引用本文： 夏遠軍, 余翔, 章瑩, 尹慶水, 夏虹, 鄭曉輝, 謝會斌, 黃顯華. 重組人BMP-2/殼聚糖/硫酸葡聚糖復合微球誘導異位成骨的micro-CT評價. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(3): 286-291. doi: 10.7507/1002-1892.20160057 復制
骨誘導是近年來骨缺損領域的研究熱點。1965年Urist首次發現BMP是具有單獨誘導成骨能力的細胞生長因子[1]，其中BMP-2誘導成骨能力最強[2-3]。目前研究已明確，BMP-2具有在動物體內誘導異位骨形成的作用[4-5]。但是BMP-2半衰期短，容易代謝流失，不能維持足夠濃度，通過緩釋載體技術可有效解決這一問題。研究表明，載藥微球具有能控制藥物釋放速度、降低藥物毒副作用、提高疏水性藥物對細胞膜的通透性、改善藥物的穩定性和改變給藥途徑、延長藥物療效以及靶向給藥等優點[6]。有學者用殼聚糖（chitosan，CS）載體包裹重組人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）制備了CS/rhBMP-2微球[7]，載藥率為（33.437±2.290）μg/mg，但實驗中發現CS載體與rhBMP-2黏附效果不佳。本課題組前期實驗在CS/rhBMP-2微球基礎上引入硫酸葡聚糖（dextran sulfate，DS），構建rhBMP-2/CS/DS復合微球，實驗顯示該復合微球細胞相容性較好，載藥率高，并初步顯示出良好的骨誘導效果[8]。異位成骨實驗已廣泛用于驗證BMP-2及BMP-2微球的骨誘導能力[9]，可有效避免原位宿主骨的干擾因素，是國際上檢測骨替代材料性能的常用評價手段[10-11]。為此，本次實驗選取SD大鼠進行異位成骨實驗，采用micro-CT掃描并行骨組織參數檢測，進一步分析探討rhBMP-2/CS/DS復合微球的異位成骨能力。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8周齡SPF級雄性SD大鼠48只，體質量140～160 g，由廣州軍區廣州總醫院動物實驗中心提供。CS（分子量為50 000～190 000、脫乙酰度85%）、DS（分子量為500 000、硫含量40%～50%）（Sigma公司，美國）；rhBMP-2（上海瑞邦生物材料有限公司）；ZnSO4（天津化學試劑公司）；NaOH（廣州化學試劑廠）；0.22μm、0.45μm濾過膜（Millipre公司，美國）；ALP試劑盒、鈣離子檢測試劑盒（南京建成生物技術有限公司）。
JB-2型恒溫磁力攪拌器（上海雷磁儀器廠）；DJ-300S型電子天平（SHINKO公司，日本）；LGZ-12型低溫負壓凍干機（北京松源華興儀器公司）；DUPONT0-RC5C型高速冷凍臺式離心機（Thermo Fisher公司，美國）；S-4800掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；micro-CT（GE公司，美國）；Mimics10.1軟件（Materalise公司，比利時）。
1.2 微球制備及觀測
1.2.1 CS/DS微球制備
取CS溶于0.175%乙酸中，配制成1 mg/mL CS溶液；用0.45μm和0.22?μm濾過膜依次過濾；取DS溶于雙蒸水，配置1?mg/mL DS溶液，用0.45μm和0.22μm濾過膜依次過濾。取0.2?mL DS溶液，加入0.12 mL CS溶液，在1?500?r/min轉速下攪拌5 min后，加入0.1 mL ZnSO4，繼續攪拌30 min，加入5%甘露醇后將微球移至離心管中；4℃，以離心半徑6 cm、15?000 r/min離心15 min，棄上清液；同上法離心3次后凍干。用3 000 Gy 60Co輻照消毒后，密封，4℃保存備用。
1.2.2 rhBMP-2/CS/DS復合微球制備
CS及DS溶液配制同1.2.1方法。取0.2 mL DS溶液加入0.04?mL rhBMP-2，在1?500 r/min轉速下攪拌20 min后，加入0.12 mL CS溶液，5 min后加入0.1 mL ZnSO4，繼續攪拌30 min，加入5%甘露醇后將微球移至離心管中；4℃，以離心半徑6 cm、15?000 r/min離心15 min，棄上清液；同上法離心3次后凍干。用3 000 Gy 60Co輻照消毒后，密封，4℃保存備用。
1.2.3 觀測指標
①掃描電鏡觀察：取rhBMP-2/CS/DS復合微球，用蒸餾水稀釋后均勻滴于載玻片上，冷凍干燥后掃描電鏡下觀察微球形態。②體外緩釋檢測：取rhBMP-2/CS/DS復合微球（n=3），按照ELISA法于2、6、12、18、24、48、72 h，之后每隔3?d檢測上清液中rhBMP-2含量，觀測終點為20 d，繪制緩釋曲線。
1.3 實驗分組及方法
將48只SD大鼠采用隨機數字表法分為A、B、C、D 4組（n=12）。4組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，于左后肢大腿作長約1.5 cm切口，制備股四頭肌肌袋模型。A、B、C、D組肌袋肌間隙中分別植入相同體積明膠海綿、CS/DS微球（粉末狀）、rhBMP-2（粉末狀，0.25 mg）、rhBMP-2/CS/DS復合微球（粉末狀，含rhBMP-2 0.25 mg），逐層縫合切口。術后分籠正常喂養，自由進食、飲水；3 d內每天腹腔注射青霉素（5 mg/kg）抗感染。
1.3.1 一般情況
術后觀察大鼠存活情況，以及并發癥（如切口感染、紅腫、滲液等）發生情況。
1.3.2 micro-CT檢測及三維重建
術后4、8、12、16周，各組分別取3只大鼠脫頸處死。按照原切口入路切取異位骨化組織塊行micro-CT掃描。掃描參數：掃描分辨率21μm，旋轉角度360°，旋轉角度增量0.4°，電壓80 kV，電流80μA，曝光時間3?000?ms，幀平均數為4，像素組合為1×1。掃描完成后，于micro-CT中檢測以下參數：組織骨密度（tissue mineral density，TMD）、骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）、皮質骨骨密度（bone mineral density，BMD）及組織礦含量（tissue mineral content，TMC）。然后，將CT掃描原始數據導入Mimics10.1軟件，進行三維重建，觀察各組異位成骨情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 rhBMP-2/CS/DS復合微球觀察
掃描電鏡觀察示，制備的rhBMP-2/CS/DS復合微球球形較規整，分散較均勻，無團聚，微球表面較光滑（圖 1）。微球體外釋放rhBMP-2于2 h后出現1個突釋放期，2 d時釋放值達峰值，之后緩慢下降，釋放周期約20 d（圖 2）。
圖1
rhBMP-2/CS/DS復合微球掃描電鏡觀察（×50 k） 圖 2 rhBMP-2/CS/DS復合微球緩釋曲線
Figure1.
Scanning electron microscope observation of rhBMP-2/CS/DS microspheres (×50 k) Fig. 2 rhBMP-2 release profiles for rhBMP-2/CS/DS microspheres
2.2 植入實驗觀察
2.2.1 一般情況
術后各組大鼠均存活至實驗完成，大鼠活動、進食正常，切口愈合良好，無紅腫、滲液等。
2.2.2 micro-CT檢測及三維重建
術后各時間點，A、B組CT掃描均未見放射性顯影，三維重建未發現成骨。C、D組術后4周，可見少量模糊放射性顯影，密度較低，三維重建見少量骨組織形成；8周時，放射性顯影較4周增多，且密度稍高，三維重建可見一橢圓形骨組織塊；12、16周時，可見明顯大量蜂窩狀放射性顯影，骨截面邊緣密度較高，中央密度稍低，三維重建可見較多骨組織形成。各時間點兩組放射性顯影強度及三維重建骨組織均逐漸增加，且D組放射性顯影強度及三維重建骨體積均大于C組。見圖 3、4。
圖3
術后各時間點各組micro-CT觀察箭頭示放射性顯影從左至右分別為A、B、C、D組 ? 術后4周 ? 術后8周 ? 術后12周 ? 術后16周
Figure3.
Micro-CT observation of 4 groups at each time point after operation Arrow indicated the radioautography From left to right for groups A, B, C, and D ? At 4 weeks after operation ? At 8 weeks after operation ? At 12 weeks after operation ? At 16 weeks after operation
圖4
術后各時間點各組三維重建觀察從左至右分別為A、B、C、D組 ? 術后4周 ? 術后8周 ? 術后12周 ? 術后16周 圖 5術后各時間點C、D組骨組織參數 ? TMD ? BVF ? Tb.Th ? Tb.N ? BMD ? TMC
Figure4.
Three dimensional?reconstruction observation of ectopic bone formation at each time point after operation From left to right for groups A, B, C, and D ? At 4 weeks after operation ? At 8 weeks after operation ? At 12 weeks after operation ? At 16 weeks after operation Fig. 5 Bone tissue parameters of groups C and D at each time point after operation ? TMD ? BVF ? Tb.Th ? Tb.N ? BMD ? TMC
各時間點A、B組TMD、BVF、Tb.Th、Tb.N、BMD及TMC均為0。隨著時間延長，異位成骨形成，C、D組TMD、BVF、Tb.Th、BMD及TMC均呈總體增加趨勢，Tb.N 12周時達峰值、之后降低；各時間點與A、B組比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。C、D組間比較，4周時以上骨組織參數比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；8～16周時D組顯著高于C組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 5。
3 討論
本研究旨在通過異位成骨實驗來驗證rhBMP-2/CS/DS復合微球的成骨誘導效應。對于異位成骨觀測方法的選擇，有學者采用micro-CT掃描觀察硫醇化的CS支架負載BMP-2的異位成骨效果，并通過異位成骨掃描結果來分析骨增生情況[12]。micro-CT掃描具有無創性，已被廣泛用于定量測定骨三維微結構及組織工程骨[13-14]。我們認為與X線檢查相比，micro-CT掃描可更清晰觀察到異位成骨情況。而且micro-CT掃描獲得的斷層平面，通過Mimics軟件進行三維重建后，除能清楚顯示異位成骨情況外，還能測量相關骨組織參數，進行定量分析，結果具有較高的精確性。
本研究結果顯示：C、D組術后4周僅見少量模糊低密度放射性顯影，三維重建見少量骨組織，這可能是因為rhBMP-2從CS/DS微球釋放需要一定時間，故成骨效果較緩慢。隨著時間延長，C、D組放射性顯影強度和骨組織參數均逐漸增加，三維重建顯示有橢圓形骨塊形成且體積不斷增加，各時間點D組放射性顯影強度、骨塊體積均大于C組，與之對應的TMD、BVF、Tb.Th、Tb.N、BMD、TMC也顯著高于C組，提示存在異位成骨不斷增加的過程。但值得注意的是，從12周開始D組Tb.N逐漸減少，這可能與骨組織內部骨小梁逐漸吸收有關。另外，各時間點各組micro-CT掃描圖片顯示骨塊外層為高密度放射性顯影，而骨塊內層放射性顯影密度較低，這是由于外層骨組織逐漸塑形成為皮質骨導致。植入后異位新生骨從疏松骨小梁形成橢圓形組織塊，12周后內部Tb.N逐漸減少，外部鈣化加強，骨質改建，與檢測得到的TMC和TMD總體呈上升趨勢相吻合。Tb.Th持續增加則更加充分地說明了骨小梁的進一步改建。
綜上述，CS/DS載體負載rhBMP-2后的成骨誘導能力強于單獨rhBMP-2，這與rhBMP-2/CS/DS復合微球高載藥率結果[8]相互印證。分析原因可能是由于DS與BMP-2有肝素結合位點，能廣泛結合，且CS帶正電荷[15]、DS帶負電荷[16]，二者可以形成聚合物[15, 17]，CS/DS微球作為載體使rhBMP-2在動物體內緩釋時間延長，提高了蛋白的包封率和載藥率，從而提高rhBMP-2的成骨效能。結合前期實驗[18]得到的rhBMP-2/CS/DS復合微球無毒性，生物相容性良好，載藥率、包封率滿意的結論，以及與其他載體材料相比，具有制作簡便、成本較低等明顯優勢，提示rhBMP-2/CS/DS復合微球在骨組織工程領域具有較好的應用前景。
骨誘導是近年來骨缺損領域的研究熱點。1965年Urist首次發現BMP是具有單獨誘導成骨能力的細胞生長因子[1]，其中BMP-2誘導成骨能力最強[2-3]。目前研究已明確，BMP-2具有在動物體內誘導異位骨形成的作用[4-5]。但是BMP-2半衰期短，容易代謝流失，不能維持足夠濃度，通過緩釋載體技術可有效解決這一問題。研究表明，載藥微球具有能控制藥物釋放速度、降低藥物毒副作用、提高疏水性藥物對細胞膜的通透性、改善藥物的穩定性和改變給藥途徑、延長藥物療效以及靶向給藥等優點[6]。有學者用殼聚糖（chitosan，CS）載體包裹重組人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）制備了CS/rhBMP-2微球[7]，載藥率為（33.437±2.290）μg/mg，但實驗中發現CS載體與rhBMP-2黏附效果不佳。本課題組前期實驗在CS/rhBMP-2微球基礎上引入硫酸葡聚糖（dextran sulfate，DS），構建rhBMP-2/CS/DS復合微球，實驗顯示該復合微球細胞相容性較好，載藥率高，并初步顯示出良好的骨誘導效果[8]。異位成骨實驗已廣泛用于驗證BMP-2及BMP-2微球的骨誘導能力[9]，可有效避免原位宿主骨的干擾因素，是國際上檢測骨替代材料性能的常用評價手段[10-11]。為此，本次實驗選取SD大鼠進行異位成骨實驗，采用micro-CT掃描并行骨組織參數檢測，進一步分析探討rhBMP-2/CS/DS復合微球的異位成骨能力。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8周齡SPF級雄性SD大鼠48只，體質量140～160 g，由廣州軍區廣州總醫院動物實驗中心提供。CS（分子量為50 000～190 000、脫乙酰度85%）、DS（分子量為500 000、硫含量40%～50%）（Sigma公司，美國）；rhBMP-2（上海瑞邦生物材料有限公司）；ZnSO4（天津化學試劑公司）；NaOH（廣州化學試劑廠）；0.22μm、0.45μm濾過膜（Millipre公司，美國）；ALP試劑盒、鈣離子檢測試劑盒（南京建成生物技術有限公司）。
JB-2型恒溫磁力攪拌器（上海雷磁儀器廠）；DJ-300S型電子天平（SHINKO公司，日本）；LGZ-12型低溫負壓凍干機（北京松源華興儀器公司）；DUPONT0-RC5C型高速冷凍臺式離心機（Thermo Fisher公司，美國）；S-4800掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；micro-CT（GE公司，美國）；Mimics10.1軟件（Materalise公司，比利時）。
1.2 微球制備及觀測
1.2.1 CS/DS微球制備
取CS溶于0.175%乙酸中，配制成1 mg/mL CS溶液；用0.45μm和0.22?μm濾過膜依次過濾；取DS溶于雙蒸水，配置1?mg/mL DS溶液，用0.45μm和0.22μm濾過膜依次過濾。取0.2?mL DS溶液，加入0.12 mL CS溶液，在1?500?r/min轉速下攪拌5 min后，加入0.1 mL ZnSO4，繼續攪拌30 min，加入5%甘露醇后將微球移至離心管中；4℃，以離心半徑6 cm、15?000 r/min離心15 min，棄上清液；同上法離心3次后凍干。用3 000 Gy 60Co輻照消毒后，密封，4℃保存備用。
1.2.2 rhBMP-2/CS/DS復合微球制備
CS及DS溶液配制同1.2.1方法。取0.2 mL DS溶液加入0.04?mL rhBMP-2，在1?500 r/min轉速下攪拌20 min后，加入0.12 mL CS溶液，5 min后加入0.1 mL ZnSO4，繼續攪拌30 min，加入5%甘露醇后將微球移至離心管中；4℃，以離心半徑6 cm、15?000 r/min離心15 min，棄上清液；同上法離心3次后凍干。用3 000 Gy 60Co輻照消毒后，密封，4℃保存備用。
1.2.3 觀測指標
①掃描電鏡觀察：取rhBMP-2/CS/DS復合微球，用蒸餾水稀釋后均勻滴于載玻片上，冷凍干燥后掃描電鏡下觀察微球形態。②體外緩釋檢測：取rhBMP-2/CS/DS復合微球（n=3），按照ELISA法于2、6、12、18、24、48、72 h，之后每隔3?d檢測上清液中rhBMP-2含量，觀測終點為20 d，繪制緩釋曲線。
1.3 實驗分組及方法
將48只SD大鼠采用隨機數字表法分為A、B、C、D 4組（n=12）。4組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，于左后肢大腿作長約1.5 cm切口，制備股四頭肌肌袋模型。A、B、C、D組肌袋肌間隙中分別植入相同體積明膠海綿、CS/DS微球（粉末狀）、rhBMP-2（粉末狀，0.25 mg）、rhBMP-2/CS/DS復合微球（粉末狀，含rhBMP-2 0.25 mg），逐層縫合切口。術后分籠正常喂養，自由進食、飲水；3 d內每天腹腔注射青霉素（5 mg/kg）抗感染。
1.3.1 一般情況
術后觀察大鼠存活情況，以及并發癥（如切口感染、紅腫、滲液等）發生情況。
1.3.2 micro-CT檢測及三維重建
術后4、8、12、16周，各組分別取3只大鼠脫頸處死。按照原切口入路切取異位骨化組織塊行micro-CT掃描。掃描參數：掃描分辨率21μm，旋轉角度360°，旋轉角度增量0.4°，電壓80 kV，電流80μA，曝光時間3?000?ms，幀平均數為4，像素組合為1×1。掃描完成后，于micro-CT中檢測以下參數：組織骨密度（tissue mineral density，TMD）、骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）、皮質骨骨密度（bone mineral density，BMD）及組織礦含量（tissue mineral content，TMC）。然后，將CT掃描原始數據導入Mimics10.1軟件，進行三維重建，觀察各組異位成骨情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 rhBMP-2/CS/DS復合微球觀察
掃描電鏡觀察示，制備的rhBMP-2/CS/DS復合微球球形較規整，分散較均勻，無團聚，微球表面較光滑（圖 1）。微球體外釋放rhBMP-2于2 h后出現1個突釋放期，2 d時釋放值達峰值，之后緩慢下降，釋放周期約20 d（圖 2）。
圖1
rhBMP-2/CS/DS復合微球掃描電鏡觀察（×50 k） 圖 2 rhBMP-2/CS/DS復合微球緩釋曲線
Figure1.
Scanning electron microscope observation of rhBMP-2/CS/DS microspheres (×50 k) Fig. 2 rhBMP-2 release profiles for rhBMP-2/CS/DS microspheres
2.2 植入實驗觀察
2.2.1 一般情況
術后各組大鼠均存活至實驗完成，大鼠活動、進食正常，切口愈合良好，無紅腫、滲液等。
2.2.2 micro-CT檢測及三維重建
術后各時間點，A、B組CT掃描均未見放射性顯影，三維重建未發現成骨。C、D組術后4周，可見少量模糊放射性顯影，密度較低，三維重建見少量骨組織形成；8周時，放射性顯影較4周增多，且密度稍高，三維重建可見一橢圓形骨組織塊；12、16周時，可見明顯大量蜂窩狀放射性顯影，骨截面邊緣密度較高，中央密度稍低，三維重建可見較多骨組織形成。各時間點兩組放射性顯影強度及三維重建骨組織均逐漸增加，且D組放射性顯影強度及三維重建骨體積均大于C組。見圖 3、4。
圖3
術后各時間點各組micro-CT觀察箭頭示放射性顯影從左至右分別為A、B、C、D組 ? 術后4周 ? 術后8周 ? 術后12周 ? 術后16周
Figure3.
Micro-CT observation of 4 groups at each time point after operation Arrow indicated the radioautography From left to right for groups A, B, C, and D ? At 4 weeks after operation ? At 8 weeks after operation ? At 12 weeks after operation ? At 16 weeks after operation
圖4
術后各時間點各組三維重建觀察從左至右分別為A、B、C、D組 ? 術后4周 ? 術后8周 ? 術后12周 ? 術后16周 圖 5術后各時間點C、D組骨組織參數 ? TMD ? BVF ? Tb.Th ? Tb.N ? BMD ? TMC
Figure4.
Three dimensional?reconstruction observation of ectopic bone formation at each time point after operation From left to right for groups A, B, C, and D ? At 4 weeks after operation ? At 8 weeks after operation ? At 12 weeks after operation ? At 16 weeks after operation Fig. 5 Bone tissue parameters of groups C and D at each time point after operation ? TMD ? BVF ? Tb.Th ? Tb.N ? BMD ? TMC
各時間點A、B組TMD、BVF、Tb.Th、Tb.N、BMD及TMC均為0。隨著時間延長，異位成骨形成，C、D組TMD、BVF、Tb.Th、BMD及TMC均呈總體增加趨勢，Tb.N 12周時達峰值、之后降低；各時間點與A、B組比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。C、D組間比較，4周時以上骨組織參數比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；8～16周時D組顯著高于C組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 5。
3 討論
本研究旨在通過異位成骨實驗來驗證rhBMP-2/CS/DS復合微球的成骨誘導效應。對于異位成骨觀測方法的選擇，有學者采用micro-CT掃描觀察硫醇化的CS支架負載BMP-2的異位成骨效果，并通過異位成骨掃描結果來分析骨增生情況[12]。micro-CT掃描具有無創性，已被廣泛用于定量測定骨三維微結構及組織工程骨[13-14]。我們認為與X線檢查相比，micro-CT掃描可更清晰觀察到異位成骨情況。而且micro-CT掃描獲得的斷層平面，通過Mimics軟件進行三維重建后，除能清楚顯示異位成骨情況外，還能測量相關骨組織參數，進行定量分析，結果具有較高的精確性。
本研究結果顯示：C、D組術后4周僅見少量模糊低密度放射性顯影，三維重建見少量骨組織，這可能是因為rhBMP-2從CS/DS微球釋放需要一定時間，故成骨效果較緩慢。隨著時間延長，C、D組放射性顯影強度和骨組織參數均逐漸增加，三維重建顯示有橢圓形骨塊形成且體積不斷增加，各時間點D組放射性顯影強度、骨塊體積均大于C組，與之對應的TMD、BVF、Tb.Th、Tb.N、BMD、TMC也顯著高于C組，提示存在異位成骨不斷增加的過程。但值得注意的是，從12周開始D組Tb.N逐漸減少，這可能與骨組織內部骨小梁逐漸吸收有關。另外，各時間點各組micro-CT掃描圖片顯示骨塊外層為高密度放射性顯影，而骨塊內層放射性顯影密度較低，這是由于外層骨組織逐漸塑形成為皮質骨導致。植入后異位新生骨從疏松骨小梁形成橢圓形組織塊，12周后內部Tb.N逐漸減少，外部鈣化加強，骨質改建，與檢測得到的TMC和TMD總體呈上升趨勢相吻合。Tb.Th持續增加則更加充分地說明了骨小梁的進一步改建。
綜上述，CS/DS載體負載rhBMP-2后的成骨誘導能力強于單獨rhBMP-2，這與rhBMP-2/CS/DS復合微球高載藥率結果[8]相互印證。分析原因可能是由于DS與BMP-2有肝素結合位點，能廣泛結合，且CS帶正電荷[15]、DS帶負電荷[16]，二者可以形成聚合物[15, 17]，CS/DS微球作為載體使rhBMP-2在動物體內緩釋時間延長，提高了蛋白的包封率和載藥率，從而提高rhBMP-2的成骨效能。結合前期實驗[18]得到的rhBMP-2/CS/DS復合微球無毒性，生物相容性良好，載藥率、包封率滿意的結論，以及與其他載體材料相比，具有制作簡便、成本較低等明顯優勢，提示rhBMP-2/CS/DS復合微球在骨組織工程領域具有較好的應用前景。
