF/nHA復合支架大小及形狀。取COL/SF/nHA復合支架，使用50%、70%、100%乙醇脫水各15 min，表面噴金后，掃描電鏡觀察支架孔隙結構，包括大孔（直徑> 200μm）及微孔（直徑< 100μm）。
1.3.2 力學性能檢測
將COL/SF/nHA復合支架（n=5）浸于pH7.4的0.01 mol/L PBS液中直至平衡。采用Instron5865力學試驗機進行支架壓縮力學性能測試，預設0.1 N預載荷，50%最大壓縮應變；繪制應力-應變曲線，計算支架壓縮位移、壓縮應力及彈性模量，分析支架力學性能。
1.3.3 支架與細胞共培養
將COL/SF/nHA復合支架浸入完全培養液中，置于培養箱內24 h，備用。取MC3T3-E1細胞置于50 mL培養瓶中，采用α-MEM完全培養液培養；待細胞長成單層傳至第3代，棄去培養液；加入37℃預溫的0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化2～3 min，棄去消化液；加入少量α-MEM完全培養液反復吹打，使細胞分散均勻，以離心半徑6 cm，1 500 r/min離心5 min。用移液槍取100μL細胞懸液接種至支架上，每個支架接種5×107個細胞。于37℃、5%CO2條件下培養4 h后，加入α-MEM完全培養液繼續培養。每2天換1次培養液。
①細胞形態觀察：分別于培養1、7、14、21 d，倒置顯微鏡下觀察支架內細胞形態。
②MTT檢測：于培養1、7、14、21 d，各取3個細胞-支架復合物置于24孔板內，每孔加入2%MTT液1 mL，置于37℃、5%CO2培養箱內4 h后，每孔加入2 mL DMSO，振蕩10 min后，用移液槍向每個樣本孔取150μL液體加于96孔板內，于酶標儀波長490 nm處測量吸光度（A）值。
③掃描電鏡觀察：取培養7、14、21 d的細胞-支架復合物，用含4%戊二醛的PBS溶液固定，2%鋨酸染色固定2 h，然后使用50%、70%、90%乙醇脫水各15 min，100%無水乙醇脫水3次各15 min，表面噴金，掃描電鏡觀察支架孔隙結構及細胞在支架表面黏附、伸展狀態。以空白支架作為對照。
④RT-PCR檢測：細胞-支架復合培養21?d時，棄培養液并用PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞3 min后，制成細胞懸液，以離心半徑6?cm、1?500?r/min離心5 min后Trizol保存。加入氯仿0.2?mL，以離心半徑4.9 cm、10 000 r/min離心10?min；加入等體積異丙醇后，以離心半徑4.9 cm、10 000 r/min離心10 min；用1.0 mL 75%乙醇洗滌后，以離心半徑4.9 cm、10 000 r/min離心1 min；加入30μL DEPC水處理溶解。逆轉錄合成cDNA的反應體系包括：4μL RNA模板，10μL 2×NI-RT Master Mix（Random），6μL DEPC水，經過25℃、5 min，37℃、30 min，95℃、1 min，4℃、1 min反應后，加入包括2μL模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物的反應體系，經過40個循環的95℃、3 min，95℃、15 s反應后，檢測細胞基因電泳圖，以β-actin作為內參，分析COLⅠ、ALP及骨鈣素（osteocalcin，OCN）基因表達情況。
⑤Western blot檢測：細胞-支架復合培養21?d時，棄培養液，PBS洗滌細胞2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞3 min后，反復吹打細胞，制成細胞懸液，以離心半徑6 cm、1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌細胞沉淀2次，加入1 mL RIPA裂解細胞20 min，以離心半徑4.9 cm、15 000 r/min離心20 min，收集細胞上清。配制8%、12%的分離膠及5%的濃縮膠，取細胞蛋白30μg，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后加入加樣孔中，加入Tris-Gly-SDS1X電泳緩沖液后開始電泳。電泳結束后去除濃縮膠，轉膜緩沖液中平衡凝膠15 min后組裝轉膜系統，低溫下恒定電流300 mA轉膜1 h，轉膜結束后將聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜與5%脫脂奶粉封閉液反應1 h。封閉后的PVDF膜分別與COLⅠ、ALP和OCN一抗孵育，抗體均按1:500比例稀釋，孵育時間為2 h或過夜，洗滌后PVDF膜與按1:5 000比例稀釋的二抗孵育1 h，最后使用定影劑及顯影劑開始顯影。以β-actin為內參，分析COLⅠ、ALP及OCN蛋白表達情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架形態及表征觀測
采用低溫3D打印聯合冷凍干燥技術成功制備大小為9 mm×9 mm×3 mm、呈立方體形狀COL/SF/nHA復合支架（圖 2）。掃描電鏡觀察見，支架為3D多孔徑立體結構，表面均勻分布直徑為（502.78±21.47）μm的大孔以及（62.48±22.07）μm的微孔（圖 3）。
2.2 力學性能檢測
COL/SF/nHA復合支架浸入PBS液后質地變軟，形態具有可復性。力學性能檢測示，支架彈性模量為（344.783 07±40.728 55）kPa，壓縮應力為（0.062?15±0.007 15）MPa，壓縮位移為（0.958?41±0.000?84）mm。
2.3 支架與細胞共培養觀察
2.3.1 倒置顯微鏡觀察
培養1 d后，支架大孔內未見細胞生長，7 d后大孔部分邊緣可見少量細胞黏附生長，14 d后大孔邊緣可見較多細胞生長，21 d后部分孔隙布滿細胞。見圖 4。
2.3.2 MTT檢測
隨著共培養時間增加，A值逐漸增大，各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05），提示細胞增殖活性良好。見圖 5。
2.3.3 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察，各時間點細胞在材料表面及孔隙內生長良好，伸展充分；隨著培養時間延長，細胞逐漸占據支架孔隙，孔隙內徑變小。見圖 6。
2.3.4 RT-PCR及Western blot檢測
RT-PCR及Western blot檢測示，MC3T3-E1細胞COLⅠ、ALP和OCN基因及蛋白均表達，提示細胞接種于支架后成骨分化良好。見圖 7、8。
圖7
RT-PCR檢測培養21 d COLⅠ、ALP和OCN基因表達1：β-actin 2：Marker 3：COLⅠ4：ALP 5：Marker 6：OCN 圖 8 Western blot檢測培養21 d COLⅠ、ALP和OCN蛋白表達
Figure7.
Electrophoresis results of COLⅠ, ALP, and OCN gene expressions by RT-PCR at 21 days 1:β-actin 2: Marker 3: COLⅠ4: ALP 5: Marker 6: OCN Fig. 8 Electrophoresis results of COLⅠ, ALP, and OCN protein expressions by Western blot at 21?days
3 討論
理想的骨組織工程支架材料必須具備良好的生物相容性和適應組織重建的降解性，一定的機械強度及優良的骨傳導性等[6]。COL作為細胞結構及細胞外基質的主要成分，有利于細胞黏附及外源細胞的導入，一直是構建組織工程支架的主要材料[7]。SF對機體細胞黏附能力強，具有緩慢降解性以及良好的力學性能和氧氣滲透性[8]。此外，其力學性能還可以通過生物技術等手段進一步提升，從而促進細胞增殖和分化[9]。nHA是骨骼的主要無機成分，具有良好的生物相容性、骨傳導性和離子交換性，已廣泛用于制備人工假體及支架，但簡單合成的HA晶體成型后強度低[10-11]。Meinel等[12]用鹽瀝法制備了3D多孔SF支架，同時比較了COL和SF作為組織工程支架對骨修復過程的影響；他們認為SF材料穩定的多孔結構、良好的機械性能以及緩慢的降解速率有利于SF支架中HA的沉積，促進組織工程骨網絡結構的形成。此外，將MC3T3-E1細胞與MSCs分別接種于SF/HA復合支架培養后發現，兩種細胞增殖和成骨分化趨勢相似，但MC3T3-E1細胞的增殖率更高[13]。以上研究提示，將一定比例的nHA與SF及COL結合，有望提高支架材料整體生物學和力學性能。本研究在預實驗基礎上，結合SF及COL的生物相容性、生物可降解性，以及nHA良好骨傳導性、生物活性特點，優化三者比例，將其充分物理混合為黏度及流動性較好的膠凍樣復合材料，作為3D打印材料。
致密的內外層骨板、哈弗系統及網狀骨松質相互連通，構成疏密結合的骨組織結構。支架制備工藝對材料的孔徑及孔隙連通性起著決定性作用，有利于新骨生長的支架孔徑介于10～500μm，而且多孔徑孔隙共存支架中細胞生長分化能力優于單一孔徑支架[14-15]。目前，大多數研究采用致孔劑或利用多孔性材料來模擬骨組織疏松多孔結構，但這些孔隙大小、分布及連通性不能再現骨組織的微觀結構，嚴重影響骨支架材料中營養的供給和代謝廢物的排出[16-17]。而采用低溫3D打印和冷凍干燥技術可精確構建宏觀結構與微觀結構相結合的組織工程支架，原理是根據模型路徑將復合材料通過打印設備制成多孔結構支架，真空冷凍干燥溶劑升華后形成大量微孔，由于在低溫環境中制備成型，不但能調控支架孔徑、孔隙率以及比表面積，而且有利于保持原材料的生物活性，實現復合材料優勢互補[18-19]。但是，低溫3D打印技術需要針對不同生物材料探索對應的打印參數，尤其是確定多種復合材料的打印參數更為困難。對于本研究采用的COL、SF、nHA，目前也無明確的三者適合質量比及低溫3D打印參數。研究表明，復合支架主要取決于有機相和無機相界面結合程度，目前多數研究中的有機/無機復合骨支架的力學性能與正常松質骨仍存在較大差異[20]，雖然可通過適當增加nHA的含量提高支架強度，但是支架韌性增大而彈性降低，在較低的力學載荷下更易發生斷裂，同時高含量的nHA在混合復合材料時難以分散均勻，導致支架材料成型后nHA部分聚集，吸水后易分散，進一步影響支架的彈性模量[21]。低溫3D打印設備要求復合材料具有高度均一性，提高nHA的含量后易堵塞針頭致成型效果不佳。本研究根據3種材料混合后性狀、成型后外觀穩定性及水溶性等特點，根據多次預實驗結果，制定出COL、SF和nHA以質量比9:3:2比例混合及適宜的低溫3D打印參數，聯合冷凍干燥技術成功制備出穩定的組織工程骨支架。
成型后的支架與計算機輔助設計軟件制備的模型形態及表征極為接近，大小為9 mm×9 mm×3?mm，并與冷凍干燥技術制備的微孔徑相結合，最大程度實現了天然骨組織特點。倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察結果均表明細胞在支架上黏附及生長狀態良好。MTT檢測顯示，細胞在培養時間內增殖良好，7?d時細胞在支架上增殖活躍，提示支架可促進細胞的早期黏附和增殖；14?d及21?d時雖出現增殖程度較前下降，結合倒置顯微鏡及掃描電鏡結果，考慮與細胞已充分占據支架表面，開始滲入支架孔隙中生長有關。COLⅠ是反映骨形成的重要指標。OCN維持骨組織礦物質沉積的正常鈣化，抑制異常的羥基磷灰石結晶的形成。ALP是成骨細胞早期分化的特異性標志，主要集中在骨化部位，是評價成骨細胞分泌及分化功能的指標之一。支架復合細胞培養21?d后采用RT-PCR及Western blot技術分析MC3T3-E1細胞的分化及礦化指標，結果表明COLⅠ、ALP及OCN基因均在MC3T3-E1細胞轉錄合成RNA并翻譯為蛋白質。說明支架制備工藝未破壞原材料的生物活性，成型后的支架細胞相容性良好，可促進MC3T3-E1細胞的增殖和分化。但本研究未對COLⅠ、ALP及OCN表達進行定量分析，有待下一步研究明確。為模擬正常骨組織周圍組織液環境，本研究測試了濕態下支架的力學性能，結果提示支架保持穩定的力學狀態，具有良好黏彈性，發揮力學支撐及傳遞作用。但是，作為骨缺損處的植入材料，雖然本研究制備的支架力學性能較前期制備的nHA/COL/SF支架有較大提升[22]，但尚未達到松質骨力學強度，后期研究需將支架接種細胞后植入動物體內，并施加生物力學載荷，觀察其修復骨缺損的效果。
大塊骨缺損修復一直是臨床骨科難題，組織工程學的發展為骨缺損修復提供了新思路，組織工程骨有望取代傳統自體或同種異體骨，避免患者二次創傷[1]。組織工程骨支架材料及制備也成為了研究熱點。目前，較成熟的支架制備方法包括瀝除制孔法、冷凍干燥技術、靜電紡絲法等，以上方法制備的支架雖能滿足細胞生長的基本要求，但由于材料孔徑不可控以及孔隙連通性較差，使支架有效面積不足或營養物質供應不良，導致細胞在植入早期增殖、分化受影響。3D打印技術可以精確調控支架孔徑、孔隙率、連通性以及比表面積，還可以實現支架個體化。而低溫3D打印技術既可以避免激光固化成型技術對光敏材料的要求，也可以避免高溫熔融工藝的高溫環境對材料生物活性的影響，有望解決傳統支架制備方法存在的一系列問題[2-4]。研究表明，膠原蛋白（collagen，COL）、絲素蛋白（silk fibroin，SF）和納米羥基磷灰石（nano-hydroxyapatite，nHA）相結合可以模擬正常骨組織有機成分和無機成分，實現骨組織成分的仿生。為此，本研究選擇以COL、SF、nHA為支架材料，采用低溫3D打印聯合冷凍干燥技術制備組織工程骨支架，初步分析其細胞相容性，探討該技術制備組織工程骨支架的可行性及優勢。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1購自北京協和細胞資源中心。新鮮牛肌腱、胰蛋白酶、家蠶生絲（北京索萊寶生物科技有限公司）；α-MEM培養基（HyClone公司，美國）；FBS、青霉素及鏈霉素混合液（天津潤泰科技發展有限公司）；nHA（南京埃普瑞公司）；BCA蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。
計算機輔助軟件SolidWorks2014（Dassault Systemes公司，法國）；低溫生物3D打印機（杭州捷諾飛生物科技有限公司）；78646-2826型CO2細胞培養箱（Forma Scientifis公司，美國）；低溫冷凍干燥機、酶標儀（Thermo公司，美國）；倒置顯微鏡及照相系統（Olympus公司，日本）；S3000N掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；Instron5865力學試驗機（Instron公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 COL及SF制備
①COL制備：新鮮牛肌腱剝凈外膜，清除脂肪，粉碎后以0.05 mol/L Tris緩沖液浸泡24 h；收集沉淀，加入含有胃蛋白酶的醋酸溶液，收集上清液；加入3.5 mol/L NaCl溶液，收集鹽析沉淀物，4℃去離子水透析5 d，測定COL溶液濃度，重復3次，取均值。
②SF制備：參照文獻[5]方法制備SF。取家蠶生絲置于0.5%無水Na2CO3溶液煮沸后，溶解于CaCl2·CH3CH2OH·H2O三元溶液進行脫膠，置入透析袋中用去離子水透析，采用40%聚乙二醇濃縮，以離心半徑10 cm、8 000 r/min離心20 min，測定SF溶液濃度，重復3次，取均值。
1.2.2 COL/SF/nHA復合支架制備
采用計算機輔助軟件SolidWorks2014設計大小為9 mm×9 mm×3 mm、孔徑為500μm的支架模型（圖 1），將數據以STL格式導入3D打印控制軟件中，設置打印參數：材料沉積速度10 mm/s，打印層厚0.5 mm，平臺成型溫度—?20℃，擠出速度0.09 mm/min，設備針頭直徑0.36 mm。根據預實驗結果，按照質量比9:3:2混合COL、SF和nHA，裝入低溫打印機料筒后開始打印，初步成型后—?20℃保存，真空冷凍干燥成型穩定；用無水乙醇和0.5%NaOH溶液分別浸泡24 h，去離子水浸泡30 min，60Co滅菌后備用。
圖1
計算機輔助軟件SolidWorks2014設計COL/SF/nHA復合支架模型圖 圖 2 COL/SF/nHA復合支架實物外觀 圖 3 COL/SF/nHA復合支架掃描電鏡觀察 ? ×100 ? ×1 500 圖 4細胞與支架共培養后各時間點倒置顯微鏡觀察（×40） ? 1?d ? 7?d ? 14?d ? 21?d 圖 5 MTT法檢測細胞與支架共培養后各時間點A值 圖 6細胞與支架共培養后各時間點掃描電鏡觀察 ? 7 d（×200） ? 14?d（×200） ? 21?d（×300） ? 21 d（×2?000）
Figure1.
COL/SF/nHA composite scaffold model by SolidWorks2014 software Fig. 2 Gross morphology of COL/SF/nHA composite scaffold Fig. 3 The SEM observation of COL/SF/nHA composite scaffold ? ×100 ? ×1 500 Fig. 4 The inverted microscope observation of cells on the COL/SF/nHA composite scaffold at different time points (×40) ? At 1 day ? At 7 days ? At 14 days ? At 21 days Fig. 5 Activity of MC3T3-E1 cells cultured on COL/SF/nHA composite scaffold by MTT Fig. 6 The SEM observation of cells on the COL/SF/nHA composite scaffold at different time points ? At 7 days (×200) ? At 14 days (×200) ? At 21 days (×300) ? At 21 days (×2 000)
1.3 觀測指標
1.3.1 支架形態及表征觀測
肉眼觀察COL/SF/nHA復合支架大小及形狀。取COL/SF/nHA復合支架，使用50%、70%、100%乙醇脫水各15 min，表面噴金后，掃描電鏡觀察支架孔隙結構，包括大孔（直徑> 200μm）及微孔（直徑< 100μm）。
1.3.2 力學性能檢測
將COL/SF/nHA復合支架（n=5）浸于pH7.4的0.01 mol/L PBS液中直至平衡。采用Instron5865力學試驗機進行支架壓縮力學性能測試，預設0.1 N預載荷，50%最大壓縮應變；繪制應力-應變曲線，計算支架壓縮位移、壓縮應力及彈性模量，分析支架力學性能。
1.3.3 支架與細胞共培養
將COL/SF/nHA復合支架浸入完全培養液中，置于培養箱內24 h，備用。取MC3T3-E1細胞置于50 mL培養瓶中，采用α-MEM完全培養液培養；待細胞長成單層傳至第3代，棄去培養液；加入37℃預溫的0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化2～3 min，棄去消化液；加入少量α-MEM完全培養液反復吹打，使細胞分散均勻，以離心半徑6 cm，1 500 r/min離心5 min。用移液槍取100μL細胞懸液接種至支架上，每個支架接種5×107個細胞。于37℃、5%CO2條件下培養4 h后，加入α-MEM完全培養液繼續培養。每2天換1次培養液。
①細胞形態觀察：分別于培養1、7、14、21 d，倒置顯微鏡下觀察支架內細胞形態。
②MTT檢測：于培養1、7、14、21 d，各取3個細胞-支架復合物置于24孔板內，每孔加入2%MTT液1 mL，置于37℃、5%CO2培養箱內4 h后，每孔加入2 mL DMSO，振蕩10 min后，用移液槍向每個樣本孔取150μL液體加于96孔板內，于酶標儀波長490 nm處測量吸光度（A）值。
③掃描電鏡觀察：取培養7、14、21 d的細胞-支架復合物，用含4%戊二醛的PBS溶液固定，2%鋨酸染色固定2 h，然后使用50%、70%、90%乙醇脫水各15 min，100%無水乙醇脫水3次各15 min，表面噴金，掃描電鏡觀察支架孔隙結構及細胞在支架表面黏附、伸展狀態。以空白支架作為對照。
④RT-PCR檢測：細胞-支架復合培養21?d時，棄培養液并用PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞3 min后，制成細胞懸液，以離心半徑6?cm、1?500?r/min離心5 min后Trizol保存。加入氯仿0.2?mL，以離心半徑4.9 cm、10 000 r/min離心10?min；加入等體積異丙醇后，以離心半徑4.9 cm、10 000 r/min離心10 min；用1.0 mL 75%乙醇洗滌后，以離心半徑4.9 cm、10 000 r/min離心1 min；加入30μL DEPC水處理溶解。逆轉錄合成cDNA的反應體系包括：4μL RNA模板，10μL 2×NI-RT Master Mix（Random），6μL DEPC水，經過25℃、5 min，37℃、30 min，95℃、1 min，4℃、1 min反應后，加入包括2μL模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物的反應體系，經過40個循環的95℃、3 min，95℃、15 s反應后，檢測細胞基因電泳圖，以β-actin作為內參，分析COLⅠ、ALP及骨鈣素（osteocalcin，OCN）基因表達情況。
⑤Western blot檢測：細胞-支架復合培養21?d時，棄培養液，PBS洗滌細胞2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞3 min后，反復吹打細胞，制成細胞懸液，以離心半徑6 cm、1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌細胞沉淀2次，加入1 mL RIPA裂解細胞20 min，以離心半徑4.9 cm、15 000 r/min離心20 min，收集細胞上清。配制8%、12%的分離膠及5%的濃縮膠，取細胞蛋白30μg，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后加入加樣孔中，加入Tris-Gly-SDS1X電泳緩沖液后開始電泳。電泳結束后去除濃縮膠，轉膜緩沖液中平衡凝膠15 min后組裝轉膜系統，低溫下恒定電流300 mA轉膜1 h，轉膜結束后將聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜與5%脫脂奶粉封閉液反應1 h。封閉后的PVDF膜分別與COLⅠ、ALP和OCN一抗孵育，抗體均按1:500比例稀釋，孵育時間為2 h或過夜，洗滌后PVDF膜與按1:5 000比例稀釋的二抗孵育1 h，最后使用定影劑及顯影劑開始顯影。以β-actin為內參，分析COLⅠ、ALP及OCN蛋白表達情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架形態及表征觀測
采用低溫3D打印聯合冷凍干燥技術成功制備大小為9 mm×9 mm×3 mm、呈立方體形狀COL/SF/nHA復合支架（圖 2）。掃描電鏡觀察見，支架為3D多孔徑立體結構，表面均勻分布直徑為（502.78±21.47）μm的大孔以及（62.48±22.07）μm的微孔（圖 3）。
2.2 力學性能檢測
COL/SF/nHA復合支架浸入PBS液后質地變軟，形態具有可復性。力學性能檢測示，支架彈性模量為（344.783 07±40.728 55）kPa，壓縮應力為（0.062?15±0.007 15）MPa，壓縮位移為（0.958?41±0.000?84）mm。
2.3 支架與細胞共培養觀察
2.3.1 倒置顯微鏡觀察
培養1 d后，支架大孔內未見細胞生長，7 d后大孔部分邊緣可見少量細胞黏附生長，14 d后大孔邊緣可見較多細胞生長，21 d后部分孔隙布滿細胞。見圖 4。
2.3.2 MTT檢測
隨著共培養時間增加，A值逐漸增大，各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05），提示細胞增殖活性良好。見圖 5。
2.3.3 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察，各時間點細胞在材料表面及孔隙內生長良好，伸展充分；隨著培養時間延長，細胞逐漸占據支架孔隙，孔隙內徑變小。見圖 6。
2.3.4 RT-PCR及Western blot檢測
RT-PCR及Western blot檢測示，MC3T3-E1細胞COLⅠ、ALP和OCN基因及蛋白均表達，提示細胞接種于支架后成骨分化良好。見圖 7、8。
圖7
RT-PCR檢測培養21 d COLⅠ、ALP和OCN基因表達1：β-actin 2：Marker 3：COLⅠ4：ALP 5：Marker 6：OCN 圖 8 Western blot檢測培養21 d COLⅠ、ALP和OCN蛋白表達
Figure7.
Electrophoresis results of COLⅠ, ALP, and OCN gene expressions by RT-PCR at 21 days 1:β-actin 2: Marker 3: COLⅠ4: ALP 5: Marker 6: OCN Fig. 8 Electrophoresis results of COLⅠ, ALP, and OCN protein expressions by Western blot at 21?days
3 討論
理想的骨組織工程支架材料必須具備良好的生物相容性和適應組織重建的降解性，一定的機械強度及優良的骨傳導性等[6]。COL作為細胞結構及細胞外基質的主要成分，有利于細胞黏附及外源細胞的導入，一直是構建組織工程支架的主要材料[7]。SF對機體細胞黏附能力強，具有緩慢降解性以及良好的力學性能和氧氣滲透性[8]。此外，其力學性能還可以通過生物技術等手段進一步提升，從而促進細胞增殖和分化[9]。nHA是骨骼的主要無機成分，具有良好的生物相容性、骨傳導性和離子交換性，已廣泛用于制備人工假體及支架，但簡單合成的HA晶體成型后強度低[10-11]。Meinel等[12]用鹽瀝法制備了3D多孔SF支架，同時比較了COL和SF作為組織工程支架對骨修復過程的影響；他們認為SF材料穩定的多孔結構、良好的機械性能以及緩慢的降解速率有利于SF支架中HA的沉積，促進組織工程骨網絡結構的形成。此外，將MC3T3-E1細胞與MSCs分別接種于SF/HA復合支架培養后發現，兩種細胞增殖和成骨分化趨勢相似，但MC3T3-E1細胞的增殖率更高[13]。以上研究提示，將一定比例的nHA與SF及COL結合，有望提高支架材料整體生物學和力學性能。本研究在預實驗基礎上，結合SF及COL的生物相容性、生物可降解性，以及nHA良好骨傳導性、生物活性特點，優化三者比例，將其充分物理混合為黏度及流動性較好的膠凍樣復合材料，作為3D打印材料。
致密的內外層骨板、哈弗系統及網狀骨松質相互連通，構成疏密結合的骨組織結構。支架制備工藝對材料的孔徑及孔隙連通性起著決定性作用，有利于新骨生長的支架孔徑介于10～500μm，而且多孔徑孔隙共存支架中細胞生長分化能力優于單一孔徑支架[14-15]。目前，大多數研究采用致孔劑或利用多孔性材料來模擬骨組織疏松多孔結構，但這些孔隙大小、分布及連通性不能再現骨組織的微觀結構，嚴重影響骨支架材料中營養的供給和代謝廢物的排出[16-17]。而采用低溫3D打印和冷凍干燥技術可精確構建宏觀結構與微觀結構相結合的組織工程支架，原理是根據模型路徑將復合材料通過打印設備制成多孔結構支架，真空冷凍干燥溶劑升華后形成大量微孔，由于在低溫環境中制備成型，不但能調控支架孔徑、孔隙率以及比表面積，而且有利于保持原材料的生物活性，實現復合材料優勢互補[18-19]。但是，低溫3D打印技術需要針對不同生物材料探索對應的打印參數，尤其是確定多種復合材料的打印參數更為困難。對于本研究采用的COL、SF、nHA，目前也無明確的三者適合質量比及低溫3D打印參數。研究表明，復合支架主要取決于有機相和無機相界面結合程度，目前多數研究中的有機/無機復合骨支架的力學性能與正常松質骨仍存在較大差異[20]，雖然可通過適當增加nHA的含量提高支架強度，但是支架韌性增大而彈性降低，在較低的力學載荷下更易發生斷裂，同時高含量的nHA在混合復合材料時難以分散均勻，導致支架材料成型后nHA部分聚集，吸水后易分散，進一步影響支架的彈性模量[21]。低溫3D打印設備要求復合材料具有高度均一性，提高nHA的含量后易堵塞針頭致成型效果不佳。本研究根據3種材料混合后性狀、成型后外觀穩定性及水溶性等特點，根據多次預實驗結果，制定出COL、SF和nHA以質量比9:3:2比例混合及適宜的低溫3D打印參數，聯合冷凍干燥技術成功制備出穩定的組織工程骨支架。
成型后的支架與計算機輔助設計軟件制備的模型形態及表征極為接近，大小為9 mm×9 mm×3?mm，并與冷凍干燥技術制備的微孔徑相結合，最大程度實現了天然骨組織特點。倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察結果均表明細胞在支架上黏附及生長狀態良好。MTT檢測顯示，細胞在培養時間內增殖良好，7?d時細胞在支架上增殖活躍，提示支架可促進細胞的早期黏附和增殖；14?d及21?d時雖出現增殖程度較前下降，結合倒置顯微鏡及掃描電鏡結果，考慮與細胞已充分占據支架表面，開始滲入支架孔隙中生長有關。COLⅠ是反映骨形成的重要指標。OCN維持骨組織礦物質沉積的正常鈣化，抑制異常的羥基磷灰石結晶的形成。ALP是成骨細胞早期分化的特異性標志，主要集中在骨化部位，是評價成骨細胞分泌及分化功能的指標之一。支架復合細胞培養21?d后采用RT-PCR及Western blot技術分析MC3T3-E1細胞的分化及礦化指標，結果表明COLⅠ、ALP及OCN基因均在MC3T3-E1細胞轉錄合成RNA并翻譯為蛋白質。說明支架制備工藝未破壞原材料的生物活性，成型后的支架細胞相容性良好，可促進MC3T3-E1細胞的增殖和分化。但本研究未對COLⅠ、ALP及OCN表達進行定量分析，有待下一步研究明確。為模擬正常骨組織周圍組織液環境，本研究測試了濕態下支架的力學性能，結果提示支架保持穩定的力學狀態，具有良好黏彈性，發揮力學支撐及傳遞作用。但是，作為骨缺損處的植入材料，雖然本研究制備的支架力學性能較前期制備的nHA/COL/SF支架有較大提升[22]，但尚未達到松質骨力學強度，后期研究需將支架接種細胞后植入動物體內，并施加生物力學載荷，觀察其修復骨缺損的效果。
