引用本文： 王淼, 王南, 權正學, 羅小輯. Hey1表達對BMP-9誘導下C3H10T1/2細胞的成骨分化及增殖影響. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(3): 279-285. doi: 10.7507/1002-1892.20160056 復制
干細胞成骨分化的研究一直是骨組織工程關注熱點。目前普遍認為，干細胞成骨分化是一系列基因精細調控的結果[1-2]。其中，BMP是公認的能夠誘導干細胞異位成骨的細胞因子[3-7]，但其誘導干細胞成骨分化的機制未完全闡明。而且即使使用成骨誘導活性最強的BMP-2、6、7、9等細胞因子誘導干細胞，除成骨分化外，也存在成脂肪、肌肉、軟骨分化可能[8]。本課題組前期實驗表明，Notch信號通路的關鍵靶點之一Hey1基因可能在BMP-9誘導干細胞成骨分化過程中起到重要作用[9]。Lavery等[10]也報道BMP-7誘導干細胞成骨分化部分依賴Hey1基因的表達。已有研究證實Notch信號通路對干細胞的成骨分化具有抑制和誘導雙重作用[11]，但對Hey1基因在干細胞成骨分化中的作用及機制卻未明確[12]。因此，本研究通過慢病毒感染方式改變鼠成纖維細胞C3H10T1/2細胞的Hey1基因表達水平，并建立穩定的細胞系，用BMP-9腺病毒制備含有BMP-9的條件培養基誘導上述細胞，觀察Hey1基因表達水平改變對BMP-9誘導C3H10T1/2細胞增殖和成骨分化的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
慢病毒包裝四質粒系統（pGLV5-H1-GFP-Puro、PG-P1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE；上海吉瑪制藥技術有限公司）；鼠成纖維細胞C3H10T1/2細胞、結腸癌細胞株HCT116、293T細胞（中國科學院上海細胞庫）；Ad-BMP-9、Ad-GFP（重慶醫科大學分子生物實驗室）；SYBR Green RT-PCR Kit、PrimeSTARTM HS DNA聚合酶、BamHⅠ、NotⅠ（Takara公司，日本）；質粒小量抽提試劑盒（Promega公司，美國）；制備感受態試劑盒（BIOSCIENCES公司，美國）；DMEM培養基、FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；ELISA、MTT試劑盒、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、DEPC（Sigma公司，美國）；BCA蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；Hey1、Runx2、骨橋蛋白、骨鈣素一抗（Abcam公司、美國）；GAPDH（小鼠來源）、預染蛋白Marker（南京金斯瑞生物科技有限公司）；ALP染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）。
FTC-2000實時熒光定量PCR儀（Funglyn Biotech公司，加拿大）；低溫高速離心機（Beckman公司，美國）；熒光倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；垂直板電泳轉移裝置、電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Tek公司，美國）；流式細胞儀（Becton Dickinson公司，美國）。
1.2 慢病毒的構建及包裝
參考美國國立生物技術信息中心（NCBI）的Hey1基因序列（NM_010423.2），通過Primer5.0設計引物：上游，5' -GATTGGCGGCCGCGCCACCATGAAGAG-A-3' ；下游，5' -GTATGGGATCCTTAGAA-AGCTCCGATCTCTGTCC-3' 。PCR擴增Hey1編碼序列（上海生工生物工程技術有限公司），利用Agarose電泳并切膠回收Hey1基因片段。NotⅠ和BamHⅠ酶切Hey1基因片段并線性化pGLV5-H1-GFP-Puro質粒，T4 DNA ligase連接雙酶切得到的Hey1基因片段和線性化質粒，22℃連接2 h后得到LV-Hey1，將連接產物轉化細菌感受態細胞，對長出的克隆進行雙酶切鑒定并進行對比測序（上海生工生物工程技術有限公司）。鑒定無誤后大量質粒抽提，與其他3種輔助包裝質粒PG-P1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE共感染293T細胞，感染后8 h更換為完全培養基，繼續培養48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，對其濃縮后得到慢病毒濃縮液；取濃縮液感染293T細胞，采用倍比稀釋法檢測病毒滴度。根據Hey1基因序列設計第347位點為干涉位點，干擾片段序列長21 bp，序列為5' -GCCGACGAGACCGAATCAATA-3' 。同上法構建LV-shHey1與LV-Blank（空質粒）并包裝獲得病毒。
1.3 慢病毒感染C3H10T1/2細胞及不同Hey1表達水平細胞系的建立
將C3H10T1/2細胞用含10%FBS、100 mmol/L青霉素及100 g/L鏈霉素的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱培養。然后接種于24孔板，每孔3×104個細胞，鋪板時細胞融合約50%。每孔加入含10%FBS的DMEM完全培養基，置于37℃、5%CO2培養箱培養，2 d后待細胞融合約70%時進行病毒感染。以感染復數20為標準，依據病毒滴度計算LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank合適感染量，分別以相應的病毒量感染C3H10T1/2細胞（C3H10T1/2-Hey1組、C3H10T1/2-shHey1組、C3H10T1/2-Blank組），24?h后將含有慢病毒的培養液更換成正常培養液繼續培養。48 h后取細胞行熒光顯微鏡觀察慢病毒感染效果，采用實時熒光定量PCR（基因引物序列見表 1）以及Western blot對Hey1表達水平進行驗證，并以正常C3H10T1/2細胞作為正常對照（C3H10T1/2組）。證實干預Hey1表達水平成功后，采用含4?μg/mL嘌呤霉素的新鮮培養基篩選穩定細胞系用于后續實驗。
表1
實時熒光定量PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of target genes for real-time fluorescence quantitative PCR
1.4 實驗分組及方法
參照本課題組方法[13]制備含BMP-9的條件培養基，將培養基以離心半徑20 cm、800 r/min離心5 min后，收集上清，4℃保存備用。根據細胞及培養方法不同，將實驗分為5組，其中C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組為正常培養基培養C3H10T1/2細胞及C3H10T1/2-Blank感染細胞；BMP-9+ C3H10T1/2組、BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1組為含BMP-9的條件培養基培養C3H10T1/2細胞、C3H10T1/2-Hey1感染細胞及C3H10T1/2-shHey1感染細胞。
1.5 觀測指標
1.5.1 實時熒光定量PCR檢測成骨分化相關轉錄因子mRNA表達水平
取各組細胞接種于24孔板，每孔2×104個，按分組以對應培養基培養48 h后，每孔加入Trizol試劑400μL，按說明書步驟提取目的細胞總RNA；Runx2、骨橋蛋白、骨鈣素及內參GAPDH引物序列見表 1，引物合成由上海生工生物工程技術有限公司完成。使用SYBR Green RT-PCR Kit進行20.0μL逆轉錄體系反應，25℃、10?min，42℃、50 min，85℃、5 min；然后取2.0?μL cDNA產物，以2×PCR buffer 25.0μL、Primers（25 pmol/μL）2.0?μL、SYBR Green 0.5μL、cDNA 2.0?μL、DEPC 20.5μL共50?μL反應體系進行熒光定量PCR擴增，條件為：94℃、4 min，94℃、20 s，60℃、30?s，72℃、30 s，循環35次。按照2-ΔΔCt法計算相關轉錄因子mRNA相對表達量。實驗重復3次。
1.5.2 Western blot檢測成骨分化相關轉錄因子蛋白表達水平
各組細胞同1.5.1方法培養48 h后，去除培養基，PBS洗1遍；懸浮細胞，以離心半徑20?cm、800 r/min離心5 min，收集細胞，PBS洗1遍。按BCA蛋白定量提取試劑盒說明提取總蛋白。BCA法測定細胞蛋白濃度；取50μg總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳；電泳結束后轉移至聚偏氟乙烯膜，經脫脂奶粉封閉后，加入至稀釋的兔抗鼠Runx2、骨橋蛋白、骨鈣素及GAPDH一抗工作液（1:500）中，4℃過夜，漂洗后轉入稀釋的羊抗兔二抗工作液（1:1?000）中，室溫孵育4 h；化學發光試劑ECL顯色后，拍照并測定內參蛋白及待測蛋白條帶的吸光度（A）值，以待測蛋白與內參蛋白A值比值作為其相對表達量。
1.5.3 MTT測定細胞增殖能力
取各組細胞接種于96孔板，每孔5×103個，按分組以對應培養基培養，4、5、6、7 d各組取3孔，每孔加入20μL 5?mg/mL MTT溶液，4 h后棄培養基，每孔加入DMSO 100?μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量A值，間接反映活細胞數量與增殖能力。
1.5.4 流式細胞儀測定細胞周期
取各組細胞同1.5.3方法培養4、5、10 d，分別收集細胞，用75%冰乙醇于4℃冰箱固定過夜。然后棄冰乙醇，用預冷PBS充分混勻洗滌2次，加入0.01%RNase和0.5% PI，4℃避光孵育15 min后，在流式細胞儀488?nm波長下測定DNA含量，PI所發的紅光通過630?nm的濾光片進行收集，采用CELLQest軟件進行分析，獲得細胞周期各時期百分比，計算G2+S期百分比。
1.5.5 成骨分化標志ALP的測定
取各組細胞同1.5.3方法培養4、7 d，將細胞用PBS（pH7.2～7.4）稀釋，細胞濃度達1×106個/mL。反復凍融細胞，使其釋放出細胞內成分。以離心半徑20 cm、2 000～3?000 r/min離心20 min，收集上清，ELISA法測定ALP含量[2]。同時，取細胞采用ALP染色試劑盒，按說明操作對細胞進行染色觀察。
1.6 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 慢病毒感染C3H10T1/2細胞觀察
通過倍比稀釋法測得LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank病毒滴度分別為1×108、7×108、3×108?TU/mL。經計算LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank的合適感染量分別為10、1、3μL。熒光顯微鏡觀察示，LV-Hey1、LV-shHe y 1、LV-Blank均成功感染C3H10T1/2細胞，感染率達90%以上（圖 1）。
圖1
熒光顯微鏡下觀察經不同慢病毒感染48 h的C3H10T1/2細胞（×100） ? C3H10T1/2-Blank組 ? C3H10T1/2-Hey1組 ? C3H10T1/2-shHey1組 圖 2 Western blot檢測不同Hey1表達水平細胞系Hey1蛋白表達Mr：相對分子質量1：C3H10T1/2組2：C3H10T1/2-Blank組3：C3H10T1/2-Hey1組4：C3H10T1/2-shHey1組 圖 3 Western blot檢測各組成骨分化相關轉錄因子蛋白表達Mr：相對分子質量1：C3H10T1/2組2：C3H10T1/2-Blank組3：BMP-9+C3H10T1/2組4：BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組5：BMP-9+ C3H10T1/2-shHey1組 圖 4 MTT檢測誘導培養不同時間點各組A值 圖 5流式細胞儀檢測誘導培養不同時間點各組細胞G2+S期百分比 圖 6 ELISA檢測誘導培養4、7 d各組ALP含量
Figure1.
Observation of infected C3H10T1/2 cells under fluorescence microscope after 48 hours (×100) ? C3H10T1/2-Blank group ? C3H10T1/2-Hey1 group ? C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 2 Hey1 expression level of C3H10T1/2 cell lines with different Hey1 expression levels by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: C3H10T1/2 group 2: C3H10T1/2-Blank group 3: C3H10T1/2-Hey1 group 4: C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 3 Expression levels of transcription factors by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: C3H10T1/2 group 2: C3H10T1/2-Blank group 3: BMP-9+C3H10T1/2 group 4: BMP-9+C3H10T1/2-Hey1 group 5: BMP-9+C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 4 A values of different groups at different time points by MTT assay Fig. 5 Percentage of G2+S cells of different groups at different time points by flow cytometer Fig. 6 ALP activity of different groups at 4 and 7 days by ELISA
實時熒光定量PCR測定C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組、C3H10T1/2-Hey1組、C3H10T1/2-shHey1組Hey1 mRNA相對表達量分別為1.038±0.061、0.965±0.085、2.658±0.569、0.291±0.027；Western blot檢測Hey1蛋白相對表達量分別為0.506±0.014、0.512±0.001、0.821±0.042、0.106±0.021（圖 2）。除C3H10T1/2組Hey1 mRNA及蛋白相對表達量與C3H10T1/2-Blank組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。提示成功建立不同Hey1表達水平的穩定細胞系。
2.2 Hey1表達水平改變對成骨分化相關轉錄因子的影響
2.2.1 實時熒光定量PCR檢測
培養48 h，除C3H10T1/2組與C3H10T1/2-Blank組Runx2、骨橋蛋白、骨鈣素mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
實時熒光定量PCR檢測各組成骨分化相關轉錄因子mRNA相對表達量（n=3，2.2.2 Western blot檢測
培養48 h，除C3H10T1/2組與C3H10T1/2-Blank組Runx2、骨橋蛋白、骨鈣素蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 3、圖 3。
表3
Western blot檢測各組成骨分化相關轉錄因子蛋白相對表達量（n=3，2.3 Hey1表達水平改變對細胞增殖能力的影響
MTT檢測顯示，4 d各組A值比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；5、6、7 d C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組、BMP-9+C3H10T1/2組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），而BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組及BMP-9+C3H10T1/2-shHey1組間比較，以及分別與以上3組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
流式細胞儀檢測，4、5、10 d，BMP-9+ C3H10T1/2-Hey1組細胞G2+S期百分比較其余各組顯著升高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。5、10?d時，BMP-9+C3H10T1/2-shHey1組較C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組、BMP-9+C3H10T1/2組顯著降低，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 5。
2.4 Hey1表達水平改變對成骨分化標志物ALP的影響
ELISA檢測示，4、7 d時，BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組細胞ALP含量顯著高于其余各組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1組組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；BMP-9+C3H10T1/2組顯著高于上述3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 6。
ALP染色鏡下觀察示，4、7 d，BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組染色最深，C3H10T1/2組及C3H10T1/2-shHey1組染色無明顯差異，均較BMP-9+C3H10T1/2組染色淺。見圖 7。
圖7
誘導培養4、7 d各組ALP染色觀察（×100）從左至右分別為C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組、BMP-9+C3H10T1/2組、BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1組 ? 培養4 d ? 培養7 d
Figure7.
ALP staining observation of different groups at 4 and 7 days (×100) From left to right for C3H10T1/2 group, C3H10T1/2-Blank group, BMP-9+C3H10T1/2 group, BMP-9+C3H10T1/2-Hey1 group, and BMP-9+C3H10T1/2-shHey1 group, respectively ? At 4 days ? At 7 days
3 討論
Notch信號通路作為高度保守的信號轉導通路，對細胞分化起關鍵作用。通過Notch受體的信號傳遞能夠擴大并固化相鄰細胞之間的分子差異，最終決定細胞的分化方向[14]。Tezuka等[15]對MC3T3-E1細胞及C3H10T1/2細胞通過腺病毒感染方式增強Notch信號通路上游蛋白Notch1 CD表達，觀察到顯著增加的鈣結節形成效應以及成骨分化，并且抑制了上述細胞的成脂分化，說明Notch信號的增強有助于成骨分化。而作為Notch信號通路下游關鍵靶點分子Hey1，其表達具有激活成骨分化關鍵轉錄因子Runx2的效應[16]。Suh等[17]對MC3T3-E1細胞成骨分化過程行Chip分析，發現Hey1分子通過增強Runx2蛋白穩定性的方式增加Runx2的轉錄活性，進而促進成骨分化。本研究我們發現，在BMP-9誘導下的C3H10T1/2細胞過表達Hey1也能顯著促進Runx2的轉錄活性，并且通過比較成骨分化早期標志物ALP活性發現增強了成骨分化的效應。已有研究表明，Notch信號通路參與BMP誘導的干細胞成骨分化，如在BMP-2誘導MC3T3-E1等細胞成骨分化研究中，證實Notch信號通路與BMP-2存在促成骨分化協同作用[18-20]。本研究中，我們通過對成骨分化相關轉錄因子骨橋蛋白、骨鈣素及早期成骨分化標志物ALP的檢測，也發現Notch信號通路與BMP-9存在促成骨分化的協同作用。
此外，我們發現抑制Hey1表達，對BMP-9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化產生明顯的拮抗效應，Runx2、骨橋蛋白表達及ALP分泌顯著下降。其中Runx2、骨橋蛋白的表達量甚至低于無BMP-9誘導的正常C3H10T1/2細胞，但骨鈣素的表達卻仍高于C3H10T1/2細胞。結合之前報道[21] Runx2高表達在BMP-9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化中會抑制骨鈣素的表達，提示Hey1分子與Runx2、骨鈣素之間可能存在調控回路，需要進一步研究。MTT檢測發現，Hey1的過表達與抑制，對BMP-9誘導下的C3H10T1/2細胞增殖分別存在促進和抑制效應，但通過流式周期進一步分析發現隨著時間延長，過表達Hey1帶來的促增殖效應減弱，與之前的研究報道一致[22]。結合Salie等[23]的體內實驗結果，Hey1敲除小鼠與Hey1高表達小鼠均呈嚴重骨質疏松，其中Hey1過表達導致成骨細胞減少，而Hey1敲除造成顯著的破骨細胞生成。提示Hey1表達水平對成骨的最終效應起著重要平衡作用。結合以上報道，我們認為Hey1表達水平影響BMP-9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化的最終效應還應取決于細胞增殖與分化的平衡，但該結論需要更長時間的檢測以及體內實驗驗證，這也是本研究不足之一。
綜上述，Hey1作為Notch信號通路的關鍵下游分子，參與BMP-9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化過程，與BMP-9誘導成骨分化存在協同效應，并且對細胞早期增殖有重要影響，為進一步闡明BMP誘導干細胞成骨分化過程的機制以及Hey1基因在干細胞成骨分化中的作用奠定了基礎。
干細胞成骨分化的研究一直是骨組織工程關注熱點。目前普遍認為，干細胞成骨分化是一系列基因精細調控的結果[1-2]。其中，BMP是公認的能夠誘導干細胞異位成骨的細胞因子[3-7]，但其誘導干細胞成骨分化的機制未完全闡明。而且即使使用成骨誘導活性最強的BMP-2、6、7、9等細胞因子誘導干細胞，除成骨分化外，也存在成脂肪、肌肉、軟骨分化可能[8]。本課題組前期實驗表明，Notch信號通路的關鍵靶點之一Hey1基因可能在BMP-9誘導干細胞成骨分化過程中起到重要作用[9]。Lavery等[10]也報道BMP-7誘導干細胞成骨分化部分依賴Hey1基因的表達。已有研究證實Notch信號通路對干細胞的成骨分化具有抑制和誘導雙重作用[11]，但對Hey1基因在干細胞成骨分化中的作用及機制卻未明確[12]。因此，本研究通過慢病毒感染方式改變鼠成纖維細胞C3H10T1/2細胞的Hey1基因表達水平，并建立穩定的細胞系，用BMP-9腺病毒制備含有BMP-9的條件培養基誘導上述細胞，觀察Hey1基因表達水平改變對BMP-9誘導C3H10T1/2細胞增殖和成骨分化的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
慢病毒包裝四質粒系統（pGLV5-H1-GFP-Puro、PG-P1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE；上海吉瑪制藥技術有限公司）；鼠成纖維細胞C3H10T1/2細胞、結腸癌細胞株HCT116、293T細胞（中國科學院上海細胞庫）；Ad-BMP-9、Ad-GFP（重慶醫科大學分子生物實驗室）；SYBR Green RT-PCR Kit、PrimeSTARTM HS DNA聚合酶、BamHⅠ、NotⅠ（Takara公司，日本）；質粒小量抽提試劑盒（Promega公司，美國）；制備感受態試劑盒（BIOSCIENCES公司，美國）；DMEM培養基、FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；ELISA、MTT試劑盒、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、DEPC（Sigma公司，美國）；BCA蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；Hey1、Runx2、骨橋蛋白、骨鈣素一抗（Abcam公司、美國）；GAPDH（小鼠來源）、預染蛋白Marker（南京金斯瑞生物科技有限公司）；ALP染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）。
FTC-2000實時熒光定量PCR儀（Funglyn Biotech公司，加拿大）；低溫高速離心機（Beckman公司，美國）；熒光倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；垂直板電泳轉移裝置、電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Tek公司，美國）；流式細胞儀（Becton Dickinson公司，美國）。
1.2 慢病毒的構建及包裝
參考美國國立生物技術信息中心（NCBI）的Hey1基因序列（NM_010423.2），通過Primer5.0設計引物：上游，5' -GATTGGCGGCCGCGCCACCATGAAGAG-A-3' ；下游，5' -GTATGGGATCCTTAGAA-AGCTCCGATCTCTGTCC-3' 。PCR擴增Hey1編碼序列（上海生工生物工程技術有限公司），利用Agarose電泳并切膠回收Hey1基因片段。NotⅠ和BamHⅠ酶切Hey1基因片段并線性化pGLV5-H1-GFP-Puro質粒，T4 DNA ligase連接雙酶切得到的Hey1基因片段和線性化質粒，22℃連接2 h后得到LV-Hey1，將連接產物轉化細菌感受態細胞，對長出的克隆進行雙酶切鑒定并進行對比測序（上海生工生物工程技術有限公司）。鑒定無誤后大量質粒抽提，與其他3種輔助包裝質粒PG-P1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE共感染293T細胞，感染后8 h更換為完全培養基，繼續培養48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，對其濃縮后得到慢病毒濃縮液；取濃縮液感染293T細胞，采用倍比稀釋法檢測病毒滴度。根據Hey1基因序列設計第347位點為干涉位點，干擾片段序列長21 bp，序列為5' -GCCGACGAGACCGAATCAATA-3' 。同上法構建LV-shHey1與LV-Blank（空質粒）并包裝獲得病毒。
1.3 慢病毒感染C3H10T1/2細胞及不同Hey1表達水平細胞系的建立
將C3H10T1/2細胞用含10%FBS、100 mmol/L青霉素及100 g/L鏈霉素的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱培養。然后接種于24孔板，每孔3×104個細胞，鋪板時細胞融合約50%。每孔加入含10%FBS的DMEM完全培養基，置于37℃、5%CO2培養箱培養，2 d后待細胞融合約70%時進行病毒感染。以感染復數20為標準，依據病毒滴度計算LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank合適感染量，分別以相應的病毒量感染C3H10T1/2細胞（C3H10T1/2-Hey1組、C3H10T1/2-shHey1組、C3H10T1/2-Blank組），24?h后將含有慢病毒的培養液更換成正常培養液繼續培養。48 h后取細胞行熒光顯微鏡觀察慢病毒感染效果，采用實時熒光定量PCR（基因引物序列見表 1）以及Western blot對Hey1表達水平進行驗證，并以正常C3H10T1/2細胞作為正常對照（C3H10T1/2組）。證實干預Hey1表達水平成功后，采用含4?μg/mL嘌呤霉素的新鮮培養基篩選穩定細胞系用于后續實驗。
表1
實時熒光定量PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of target genes for real-time fluorescence quantitative PCR
1.4 實驗分組及方法
參照本課題組方法[13]制備含BMP-9的條件培養基，將培養基以離心半徑20 cm、800 r/min離心5 min后，收集上清，4℃保存備用。根據細胞及培養方法不同，將實驗分為5組，其中C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組為正常培養基培養C3H10T1/2細胞及C3H10T1/2-Blank感染細胞；BMP-9+ C3H10T1/2組、BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1組為含BMP-9的條件培養基培養C3H10T1/2細胞、C3H10T1/2-Hey1感染細胞及C3H10T1/2-shHey1感染細胞。
1.5 觀測指標
1.5.1 實時熒光定量PCR檢測成骨分化相關轉錄因子mRNA表達水平
取各組細胞接種于24孔板，每孔2×104個，按分組以對應培養基培養48 h后，每孔加入Trizol試劑400μL，按說明書步驟提取目的細胞總RNA；Runx2、骨橋蛋白、骨鈣素及內參GAPDH引物序列見表 1，引物合成由上海生工生物工程技術有限公司完成。使用SYBR Green RT-PCR Kit進行20.0μL逆轉錄體系反應，25℃、10?min，42℃、50 min，85℃、5 min；然后取2.0?μL cDNA產物，以2×PCR buffer 25.0μL、Primers（25 pmol/μL）2.0?μL、SYBR Green 0.5μL、cDNA 2.0?μL、DEPC 20.5μL共50?μL反應體系進行熒光定量PCR擴增，條件為：94℃、4 min，94℃、20 s，60℃、30?s，72℃、30 s，循環35次。按照2-ΔΔCt法計算相關轉錄因子mRNA相對表達量。實驗重復3次。
1.5.2 Western blot檢測成骨分化相關轉錄因子蛋白表達水平
各組細胞同1.5.1方法培養48 h后，去除培養基，PBS洗1遍；懸浮細胞，以離心半徑20?cm、800 r/min離心5 min，收集細胞，PBS洗1遍。按BCA蛋白定量提取試劑盒說明提取總蛋白。BCA法測定細胞蛋白濃度；取50μg總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳；電泳結束后轉移至聚偏氟乙烯膜，經脫脂奶粉封閉后，加入至稀釋的兔抗鼠Runx2、骨橋蛋白、骨鈣素及GAPDH一抗工作液（1:500）中，4℃過夜，漂洗后轉入稀釋的羊抗兔二抗工作液（1:1?000）中，室溫孵育4 h；化學發光試劑ECL顯色后，拍照并測定內參蛋白及待測蛋白條帶的吸光度（A）值，以待測蛋白與內參蛋白A值比值作為其相對表達量。
1.5.3 MTT測定細胞增殖能力
取各組細胞接種于96孔板，每孔5×103個，按分組以對應培養基培養，4、5、6、7 d各組取3孔，每孔加入20μL 5?mg/mL MTT溶液，4 h后棄培養基，每孔加入DMSO 100?μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量A值，間接反映活細胞數量與增殖能力。
1.5.4 流式細胞儀測定細胞周期
取各組細胞同1.5.3方法培養4、5、10 d，分別收集細胞，用75%冰乙醇于4℃冰箱固定過夜。然后棄冰乙醇，用預冷PBS充分混勻洗滌2次，加入0.01%RNase和0.5% PI，4℃避光孵育15 min后，在流式細胞儀488?nm波長下測定DNA含量，PI所發的紅光通過630?nm的濾光片進行收集，采用CELLQest軟件進行分析，獲得細胞周期各時期百分比，計算G2+S期百分比。
1.5.5 成骨分化標志ALP的測定
取各組細胞同1.5.3方法培養4、7 d，將細胞用PBS（pH7.2～7.4）稀釋，細胞濃度達1×106個/mL。反復凍融細胞，使其釋放出細胞內成分。以離心半徑20 cm、2 000～3?000 r/min離心20 min，收集上清，ELISA法測定ALP含量[2]。同時，取細胞采用ALP染色試劑盒，按說明操作對細胞進行染色觀察。
1.6 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 慢病毒感染C3H10T1/2細胞觀察
通過倍比稀釋法測得LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank病毒滴度分別為1×108、7×108、3×108?TU/mL。經計算LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank的合適感染量分別為10、1、3μL。熒光顯微鏡觀察示，LV-Hey1、LV-shHe y 1、LV-Blank均成功感染C3H10T1/2細胞，感染率達90%以上（圖 1）。
圖1
熒光顯微鏡下觀察經不同慢病毒感染48 h的C3H10T1/2細胞（×100） ? C3H10T1/2-Blank組 ? C3H10T1/2-Hey1組 ? C3H10T1/2-shHey1組 圖 2 Western blot檢測不同Hey1表達水平細胞系Hey1蛋白表達Mr：相對分子質量1：C3H10T1/2組2：C3H10T1/2-Blank組3：C3H10T1/2-Hey1組4：C3H10T1/2-shHey1組 圖 3 Western blot檢測各組成骨分化相關轉錄因子蛋白表達Mr：相對分子質量1：C3H10T1/2組2：C3H10T1/2-Blank組3：BMP-9+C3H10T1/2組4：BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組5：BMP-9+ C3H10T1/2-shHey1組 圖 4 MTT檢測誘導培養不同時間點各組A值 圖 5流式細胞儀檢測誘導培養不同時間點各組細胞G2+S期百分比 圖 6 ELISA檢測誘導培養4、7 d各組ALP含量
Figure1.
Observation of infected C3H10T1/2 cells under fluorescence microscope after 48 hours (×100) ? C3H10T1/2-Blank group ? C3H10T1/2-Hey1 group ? C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 2 Hey1 expression level of C3H10T1/2 cell lines with different Hey1 expression levels by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: C3H10T1/2 group 2: C3H10T1/2-Blank group 3: C3H10T1/2-Hey1 group 4: C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 3 Expression levels of transcription factors by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: C3H10T1/2 group 2: C3H10T1/2-Blank group 3: BMP-9+C3H10T1/2 group 4: BMP-9+C3H10T1/2-Hey1 group 5: BMP-9+C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 4 A values of different groups at different time points by MTT assay Fig. 5 Percentage of G2+S cells of different groups at different time points by flow cytometer Fig. 6 ALP activity of different groups at 4 and 7 days by ELISA
實時熒光定量PCR測定C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組、C3H10T1/2-Hey1組、C3H10T1/2-shHey1組Hey1 mRNA相對表達量分別為1.038±0.061、0.965±0.085、2.658±0.569、0.291±0.027；Western blot檢測Hey1蛋白相對表達量分別為0.506±0.014、0.512±0.001、0.821±0.042、0.106±0.021（圖 2）。除C3H10T1/2組Hey1 mRNA及蛋白相對表達量與C3H10T1/2-Blank組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。提示成功建立不同Hey1表達水平的穩定細胞系。
2.2 Hey1表達水平改變對成骨分化相關轉錄因子的影響
2.2.1 實時熒光定量PCR檢測
培養48 h，除C3H10T1/2組與C3H10T1/2-Blank組Runx2、骨橋蛋白、骨鈣素mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
實時熒光定量PCR檢測各組成骨分化相關轉錄因子mRNA相對表達量（n=3，2.2.2 Western blot檢測
培養48 h，除C3H10T1/2組與C3H10T1/2-Blank組Runx2、骨橋蛋白、骨鈣素蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 3、圖 3。
表3
Western blot檢測各組成骨分化相關轉錄因子蛋白相對表達量（n=3，2.3 Hey1表達水平改變對細胞增殖能力的影響
MTT檢測顯示，4 d各組A值比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；5、6、7 d C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組、BMP-9+C3H10T1/2組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），而BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組及BMP-9+C3H10T1/2-shHey1組間比較，以及分別與以上3組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
流式細胞儀檢測，4、5、10 d，BMP-9+ C3H10T1/2-Hey1組細胞G2+S期百分比較其余各組顯著升高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。5、10?d時，BMP-9+C3H10T1/2-shHey1組較C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組、BMP-9+C3H10T1/2組顯著降低，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 5。
2.4 Hey1表達水平改變對成骨分化標志物ALP的影響
ELISA檢測示，4、7 d時，BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組細胞ALP含量顯著高于其余各組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1組組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；BMP-9+C3H10T1/2組顯著高于上述3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 6。
ALP染色鏡下觀察示，4、7 d，BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組染色最深，C3H10T1/2組及C3H10T1/2-shHey1組染色無明顯差異，均較BMP-9+C3H10T1/2組染色淺。見圖 7。
圖7
誘導培養4、7 d各組ALP染色觀察（×100）從左至右分別為C3H10T1/2組、C3H10T1/2-Blank組、BMP-9+C3H10T1/2組、BMP-9+C3H10T1/2-Hey1組、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1組 ? 培養4 d ? 培養7 d
Figure7.
ALP staining observation of different groups at 4 and 7 days (×100) From left to right for C3H10T1/2 group, C3H10T1/2-Blank group, BMP-9+C3H10T1/2 group, BMP-9+C3H10T1/2-Hey1 group, and BMP-9+C3H10T1/2-shHey1 group, respectively ? At 4 days ? At 7 days
3 討論
Notch信號通路作為高度保守的信號轉導通路，對細胞分化起關鍵作用。通過Notch受體的信號傳遞能夠擴大并固化相鄰細胞之間的分子差異，最終決定細胞的分化方向[14]。Tezuka等[15]對MC3T3-E1細胞及C3H10T1/2細胞通過腺病毒感染方式增強Notch信號通路上游蛋白Notch1 CD表達，觀察到顯著增加的鈣結節形成效應以及成骨分化，并且抑制了上述細胞的成脂分化，說明Notch信號的增強有助于成骨分化。而作為Notch信號通路下游關鍵靶點分子Hey1，其表達具有激活成骨分化關鍵轉錄因子Runx2的效應[16]。Suh等[17]對MC3T3-E1細胞成骨分化過程行Chip分析，發現Hey1分子通過增強Runx2蛋白穩定性的方式增加Runx2的轉錄活性，進而促進成骨分化。本研究我們發現，在BMP-9誘導下的C3H10T1/2細胞過表達Hey1也能顯著促進Runx2的轉錄活性，并且通過比較成骨分化早期標志物ALP活性發現增強了成骨分化的效應。已有研究表明，Notch信號通路參與BMP誘導的干細胞成骨分化，如在BMP-2誘導MC3T3-E1等細胞成骨分化研究中，證實Notch信號通路與BMP-2存在促成骨分化協同作用[18-20]。本研究中，我們通過對成骨分化相關轉錄因子骨橋蛋白、骨鈣素及早期成骨分化標志物ALP的檢測，也發現Notch信號通路與BMP-9存在促成骨分化的協同作用。
此外，我們發現抑制Hey1表達，對BMP-9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化產生明顯的拮抗效應，Runx2、骨橋蛋白表達及ALP分泌顯著下降。其中Runx2、骨橋蛋白的表達量甚至低于無BMP-9誘導的正常C3H10T1/2細胞，但骨鈣素的表達卻仍高于C3H10T1/2細胞。結合之前報道[21] Runx2高表達在BMP-9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化中會抑制骨鈣素的表達，提示Hey1分子與Runx2、骨鈣素之間可能存在調控回路，需要進一步研究。MTT檢測發現，Hey1的過表達與抑制，對BMP-9誘導下的C3H10T1/2細胞增殖分別存在促進和抑制效應，但通過流式周期進一步分析發現隨著時間延長，過表達Hey1帶來的促增殖效應減弱，與之前的研究報道一致[22]。結合Salie等[23]的體內實驗結果，Hey1敲除小鼠與Hey1高表達小鼠均呈嚴重骨質疏松，其中Hey1過表達導致成骨細胞減少，而Hey1敲除造成顯著的破骨細胞生成。提示Hey1表達水平對成骨的最終效應起著重要平衡作用。結合以上報道，我們認為Hey1表達水平影響BMP-9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化的最終效應還應取決于細胞增殖與分化的平衡，但該結論需要更長時間的檢測以及體內實驗驗證，這也是本研究不足之一。
綜上述，Hey1作為Notch信號通路的關鍵下游分子，參與BMP-9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化過程，與BMP-9誘導成骨分化存在協同效應，并且對細胞早期增殖有重要影響，為進一步闡明BMP誘導干細胞成骨分化過程的機制以及Hey1基因在干細胞成骨分化中的作用奠定了基礎。
