引用本文： 侯楠, 馬瑞娜. 組織工程技術在食管缺損修復重建中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(3): 323-327. doi: 10.7507/1002-1892.20160064 復制
臨床上各種原因（如頸段食管癌、外傷、其他上消化道及頭頸部腫瘤、先天性結構異常、大面積燒傷、感染、自身免疫性疾病及放療等）造成的頸段食管缺損修復，是目前耳鼻咽喉-頭頸外科及胸外科棘手難題[1]。尤其是近年來Barret食管及食管腺癌發病率逐漸升高，食管癌已成為目前全球高致死率惡性腫瘤之一[2]。頸段食管向上連接下咽，同時毗鄰喉及氣管，因此頸段食管缺損后的修復及功能重建是手術治療關鍵環節。臨床上常采用手術修復，其中最常用方式是胃結腸替代法。上世紀60年代Ong等[3]首次報道咽-胃吻合術重建頸段食管缺損，該術式操作相對簡便，手術時間較短；胃的血液供應及循環豐富，術后發生器官壞死幾率小；術中出血少，能夠一期完成手術，解決患者進食問題；手術只有一個吻合口，發生吻合口瘺及狹窄的幾率較小。但是咽-胃吻合術易出現胃酸及食物反流，對心肺功能及鄰近器官造成影響甚至致癌效應。隨著外科技術的發展，之后相繼出現結腸修復、帶蒂游離空腸修復及皮瓣修復等，但自體材料修復重建缺損食管仍存在對機體造成新的缺損且修復材料來源受限等問題[4-6]，同種異體材料移植后會發生感染、狹窄、阻塞等慢性排斥反應。
理想的食管替代物需具有以下特性[7]：①有完整的解剖層次及功能；②良好生物相容性；③管腔密閉、結構完整；④無毒性；⑤無免疫排斥反應；⑥對于菌群有一定抵抗力。近年來，組織工程技術的發展為頸段食管缺損后的修復重建開拓了新思路。目前雖已有大量組織工程技術修復食管缺損的相關報道，但多數集中于局部缺損修復，針對長段全層食管缺損構建組織工程食管的方法，尤其是支架材料的制備及種子細胞的選擇，仍無公認的技術路線。現就組織工程技術在食管缺損修復重建方面的研究進展作一綜述。
1 組織工程食管支架材料
目前組織工程技術修復重建頸段食管的方式大致可分為以下兩大類：單獨使用支架材料修復及支架材料復合種子細胞修復，其中支架材料主要分為人工合成材料及天然材料（如膠原、細胞外基質）[8]。人工合成材料主要由高分子材料交聯聚合而成，其表面形成微孔，有利于組織液的滲透和細胞黏附；天然材料是指機體組織經過機械及化學處理后得到的去細胞生物支架。
1.1 人工合成材料
人工合成材料主要包括不可降解材料和高分子可降解材料。不可降解材料以硅膠管、鈦網為主；高分子可降解材料以聚羥基酸類物質為主，如聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（polylacide-co-polyglycolide acid，PLGA）、聚羥基烷酸酯等。1952年Berman[9]首次報道了運用聚乙烯塑膠管修復頸段食管缺損的動物實驗，隨后用于臨床食管癌患者食管切除術后的修復治療，但最終因并發癥較多、患者死亡率較高而停止。Watanabe等[10]隨后報道運用硅膠管修復胸段食管缺損的動物實驗，但由于人工合成材料不適合細胞附著，實驗結果不理想。Lynen等[11]于2004年報道運用聚偏二氟乙烯作為補片修補兔頸段食管缺損，術后檢測發現新生上皮，且未出現食管狹窄。但該實驗僅觀察了修復小型動物食管黏膜部分缺損的效果，未進行臨床研究。
對于人工合成材料修復長段食管缺損，Takimoto等[12]進行了一系列實驗，以膠原作為支架材料，其內輔以硅膠管作支撐修復5～10?cm頸段及胸段食管缺損，結果發現當缺損長度為5?cm時，上皮細胞及平滑肌細胞能從周圍組織爬行覆蓋膠原，但缺損長度為10 cm時，支架材料的再細胞化則難以實現。Chung等[13]采用11只大鼠制備人工切除食管全層缺損模型，使用復合材料聚己內酯[poly（ε-caprolactone），PCL]和絲纖維蛋白構建的組織工程支架修復缺損食管，其中3只大鼠于術后1周死于切口感染及食管瘺，余8只均存活且無并發癥發生；術后2周病理檢查發現組織工程支架結構仍存在。該實驗證明了PCL用于全周徑食管缺損修復的可行性，但仍有待進一步研究。Oshikiri等[14]利用鈦網修復1例因食管癌行食管切除術后胃代食管患者，該患者由于進行了長段食管全層切除，在行胃代食管的吻合過程中無法實行端端縫合；該課題組采取環周鈦網對2 cm吻合口缺損進行嫁接，術后8周發現肉芽組織已完全通過鈦網從兩端爬滿并對接，取出鈦網后未見明顯并發癥。上述研究說明人工合成材料修復較短的食管缺損可行，但其存在于體內仍會導致管腔狹窄、阻塞及無法達到生物相容性等問題，修復長段食管缺損時則不能通過周邊細胞再生達到重建食管的目的。
1.2 天然材料
脫細胞外基質是將人或動物的組織或器官進行脫細胞并保留器官天然結構的支架材料。其免疫原性極低，并保留了細胞外基質分子成分，與人工合成材料相比無毒性，體內移植不易感染，可避免移植后管腔狹窄。組織工程食管支架材料研究起源于小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS），目前大量研究表明運用SIS修復小面積食管黏膜及黏膜下缺損效果尚可[15-18]。近年來內鏡治療技術的進步和治療器械的不斷開發和應用，使得內鏡黏膜下剝離術（endoscopic submucosal dissection，ESD）迅速發展[19-20]。ESD是微創治療消化道黏膜病變及癌前病變新技術，具有較高的整塊切除率，不但擴大了內鏡黏膜切除術的治療適應證，還能顯著減少病灶殘留及復發，從而達到對消化道黏膜病變及癌前病變根治性切除的效果。但因ESD治療時間較長，出血和穿孔并發癥發生率較高，術后容易出現食管狹窄，因此術后仍有可能進行二次手術。Badylak等[15]用SIS修復5例因食管原位癌行ESD術后發生狹窄的患者，術后2年發現SIS進行了生理功能重建，與周圍正常組織相似，該結果表明黏膜缺損小于5?cm×3?cm者應用SIS修復可避免食管狹窄。但該課題組[16]在運用犬作為模型的動物實驗中發現，對全層食管缺損模型或環形食管缺損模型運用單純SIS修復，術后仍會出現食管腔狹窄。Tan等[17]利用SIS復合BMSCs修復犬長約5 cm的半周徑食管缺損，術后12周發現缺損處實現了肌肉、上皮及血管再生，為長段食管半周徑缺損修復提供了一種可行方法。之后Fan等[18]發現單純SIS修復長段食管全層缺損時缺乏機械韌性，他們利用SIS、聚羥基脂肪酸脂及PLGA構建一種支架材料，經檢測證明該材料在機械力及生物細胞相容性方面均優于單純SIS。但該實驗未進一步行組織工程食管構建及體內重建，因此其臨床應用可行性仍有待研究明確。Nieponice等[21]利用豬膀胱脫細胞外基質對4例臨床食管狹窄患者行食管直徑加寬成形術，將豬膀胱脫細胞外基質作為補片與食管邊緣縫合，1例患者在愈合過程中出現了微小食管瘺，但自行愈合；術后4例患者通過鋇餐及內鏡檢查發現修補后的食管腔通暢、管徑較大；術后2個月內鏡檢查發現修補處完全上皮化，縫合處有20%面積攣縮，但未影響整個管腔的通暢度；病理檢查提示修補處可見正常柱狀上皮生長。該臨床試驗提示脫細胞外基質可作為部分食管缺損的修復材料，但遠期效果還有待更多研究明確。
1.3 器官全層脫細胞外基質支架材料
目前國內外關于組織工程食管的研究報道中，多采用單層SIS或無紡材料復合種子細胞[22-23]，很少將全層食管作為一種細胞外基質材料，其原因在于食管解剖層次復雜，含有黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層。但細胞外基質是最理想的組織工程食管支架結構，完整的食管細胞外基質具有與食管相同的三維空間結構利于細胞生長，具有一定機械韌性，能夠耐受腹腔內多種壓力，誘導血管生成，并且無免疫排斥反應。2014年Sj?qvist等[24]首次報道將食管全層作為整體進行脫細胞處理，但食管解剖層次相對復雜，單純去離子劑浸泡很難在短時間內達到徹底脫細胞效果。近年來Ott等的研究小組報道了一系列利用脈管系統灌注去離子劑構建器官全層脫細胞支架的實驗研究，為全層食管細胞外基質支架材料的構建提供了一種新方法。2008年他們首次報道利用小鼠主動脈灌注去離子劑構建具有心臟天然空間結構的全層脫細胞外基質[25]；2010年他們利用灌注法通過肺主動脈對肺臟進行脫細胞處理，30?min即可使支氣管軟骨達到完全脫細胞效果，成功制備肺臟全層脫細胞外基質[26]；2013年該小組利用血管灌注法制備了小鼠腎臟全層脫細胞外基質，并利用生物反應器將上皮細胞與內皮細胞通過脈管注入脫細胞外基質內，構建組織工程腎臟并進行體內移植[27]。這一系列報道說明灌注法有可能成為構建組織或器官全層脫細胞外基質支架的首選方法[28-29]。本課題小組曾利用供體完整的喉軟骨作支架，喉上動脈及甲狀腺上動脈內灌注技術去除環甲肌、環杓后肌、環杓側肌、甲杓肌及黏膜等具有高免疫原性的軟組織，但保留喉肌群細胞外基質的三維空間結構及完整的喉軟骨支架結構，說明了利用灌注法脫細胞技術構建組織工程全喉支架的可行性[30-31]。因此食管全層脫細胞支架的制備也可借鑒灌注法脫細胞技術，不僅所需時間較短，而且保留了脈管系統，對于大血管重建提供了理想的支架結構。
2 組織工程食管種子細胞
構建組織工程食管的另一主要元素是種子細胞。在種子細胞選擇方面，需要選擇分化及增殖能力較強的細胞。目前用于組織工程食管研究的種子細胞主要集中在自體原位細胞、自體異位細胞及干細胞。
2.1 自體原位細胞
上世紀90年代Sato等[32]將人食管上皮細胞在膠原基質上培養，并與PGA復合培養后卷成食管狀，植入無胸腺大鼠的背闊肌內，20 d后取出，發現人工管狀食管與正常食管相似。2015年Jensen等[33]通過對供體鼠食管進行物理學及酶消化法處理，獲得上皮細胞及平滑肌細胞，然后分別進行體外擴增培養，并與人工合成材料PLGA或PCL/PLGA共同構建組織工程食管，結果發現支架材料上長出上皮細胞、肌細胞及腺細胞。因此他們認為，可以取自體食管組織消化后與支架材料進行復合培養構建組織工程食管。使用自體細胞具有無免疫排斥反應、生物相容性較好的優點，但也存在來源受限的缺點；只適用于小面積燒傷、先天性畸形及感染所致的小段食管狹窄患者。食管缺損患者多因腫瘤造成，自身免疫力低下，自體細胞的健康活力指數很難達到細胞移植要求；而且臨床上食管自體原位細胞需通過內鏡獲取，有一定創傷，因此具有很大局限性。
2.2 自體異位細胞
相對于自體原位細胞應用的局限性，自體異位細胞無免疫原性，且有較多選擇性，可作為組織工程食管重建的種子細胞。近年來“細胞板”技術的出現為局部食管缺損的修復，尤其是ESD術后食管狹窄患者的修復帶來了希望。Ohki等[34]運用“細胞板”技術制備口腔黏膜上皮細胞板修復缺損食管黏膜上皮，發現“細胞板”貼附于食管黏膜下肌層生長良好，提示該方法適用于食管黏膜局限病變的患者。然而對于大多數食管癌患者需進行食管切除，大段食管缺損后的修復成為頭頸外科和胸外科醫生亟待解決的問題。Poghosyan等[35-36]將小型豬自體骨骼肌細胞體外擴增培養后種植于SIS作為食管肌層，口腔黏膜上皮細胞擴增培養后種植于人羊膜上作為食管黏膜層，然后將二者疊加構成人工復合食管植入自體大網膜內重建，2周后將食管行環周切除5 cm同時將組織工程食管從自體大網膜內取出行原位移植，術后小型豬最長存活時間為9個月，9個月后處死小型豬取出移植食管行病理檢測發現移植食管的形態結構與正常食管相似。
2.3 MSCs
MSCs來源廣泛，存在于骨髓、血液、肝臟、肺、脂肪組織、毛囊、皮下組織、牙周韌帶、胸腺、脾及胚胎、臍血等組織中，經誘導能在體外定向生成軟骨細胞等中胚層細胞[19, 24, 37]，也是組織工程種子細胞的理想選擇。Sj?qvist等[24]利用小鼠自體BMSCs體外誘導為成肌細胞及成上皮細胞，種植于食管全層脫細胞外基質支架上，成功構建出組織工程全層食管后，再原位移植至食管切除的具有免疫活性的小鼠體內可存活14 d，取出小鼠體內的組織工程食管經組織學檢測發現該移植食管具有肌肉、上皮、血管及神經等結構。Tan等[17]利用BMSCs修復犬長約5 cm半周徑食管缺損，術后12周發現缺損修復處肌肉、上皮及血管生成。MSCs中還有一類特殊的干細胞——人臍帶MSCs，它是存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，具備干細胞的基本特點，細胞含量及增殖能力均優于BMSCs，而免疫原性低于BMSCs，并具有取材方便、無倫理學爭議、易于分離及純化等優點[38-39]，近年來在組織工程領域倍受重視。隨著細胞工程學和組織工程學的發展，利用人臍帶MSCs的多向分化性及其可在體外表達多種外源性目的基因的特性，將其作為種子細胞用于細胞治療和基因治療已成為研究熱點[40-41]。
3 組織工程食管存在的問題
食管毗鄰重要器官，其內部結構復雜，包括黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層，其缺損后的修復重建是臨床一大難題。目前組織工程食管能夠修復食管黏膜缺損及長段食管缺損，其修復效果接近自體組織結構及功能，但用于構建組織工程食管的支架材料及種子細胞眾多，組織工程技術距離臨床廣泛應用仍有差距。如何構建解剖層次及生理功能與正常人體相同的組織工程食管，在支架材料構建方面如何最大程度地保留支架上的黏附蛋白、葡萄糖胺聚糖、膠原網及膠原蛋白活性物質，如何選擇最適合受體的種子細胞，如何構建血管化及神經化的組織工程食管，仍是需要解決的難題。
臨床上各種原因（如頸段食管癌、外傷、其他上消化道及頭頸部腫瘤、先天性結構異常、大面積燒傷、感染、自身免疫性疾病及放療等）造成的頸段食管缺損修復，是目前耳鼻咽喉-頭頸外科及胸外科棘手難題[1]。尤其是近年來Barret食管及食管腺癌發病率逐漸升高，食管癌已成為目前全球高致死率惡性腫瘤之一[2]。頸段食管向上連接下咽，同時毗鄰喉及氣管，因此頸段食管缺損后的修復及功能重建是手術治療關鍵環節。臨床上常采用手術修復，其中最常用方式是胃結腸替代法。上世紀60年代Ong等[3]首次報道咽-胃吻合術重建頸段食管缺損，該術式操作相對簡便，手術時間較短；胃的血液供應及循環豐富，術后發生器官壞死幾率小；術中出血少，能夠一期完成手術，解決患者進食問題；手術只有一個吻合口，發生吻合口瘺及狹窄的幾率較小。但是咽-胃吻合術易出現胃酸及食物反流，對心肺功能及鄰近器官造成影響甚至致癌效應。隨著外科技術的發展，之后相繼出現結腸修復、帶蒂游離空腸修復及皮瓣修復等，但自體材料修復重建缺損食管仍存在對機體造成新的缺損且修復材料來源受限等問題[4-6]，同種異體材料移植后會發生感染、狹窄、阻塞等慢性排斥反應。
理想的食管替代物需具有以下特性[7]：①有完整的解剖層次及功能；②良好生物相容性；③管腔密閉、結構完整；④無毒性；⑤無免疫排斥反應；⑥對于菌群有一定抵抗力。近年來，組織工程技術的發展為頸段食管缺損后的修復重建開拓了新思路。目前雖已有大量組織工程技術修復食管缺損的相關報道，但多數集中于局部缺損修復，針對長段全層食管缺損構建組織工程食管的方法，尤其是支架材料的制備及種子細胞的選擇，仍無公認的技術路線。現就組織工程技術在食管缺損修復重建方面的研究進展作一綜述。
1 組織工程食管支架材料
目前組織工程技術修復重建頸段食管的方式大致可分為以下兩大類：單獨使用支架材料修復及支架材料復合種子細胞修復，其中支架材料主要分為人工合成材料及天然材料（如膠原、細胞外基質）[8]。人工合成材料主要由高分子材料交聯聚合而成，其表面形成微孔，有利于組織液的滲透和細胞黏附；天然材料是指機體組織經過機械及化學處理后得到的去細胞生物支架。
1.1 人工合成材料
人工合成材料主要包括不可降解材料和高分子可降解材料。不可降解材料以硅膠管、鈦網為主；高分子可降解材料以聚羥基酸類物質為主，如聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（polylacide-co-polyglycolide acid，PLGA）、聚羥基烷酸酯等。1952年Berman[9]首次報道了運用聚乙烯塑膠管修復頸段食管缺損的動物實驗，隨后用于臨床食管癌患者食管切除術后的修復治療，但最終因并發癥較多、患者死亡率較高而停止。Watanabe等[10]隨后報道運用硅膠管修復胸段食管缺損的動物實驗，但由于人工合成材料不適合細胞附著，實驗結果不理想。Lynen等[11]于2004年報道運用聚偏二氟乙烯作為補片修補兔頸段食管缺損，術后檢測發現新生上皮，且未出現食管狹窄。但該實驗僅觀察了修復小型動物食管黏膜部分缺損的效果，未進行臨床研究。
對于人工合成材料修復長段食管缺損，Takimoto等[12]進行了一系列實驗，以膠原作為支架材料，其內輔以硅膠管作支撐修復5～10?cm頸段及胸段食管缺損，結果發現當缺損長度為5?cm時，上皮細胞及平滑肌細胞能從周圍組織爬行覆蓋膠原，但缺損長度為10 cm時，支架材料的再細胞化則難以實現。Chung等[13]采用11只大鼠制備人工切除食管全層缺損模型，使用復合材料聚己內酯[poly（ε-caprolactone），PCL]和絲纖維蛋白構建的組織工程支架修復缺損食管，其中3只大鼠于術后1周死于切口感染及食管瘺，余8只均存活且無并發癥發生；術后2周病理檢查發現組織工程支架結構仍存在。該實驗證明了PCL用于全周徑食管缺損修復的可行性，但仍有待進一步研究。Oshikiri等[14]利用鈦網修復1例因食管癌行食管切除術后胃代食管患者，該患者由于進行了長段食管全層切除，在行胃代食管的吻合過程中無法實行端端縫合；該課題組采取環周鈦網對2 cm吻合口缺損進行嫁接，術后8周發現肉芽組織已完全通過鈦網從兩端爬滿并對接，取出鈦網后未見明顯并發癥。上述研究說明人工合成材料修復較短的食管缺損可行，但其存在于體內仍會導致管腔狹窄、阻塞及無法達到生物相容性等問題，修復長段食管缺損時則不能通過周邊細胞再生達到重建食管的目的。
1.2 天然材料
脫細胞外基質是將人或動物的組織或器官進行脫細胞并保留器官天然結構的支架材料。其免疫原性極低，并保留了細胞外基質分子成分，與人工合成材料相比無毒性，體內移植不易感染，可避免移植后管腔狹窄。組織工程食管支架材料研究起源于小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS），目前大量研究表明運用SIS修復小面積食管黏膜及黏膜下缺損效果尚可[15-18]。近年來內鏡治療技術的進步和治療器械的不斷開發和應用，使得內鏡黏膜下剝離術（endoscopic submucosal dissection，ESD）迅速發展[19-20]。ESD是微創治療消化道黏膜病變及癌前病變新技術，具有較高的整塊切除率，不但擴大了內鏡黏膜切除術的治療適應證，還能顯著減少病灶殘留及復發，從而達到對消化道黏膜病變及癌前病變根治性切除的效果。但因ESD治療時間較長，出血和穿孔并發癥發生率較高，術后容易出現食管狹窄，因此術后仍有可能進行二次手術。Badylak等[15]用SIS修復5例因食管原位癌行ESD術后發生狹窄的患者，術后2年發現SIS進行了生理功能重建，與周圍正常組織相似，該結果表明黏膜缺損小于5?cm×3?cm者應用SIS修復可避免食管狹窄。但該課題組[16]在運用犬作為模型的動物實驗中發現，對全層食管缺損模型或環形食管缺損模型運用單純SIS修復，術后仍會出現食管腔狹窄。Tan等[17]利用SIS復合BMSCs修復犬長約5 cm的半周徑食管缺損，術后12周發現缺損處實現了肌肉、上皮及血管再生，為長段食管半周徑缺損修復提供了一種可行方法。之后Fan等[18]發現單純SIS修復長段食管全層缺損時缺乏機械韌性，他們利用SIS、聚羥基脂肪酸脂及PLGA構建一種支架材料，經檢測證明該材料在機械力及生物細胞相容性方面均優于單純SIS。但該實驗未進一步行組織工程食管構建及體內重建，因此其臨床應用可行性仍有待研究明確。Nieponice等[21]利用豬膀胱脫細胞外基質對4例臨床食管狹窄患者行食管直徑加寬成形術，將豬膀胱脫細胞外基質作為補片與食管邊緣縫合，1例患者在愈合過程中出現了微小食管瘺，但自行愈合；術后4例患者通過鋇餐及內鏡檢查發現修補后的食管腔通暢、管徑較大；術后2個月內鏡檢查發現修補處完全上皮化，縫合處有20%面積攣縮，但未影響整個管腔的通暢度；病理檢查提示修補處可見正常柱狀上皮生長。該臨床試驗提示脫細胞外基質可作為部分食管缺損的修復材料，但遠期效果還有待更多研究明確。
1.3 器官全層脫細胞外基質支架材料
目前國內外關于組織工程食管的研究報道中，多采用單層SIS或無紡材料復合種子細胞[22-23]，很少將全層食管作為一種細胞外基質材料，其原因在于食管解剖層次復雜，含有黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層。但細胞外基質是最理想的組織工程食管支架結構，完整的食管細胞外基質具有與食管相同的三維空間結構利于細胞生長，具有一定機械韌性，能夠耐受腹腔內多種壓力，誘導血管生成，并且無免疫排斥反應。2014年Sj?qvist等[24]首次報道將食管全層作為整體進行脫細胞處理，但食管解剖層次相對復雜，單純去離子劑浸泡很難在短時間內達到徹底脫細胞效果。近年來Ott等的研究小組報道了一系列利用脈管系統灌注去離子劑構建器官全層脫細胞支架的實驗研究，為全層食管細胞外基質支架材料的構建提供了一種新方法。2008年他們首次報道利用小鼠主動脈灌注去離子劑構建具有心臟天然空間結構的全層脫細胞外基質[25]；2010年他們利用灌注法通過肺主動脈對肺臟進行脫細胞處理，30?min即可使支氣管軟骨達到完全脫細胞效果，成功制備肺臟全層脫細胞外基質[26]；2013年該小組利用血管灌注法制備了小鼠腎臟全層脫細胞外基質，并利用生物反應器將上皮細胞與內皮細胞通過脈管注入脫細胞外基質內，構建組織工程腎臟并進行體內移植[27]。這一系列報道說明灌注法有可能成為構建組織或器官全層脫細胞外基質支架的首選方法[28-29]。本課題小組曾利用供體完整的喉軟骨作支架，喉上動脈及甲狀腺上動脈內灌注技術去除環甲肌、環杓后肌、環杓側肌、甲杓肌及黏膜等具有高免疫原性的軟組織，但保留喉肌群細胞外基質的三維空間結構及完整的喉軟骨支架結構，說明了利用灌注法脫細胞技術構建組織工程全喉支架的可行性[30-31]。因此食管全層脫細胞支架的制備也可借鑒灌注法脫細胞技術，不僅所需時間較短，而且保留了脈管系統，對于大血管重建提供了理想的支架結構。
2 組織工程食管種子細胞
構建組織工程食管的另一主要元素是種子細胞。在種子細胞選擇方面，需要選擇分化及增殖能力較強的細胞。目前用于組織工程食管研究的種子細胞主要集中在自體原位細胞、自體異位細胞及干細胞。
2.1 自體原位細胞
上世紀90年代Sato等[32]將人食管上皮細胞在膠原基質上培養，并與PGA復合培養后卷成食管狀，植入無胸腺大鼠的背闊肌內，20 d后取出，發現人工管狀食管與正常食管相似。2015年Jensen等[33]通過對供體鼠食管進行物理學及酶消化法處理，獲得上皮細胞及平滑肌細胞，然后分別進行體外擴增培養，并與人工合成材料PLGA或PCL/PLGA共同構建組織工程食管，結果發現支架材料上長出上皮細胞、肌細胞及腺細胞。因此他們認為，可以取自體食管組織消化后與支架材料進行復合培養構建組織工程食管。使用自體細胞具有無免疫排斥反應、生物相容性較好的優點，但也存在來源受限的缺點；只適用于小面積燒傷、先天性畸形及感染所致的小段食管狹窄患者。食管缺損患者多因腫瘤造成，自身免疫力低下，自體細胞的健康活力指數很難達到細胞移植要求；而且臨床上食管自體原位細胞需通過內鏡獲取，有一定創傷，因此具有很大局限性。
2.2 自體異位細胞
相對于自體原位細胞應用的局限性，自體異位細胞無免疫原性，且有較多選擇性，可作為組織工程食管重建的種子細胞。近年來“細胞板”技術的出現為局部食管缺損的修復，尤其是ESD術后食管狹窄患者的修復帶來了希望。Ohki等[34]運用“細胞板”技術制備口腔黏膜上皮細胞板修復缺損食管黏膜上皮，發現“細胞板”貼附于食管黏膜下肌層生長良好，提示該方法適用于食管黏膜局限病變的患者。然而對于大多數食管癌患者需進行食管切除，大段食管缺損后的修復成為頭頸外科和胸外科醫生亟待解決的問題。Poghosyan等[35-36]將小型豬自體骨骼肌細胞體外擴增培養后種植于SIS作為食管肌層，口腔黏膜上皮細胞擴增培養后種植于人羊膜上作為食管黏膜層，然后將二者疊加構成人工復合食管植入自體大網膜內重建，2周后將食管行環周切除5 cm同時將組織工程食管從自體大網膜內取出行原位移植，術后小型豬最長存活時間為9個月，9個月后處死小型豬取出移植食管行病理檢測發現移植食管的形態結構與正常食管相似。
2.3 MSCs
MSCs來源廣泛，存在于骨髓、血液、肝臟、肺、脂肪組織、毛囊、皮下組織、牙周韌帶、胸腺、脾及胚胎、臍血等組織中，經誘導能在體外定向生成軟骨細胞等中胚層細胞[19, 24, 37]，也是組織工程種子細胞的理想選擇。Sj?qvist等[24]利用小鼠自體BMSCs體外誘導為成肌細胞及成上皮細胞，種植于食管全層脫細胞外基質支架上，成功構建出組織工程全層食管后，再原位移植至食管切除的具有免疫活性的小鼠體內可存活14 d，取出小鼠體內的組織工程食管經組織學檢測發現該移植食管具有肌肉、上皮、血管及神經等結構。Tan等[17]利用BMSCs修復犬長約5 cm半周徑食管缺損，術后12周發現缺損修復處肌肉、上皮及血管生成。MSCs中還有一類特殊的干細胞——人臍帶MSCs，它是存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，具備干細胞的基本特點，細胞含量及增殖能力均優于BMSCs，而免疫原性低于BMSCs，并具有取材方便、無倫理學爭議、易于分離及純化等優點[38-39]，近年來在組織工程領域倍受重視。隨著細胞工程學和組織工程學的發展，利用人臍帶MSCs的多向分化性及其可在體外表達多種外源性目的基因的特性，將其作為種子細胞用于細胞治療和基因治療已成為研究熱點[40-41]。
3 組織工程食管存在的問題
食管毗鄰重要器官，其內部結構復雜，包括黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層，其缺損后的修復重建是臨床一大難題。目前組織工程食管能夠修復食管黏膜缺損及長段食管缺損，其修復效果接近自體組織結構及功能，但用于構建組織工程食管的支架材料及種子細胞眾多，組織工程技術距離臨床廣泛應用仍有差距。如何構建解剖層次及生理功能與正常人體相同的組織工程食管，在支架材料構建方面如何最大程度地保留支架上的黏附蛋白、葡萄糖胺聚糖、膠原網及膠原蛋白活性物質，如何選擇最適合受體的種子細胞，如何構建血管化及神經化的組織工程食管，仍是需要解決的難題。