引用本文： 張育敏, 李晶, 牛曉軍, 劉建春, 王玨, 高嵐. 聚乳酸/骨基質明膠多孔復合材料的生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(2): 251-257. doi: 10.7507/1002-1892.20160050 復制
因腫瘤、創傷等造成的大段骨缺損常需植骨修復，以促進骨愈合。目前臨床常用的植骨材料主要包括兩大類：一類為人工合成材料，如聚乳酸（poly lactic acid，PLA）、羥基磷灰石、磷酸鈣等；另一類為生物衍生材料，如同種骨、異種骨等。人工合成材料易成型，但缺乏骨誘導活性；生物衍生類材料雖然具有良好的骨傳導及骨誘導活性，但難以根據臨床需要進行塑形。將兩種材料復合，取長補短，制備易于塑形并具有良好理化性能、骨誘導活性和生物相容性的骨修復材料是目前研究方向之一[1-4]。前期我們采用超臨界CO2法制備了PLA/骨基質明膠（bone matrix gelatin，BMG）多孔復合材料，并證實該材料具有良好的理化性能[5]。本實驗擬采用體內植入與體外細胞培養來評價PLA/BMG多孔復合材料的組織和細胞相容性，為下一步骨缺損修復實驗奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性Wistar大鼠15只，體質量220～250?g，由中國輻射防護研究院實驗動物中心提供。PLA/BMG多孔復合材料及PLA材料按前期實驗方法制備[5]。小鼠成骨前體細胞MCT3T-E1細胞由中國科學院上海細胞庫提供。H-DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶、MTT（Sigma公司，美國）；水合氯醛（天津科密歐化學試劑有限公司）。超凈工作臺（Sanyo公司，日本）；高壓滅菌器（Hirayama公司，德國）；高速冷凍離心機（Sigma公司，德國）；細胞培養箱（Heraeus公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；掃描電鏡（JEOL公司，日本）；MetertechΣ960酶標儀（中國臺灣Metertech公司）；CMIAS病理醫學圖像系統（北京天航科霖科技發展有限公司）。
1.2 體外細胞毒性實驗
1.2.1 浸提液制備
參照中華人民共和國醫療器械生物學評價標準[6]，以不含血清的H-DMEM培養基作為浸提溶液，按材料與浸提溶液0.1 g∶1 mL的比例，將PLA/BMG材料與PLA材料分別浸入浸提溶液中，37℃、5%CO2培養箱培養72 h；將獲得的浸提液以離心半徑8.5?cm、1 000 r/min離心5 min；取上清液，制備成含10%FBS的浸提液備用。
1.2.2 細胞培養及MTT測定[7 -8 ]
將MCT3T-E1細胞復蘇并傳至第3代，0.25%胰蛋白酶消化，以離心半徑8.5 cm、1 000 r/min離心3 min；收集細胞，計數，制成濃度為1.5×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔培養板，每孔200 mL。培養24 h待細胞貼壁后，棄培養液，分別加入200 mL PLA材料、PLA/BMG多孔復合材料浸提液；置37℃、5%CO2培養箱中繼續培養，每2天更換1次浸提液。于培養1、2、3、4、5、6、7 d分別取5孔，每孔加入30 mL濃度為2 mg/mL的MTT溶液，繼續培養4 h，吸出孔內培養液后，加入150 mL DMSO，微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結晶物溶解。于酶標儀570 nm處檢測吸光度（A）值。以單純H-DMEM培養液培養細胞作為陰性對照，無細胞培養孔作為空白對照。以陰性對照組A值作為100%細胞增殖率，按以下公式計算不同材料浸提液培養后細胞增殖率：（材料浸提液培養組A值/陰性對照組A值）×100%。根據細胞增殖率評價材料細胞毒性，共分為5級：≥100%為0級，75%～99%為1級，50%～74%為2級，25%～49%為3級，1%～24%為4級，0為5級。
1.3 材料與細胞復合培養觀察
將PLA/BMG多孔復合材料修剪成3?mm× 3?mm×3 mm大小，置于6孔培養板內，每孔1塊；將濃度為1×104個/mL的第3代MC3T3-E1細胞懸液接種于6孔培養板內，每孔500 μL，加入H-DMEM培養基至完全淹沒材料。置于37℃、5%CO2培養箱中培養，1、3、5 d于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長及與材料貼附情況。5 d時取出材料，2.5%戊二醛4℃固定4 h，PBS緩沖液沖洗3遍，冷凍干燥處理后，離子濺射儀進行表面噴金處理，掃描電鏡觀察細胞貼附情況。
1.4 皮下植入實驗
取15只Wistar大鼠，腹腔注射15%水合氯醛（0.2 mL/100 g）麻醉后，切開脊柱兩側背部皮膚及筋膜，將大小為3 mm×3 mm×3 mm的PLA材料（PLA組）及PLA/BMG多孔復合材料（PLA/BMG組）分別植于左、右側皮下，距中線約5 mm。術后大體觀察大鼠飲食、活動及切口愈合情況；2、4、8 周隨機取5只大鼠，過量麻醉處死后，經原切口入路，觀察材料與周圍組織情況；切取包括植入材料及周圍組織的復合組織塊，10%甲醛固定、切片，片厚5 μm，HE染色觀察。每個標本隨機取5張切片，CMIAS病理醫學圖像系統測量植入材料外包被的結締組織膜厚度。并于每張切片上、下、左、右及中心各取5個視野，圖像分析儀計數炎性細胞數并測量血管面積，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS10.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 體外細胞毒性實驗
PLA/BMG多孔復合材料浸提液培養細胞1～7?d，細胞增殖率均達100%以上，細胞毒性分級均為0級。PLA材料浸提液培養2、4、7 d細胞增殖率低于100%，細胞毒性分級為1級；1、3、5、6 d細胞增殖率達100%以上，分級為0級。 提示與PLA材料比較，PLA/BMG多孔復合材料毒性低，對細胞增殖影響小。見表 1。
表1
不同材料浸提液培養各時間點細胞增殖率（n=5，%，2.2 材料與細胞復合培養觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，復合培養1 d，PLA/BMG多孔復合材料周圍基本無細胞貼附；3 d，材料側緣可見少量細胞貼附，材料周圍細胞形態正常；5?d，材料側緣貼附細胞增多，周圍細胞生長狀態良好，呈匯聚狀態。見圖 1。
圖1
PLA/BMG多孔復合材料與細胞復合培養后各時間點細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×400） ?培養1 d ?培養3 d ?培養5?d ? ?圖 2 PLA/BMG多孔復合材料與細胞復合培養5 d掃描電鏡觀察 ?材料孔隙邊緣及內部可見細胞（箭頭）貼附（×1 000） ?貼附細胞形態飽滿（箭頭），有大量偽足伸向材料表面（×3 700） ? ?圖 3 大鼠皮下植入術后8周大體觀察左側：PLA組右側：PLA/BMG組
Figure1.
Morphology observation at different time points after co-culture of PLA/BMG and cells (Inverted phase contrast microscope×400) ?At 1 day ?At 3 days ?At 5 days ? ?Fig. 2 Scanning electron microscope observation of MC3T3-E1 cells on the surface of PLA/BMG at 5 days after co-culture ?Some cells (arrow) adhere to the edge of pores and inside (×1 000) ?The attached cells (arrow) were plump with a large number of pseudopodia to material surface (×3 700) ? ?Fig. 3 Gross observation at 8 weeks after subcutaneous implantation in rats Left: PLA group Right: PLA/BMG group
培養5 d時掃描電鏡觀察示，材料表面及材料孔隙內壁均有細胞貼附，細胞呈三角形或多邊形，表面有較多突起；可見多個細胞在材料表面匯合成片狀分布，細胞形態飽滿，與材料貼附緊密，細胞表面有泡狀突起，周圍有大量偽足伸向材料表面。見圖 2。
2.3 皮下植入實驗
2.3.1 大體觀察
術后大鼠均存活至實驗完成，切口無紅腫、感染、滲出及裂開等不良反應，均愈合良好。皮下植入區周圍組織無硬結、腫脹和壞死。兩組各時間點取材時，材料均被周圍組織緊密包裹，周圍組織色澤、柔軟度及結構與正常組織無明顯差別。未見周圍組織有出血、感染、壞死等刺激反應發生。見圖 3。
2.3.2 組織學觀察
①鏡下觀察：術后2周，PLA組材料被薄層纖維組織包裹，有血管長入，可見散在的淋巴細胞和中性粒細胞，但材料中心基本無組織及細胞長入，僅見少量組織液；PLA/BMG組材料周圍無纖維組織包裹，周圍組織內炎性細胞少見，材料內可見間充質包裹散在的BMG，周圍組織及細胞基本完全長入材料內部。見圖 4a～d。
圖2
大鼠皮下植入各時間點HE染色觀察 ?PLA組2周（×200） ?PLA組2周（×400） ?PLA/BMG組2周（×200） ?PLA/BMG組2周（×400） ?PLA組4周（×200） ?PLA組4周（×400） ?PLA/BMG組4周（×200） ?PLA/BMG組4周（×400） ?PLA組8 周（×200） ?PLA組8周（×400） ?PLA/BMG組8周（×200） ?PLA/BMG組8周（×400）
Figure2.
HE observation at different time points after subcutaneous implantation ?PLA group at 2 weeks (×200) ?PLA group at 2 weeks (×400) ?PLA/BMG group at 2 weeks (×200) ?PLA/BMG group at 2 weeks (×400) ?PLA group at 4 weeks (×200) ?PLA group at 4?weeks (×400) ?PLA/BMG group at 4 weeks (×200) ?PLA/BMG group at 4 weeks (×400) ?PLA group at 8 weeks (×200) ?PLA group at 8 weeks (×400) ?PLA/BMG group at 8 weeks (×200) ?PLA/BMG group at 8 weeks (×400)
4周，PLA組觀察情況與2周時基本一致，但有更多炎性細胞聚集，宿主組織仍未長滿材料內部空隙；PLA/BMG組內有大量間充質及血管長入，炎性細胞少見，散在的BMG被結締組織包裹，材料邊緣BMG可見被包裹吸收。見圖 4e～h。
8周，PLA組結締組織向材料中心長入并逐漸取代材料，僅剩材料中心部分殘余，長入材料內的結締組織內仍有大量炎性細胞；PLA/BMG組疏松的結締組織包裹材料內散在的BMG，內有大量新生血管，基本無炎性細胞，BMG周圍可見多核細胞及核大、細胞質清亮細胞。見圖 4i～l。
②包膜厚度、炎性細胞數及血管面積測量：PLA/BMG組術后2、4、8周包膜厚度和炎性細胞數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；血管面積隨時間增加而增大，其中2周與4、8周比較差異有統計學意義（P<0.05），4、8周間比較差異無統計學意義（P>0.05）。PLA組各時間點間包膜厚度、炎性細胞數及血管面積比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
各時間點，兩組包膜厚度比較差異均無統計學意義（P>0.05）；PLA/BMG組炎性細胞數顯著低于PLA組，差異均有統計學意義（P<0.05）。兩組血管面積僅8周時差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2～4。
表2
各時間點兩組包膜厚度比較（n=5，mm，
表3
各時間點兩組炎性細胞數比較（n=5，個/視野，
表4
各時間點兩組血管密度比較（n=5，μm2，3 討論
生物相容性是指生物體組織對生物材料產生反應的一種性能，包括組織相容性、血液相容性和細胞相容性等[9-10]。目前，對生物材料生物相容性評價方法主要有兩類：一是動物體內實驗，即將材料植入動物體內，分階段將植入材料與周圍組織取出進行組織學檢查，觀察材料及周圍組織病理變化。一種是體外實驗，觀察材料或材料浸提液對細胞生長、代謝及增殖的影響。本研究通過體內及體外實驗，從組織及細胞兩方面對PLA/BMG多孔復合材料組織相容性及細胞相容性進行評價。
自1948年Rosen Bluth首次報道利用小鼠成纖維細胞評價生物材料相容性來篩選聚合物以來，細胞毒性試驗已成為評價材料細胞相容性的可靠方法[11-12]。本研究參考中華人民共和國醫療器械生物學評價標準制備浸提液，培養細胞后經MTT測定顯示，PLA/BMG多孔復合材料具有良好的細胞相容性，細胞毒性為0級，能夠促進MC3T3-E1細胞的快速增殖，細胞貼附實驗也證實了材料對細胞具有良好的親和性。而PLA材料細胞相容性則較差，可能是由于PLA材料易降解形成乳酸等酸性產物引起浸提液pH值降低[13-14]，而每次更換PLA浸提液后導致pH值進一步下降，從而影響細胞增殖。這與文獻報道結論一致[15-16]。
體內植入試驗是評價生物材料生物相容性和安全性的主要方法之一，也是經典的生物相容性評價方法[17-18]。本研究中，PLA/BMG多孔復合材料植入后，與PLA材料比較，炎性反應輕微，材料周圍基本無纖維包裹，結締組織向組織內浸潤速度快，且可見間充質細胞向材料內散在的BMG貼附，表明PLA/BMG多孔復合材料比PLA材料具有更好的組織相容性；而PLA材料植入后8周后，炎性反應仍較強烈，可能是PLA降解后產生的酸性環境引起無菌性炎癥[19-20]，與MTT法檢測結果一致。定量檢測植入后材料包膜厚度、炎性細胞數及血管面積顯示，雖然兩組包膜厚度無顯著差異，但PLA組2、4、8周炎性細胞數均高于PLA/BMG組，表明PLA組炎性反應強、組織相容性差，而PLA/BMG多孔復合材料對機體的異物刺激小，與機體有較好相容性。而兩組間包膜厚度無顯著差異，可能與植入樣品體積小，機體對其反應程度不劇烈有關。兩組間血管面積僅8周時差異有統計學意義，PLA/BMG組組內2周和4、8周間差異有統計學意義，提示PLA/BMG組2周后血管快速長入，而PLA組血管長入無明顯變化，反映PLA/BMG多孔復合材料較PLA材料有更好的組織親和性，利于引導營養物質和干細胞的長入。PLA/BMG組可觀察到間充質細胞向材料內BMG顆粒的貼附，此為誘導成骨的初期反應，但未觀察到明顯成骨，可能與植入部位和皮下有關，而常用來檢測異位成骨的實驗模型為肌袋植入[21-22]，因此有待進一步采用肌袋植入提供詳細實驗數據。
綜上述，體內動物實驗及體外細胞實驗表明PLA材料及PLA/BMG多孔復合材料均有較好的組織相容性及細胞相容性，但PLA/BMG多孔復合材料較單一PLA材料的生物相容性更佳，達到了復合不同材料取長補短的目的。
因腫瘤、創傷等造成的大段骨缺損常需植骨修復，以促進骨愈合。目前臨床常用的植骨材料主要包括兩大類：一類為人工合成材料，如聚乳酸（poly lactic acid，PLA）、羥基磷灰石、磷酸鈣等；另一類為生物衍生材料，如同種骨、異種骨等。人工合成材料易成型，但缺乏骨誘導活性；生物衍生類材料雖然具有良好的骨傳導及骨誘導活性，但難以根據臨床需要進行塑形。將兩種材料復合，取長補短，制備易于塑形并具有良好理化性能、骨誘導活性和生物相容性的骨修復材料是目前研究方向之一[1-4]。前期我們采用超臨界CO2法制備了PLA/骨基質明膠（bone matrix gelatin，BMG）多孔復合材料，并證實該材料具有良好的理化性能[5]。本實驗擬采用體內植入與體外細胞培養來評價PLA/BMG多孔復合材料的組織和細胞相容性，為下一步骨缺損修復實驗奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性Wistar大鼠15只，體質量220～250?g，由中國輻射防護研究院實驗動物中心提供。PLA/BMG多孔復合材料及PLA材料按前期實驗方法制備[5]。小鼠成骨前體細胞MCT3T-E1細胞由中國科學院上海細胞庫提供。H-DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶、MTT（Sigma公司，美國）；水合氯醛（天津科密歐化學試劑有限公司）。超凈工作臺（Sanyo公司，日本）；高壓滅菌器（Hirayama公司，德國）；高速冷凍離心機（Sigma公司，德國）；細胞培養箱（Heraeus公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；掃描電鏡（JEOL公司，日本）；MetertechΣ960酶標儀（中國臺灣Metertech公司）；CMIAS病理醫學圖像系統（北京天航科霖科技發展有限公司）。
1.2 體外細胞毒性實驗
1.2.1 浸提液制備
參照中華人民共和國醫療器械生物學評價標準[6]，以不含血清的H-DMEM培養基作為浸提溶液，按材料與浸提溶液0.1 g∶1 mL的比例，將PLA/BMG材料與PLA材料分別浸入浸提溶液中，37℃、5%CO2培養箱培養72 h；將獲得的浸提液以離心半徑8.5?cm、1 000 r/min離心5 min；取上清液，制備成含10%FBS的浸提液備用。
1.2.2 細胞培養及MTT測定[7 -8 ]
將MCT3T-E1細胞復蘇并傳至第3代，0.25%胰蛋白酶消化，以離心半徑8.5 cm、1 000 r/min離心3 min；收集細胞，計數，制成濃度為1.5×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔培養板，每孔200 mL。培養24 h待細胞貼壁后，棄培養液，分別加入200 mL PLA材料、PLA/BMG多孔復合材料浸提液；置37℃、5%CO2培養箱中繼續培養，每2天更換1次浸提液。于培養1、2、3、4、5、6、7 d分別取5孔，每孔加入30 mL濃度為2 mg/mL的MTT溶液，繼續培養4 h，吸出孔內培養液后，加入150 mL DMSO，微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結晶物溶解。于酶標儀570 nm處檢測吸光度（A）值。以單純H-DMEM培養液培養細胞作為陰性對照，無細胞培養孔作為空白對照。以陰性對照組A值作為100%細胞增殖率，按以下公式計算不同材料浸提液培養后細胞增殖率：（材料浸提液培養組A值/陰性對照組A值）×100%。根據細胞增殖率評價材料細胞毒性，共分為5級：≥100%為0級，75%～99%為1級，50%～74%為2級，25%～49%為3級，1%～24%為4級，0為5級。
1.3 材料與細胞復合培養觀察
將PLA/BMG多孔復合材料修剪成3?mm× 3?mm×3 mm大小，置于6孔培養板內，每孔1塊；將濃度為1×104個/mL的第3代MC3T3-E1細胞懸液接種于6孔培養板內，每孔500 μL，加入H-DMEM培養基至完全淹沒材料。置于37℃、5%CO2培養箱中培養，1、3、5 d于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長及與材料貼附情況。5 d時取出材料，2.5%戊二醛4℃固定4 h，PBS緩沖液沖洗3遍，冷凍干燥處理后，離子濺射儀進行表面噴金處理，掃描電鏡觀察細胞貼附情況。
1.4 皮下植入實驗
取15只Wistar大鼠，腹腔注射15%水合氯醛（0.2 mL/100 g）麻醉后，切開脊柱兩側背部皮膚及筋膜，將大小為3 mm×3 mm×3 mm的PLA材料（PLA組）及PLA/BMG多孔復合材料（PLA/BMG組）分別植于左、右側皮下，距中線約5 mm。術后大體觀察大鼠飲食、活動及切口愈合情況；2、4、8 周隨機取5只大鼠，過量麻醉處死后，經原切口入路，觀察材料與周圍組織情況；切取包括植入材料及周圍組織的復合組織塊，10%甲醛固定、切片，片厚5 μm，HE染色觀察。每個標本隨機取5張切片，CMIAS病理醫學圖像系統測量植入材料外包被的結締組織膜厚度。并于每張切片上、下、左、右及中心各取5個視野，圖像分析儀計數炎性細胞數并測量血管面積，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS10.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 體外細胞毒性實驗
PLA/BMG多孔復合材料浸提液培養細胞1～7?d，細胞增殖率均達100%以上，細胞毒性分級均為0級。PLA材料浸提液培養2、4、7 d細胞增殖率低于100%，細胞毒性分級為1級；1、3、5、6 d細胞增殖率達100%以上，分級為0級。 提示與PLA材料比較，PLA/BMG多孔復合材料毒性低，對細胞增殖影響小。見表 1。
表1
不同材料浸提液培養各時間點細胞增殖率（n=5，%，2.2 材料與細胞復合培養觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，復合培養1 d，PLA/BMG多孔復合材料周圍基本無細胞貼附；3 d，材料側緣可見少量細胞貼附，材料周圍細胞形態正常；5?d，材料側緣貼附細胞增多，周圍細胞生長狀態良好，呈匯聚狀態。見圖 1。
圖1
PLA/BMG多孔復合材料與細胞復合培養后各時間點細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×400） ?培養1 d ?培養3 d ?培養5?d ? ?圖 2 PLA/BMG多孔復合材料與細胞復合培養5 d掃描電鏡觀察 ?材料孔隙邊緣及內部可見細胞（箭頭）貼附（×1 000） ?貼附細胞形態飽滿（箭頭），有大量偽足伸向材料表面（×3 700） ? ?圖 3 大鼠皮下植入術后8周大體觀察左側：PLA組右側：PLA/BMG組
Figure1.
Morphology observation at different time points after co-culture of PLA/BMG and cells (Inverted phase contrast microscope×400) ?At 1 day ?At 3 days ?At 5 days ? ?Fig. 2 Scanning electron microscope observation of MC3T3-E1 cells on the surface of PLA/BMG at 5 days after co-culture ?Some cells (arrow) adhere to the edge of pores and inside (×1 000) ?The attached cells (arrow) were plump with a large number of pseudopodia to material surface (×3 700) ? ?Fig. 3 Gross observation at 8 weeks after subcutaneous implantation in rats Left: PLA group Right: PLA/BMG group
培養5 d時掃描電鏡觀察示，材料表面及材料孔隙內壁均有細胞貼附，細胞呈三角形或多邊形，表面有較多突起；可見多個細胞在材料表面匯合成片狀分布，細胞形態飽滿，與材料貼附緊密，細胞表面有泡狀突起，周圍有大量偽足伸向材料表面。見圖 2。
2.3 皮下植入實驗
2.3.1 大體觀察
術后大鼠均存活至實驗完成，切口無紅腫、感染、滲出及裂開等不良反應，均愈合良好。皮下植入區周圍組織無硬結、腫脹和壞死。兩組各時間點取材時，材料均被周圍組織緊密包裹，周圍組織色澤、柔軟度及結構與正常組織無明顯差別。未見周圍組織有出血、感染、壞死等刺激反應發生。見圖 3。
2.3.2 組織學觀察
①鏡下觀察：術后2周，PLA組材料被薄層纖維組織包裹，有血管長入，可見散在的淋巴細胞和中性粒細胞，但材料中心基本無組織及細胞長入，僅見少量組織液；PLA/BMG組材料周圍無纖維組織包裹，周圍組織內炎性細胞少見，材料內可見間充質包裹散在的BMG，周圍組織及細胞基本完全長入材料內部。見圖 4a～d。
圖2
大鼠皮下植入各時間點HE染色觀察 ?PLA組2周（×200） ?PLA組2周（×400） ?PLA/BMG組2周（×200） ?PLA/BMG組2周（×400） ?PLA組4周（×200） ?PLA組4周（×400） ?PLA/BMG組4周（×200） ?PLA/BMG組4周（×400） ?PLA組8 周（×200） ?PLA組8周（×400） ?PLA/BMG組8周（×200） ?PLA/BMG組8周（×400）
Figure2.
HE observation at different time points after subcutaneous implantation ?PLA group at 2 weeks (×200) ?PLA group at 2 weeks (×400) ?PLA/BMG group at 2 weeks (×200) ?PLA/BMG group at 2 weeks (×400) ?PLA group at 4 weeks (×200) ?PLA group at 4?weeks (×400) ?PLA/BMG group at 4 weeks (×200) ?PLA/BMG group at 4 weeks (×400) ?PLA group at 8 weeks (×200) ?PLA group at 8 weeks (×400) ?PLA/BMG group at 8 weeks (×200) ?PLA/BMG group at 8 weeks (×400)
4周，PLA組觀察情況與2周時基本一致，但有更多炎性細胞聚集，宿主組織仍未長滿材料內部空隙；PLA/BMG組內有大量間充質及血管長入，炎性細胞少見，散在的BMG被結締組織包裹，材料邊緣BMG可見被包裹吸收。見圖 4e～h。
8周，PLA組結締組織向材料中心長入并逐漸取代材料，僅剩材料中心部分殘余，長入材料內的結締組織內仍有大量炎性細胞；PLA/BMG組疏松的結締組織包裹材料內散在的BMG，內有大量新生血管，基本無炎性細胞，BMG周圍可見多核細胞及核大、細胞質清亮細胞。見圖 4i～l。
②包膜厚度、炎性細胞數及血管面積測量：PLA/BMG組術后2、4、8周包膜厚度和炎性細胞數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；血管面積隨時間增加而增大，其中2周與4、8周比較差異有統計學意義（P<0.05），4、8周間比較差異無統計學意義（P>0.05）。PLA組各時間點間包膜厚度、炎性細胞數及血管面積比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
各時間點，兩組包膜厚度比較差異均無統計學意義（P>0.05）；PLA/BMG組炎性細胞數顯著低于PLA組，差異均有統計學意義（P<0.05）。兩組血管面積僅8周時差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2～4。
表2
各時間點兩組包膜厚度比較（n=5，mm，
表3
各時間點兩組炎性細胞數比較（n=5，個/視野，
表4
各時間點兩組血管密度比較（n=5，μm2，3 討論
生物相容性是指生物體組織對生物材料產生反應的一種性能，包括組織相容性、血液相容性和細胞相容性等[9-10]。目前，對生物材料生物相容性評價方法主要有兩類：一是動物體內實驗，即將材料植入動物體內，分階段將植入材料與周圍組織取出進行組織學檢查，觀察材料及周圍組織病理變化。一種是體外實驗，觀察材料或材料浸提液對細胞生長、代謝及增殖的影響。本研究通過體內及體外實驗，從組織及細胞兩方面對PLA/BMG多孔復合材料組織相容性及細胞相容性進行評價。
自1948年Rosen Bluth首次報道利用小鼠成纖維細胞評價生物材料相容性來篩選聚合物以來，細胞毒性試驗已成為評價材料細胞相容性的可靠方法[11-12]。本研究參考中華人民共和國醫療器械生物學評價標準制備浸提液，培養細胞后經MTT測定顯示，PLA/BMG多孔復合材料具有良好的細胞相容性，細胞毒性為0級，能夠促進MC3T3-E1細胞的快速增殖，細胞貼附實驗也證實了材料對細胞具有良好的親和性。而PLA材料細胞相容性則較差，可能是由于PLA材料易降解形成乳酸等酸性產物引起浸提液pH值降低[13-14]，而每次更換PLA浸提液后導致pH值進一步下降，從而影響細胞增殖。這與文獻報道結論一致[15-16]。
體內植入試驗是評價生物材料生物相容性和安全性的主要方法之一，也是經典的生物相容性評價方法[17-18]。本研究中，PLA/BMG多孔復合材料植入后，與PLA材料比較，炎性反應輕微，材料周圍基本無纖維包裹，結締組織向組織內浸潤速度快，且可見間充質細胞向材料內散在的BMG貼附，表明PLA/BMG多孔復合材料比PLA材料具有更好的組織相容性；而PLA材料植入后8周后，炎性反應仍較強烈，可能是PLA降解后產生的酸性環境引起無菌性炎癥[19-20]，與MTT法檢測結果一致。定量檢測植入后材料包膜厚度、炎性細胞數及血管面積顯示，雖然兩組包膜厚度無顯著差異，但PLA組2、4、8周炎性細胞數均高于PLA/BMG組，表明PLA組炎性反應強、組織相容性差，而PLA/BMG多孔復合材料對機體的異物刺激小，與機體有較好相容性。而兩組間包膜厚度無顯著差異，可能與植入樣品體積小，機體對其反應程度不劇烈有關。兩組間血管面積僅8周時差異有統計學意義，PLA/BMG組組內2周和4、8周間差異有統計學意義，提示PLA/BMG組2周后血管快速長入，而PLA組血管長入無明顯變化，反映PLA/BMG多孔復合材料較PLA材料有更好的組織親和性，利于引導營養物質和干細胞的長入。PLA/BMG組可觀察到間充質細胞向材料內BMG顆粒的貼附，此為誘導成骨的初期反應，但未觀察到明顯成骨，可能與植入部位和皮下有關，而常用來檢測異位成骨的實驗模型為肌袋植入[21-22]，因此有待進一步采用肌袋植入提供詳細實驗數據。
綜上述，體內動物實驗及體外細胞實驗表明PLA材料及PLA/BMG多孔復合材料均有較好的組織相容性及細胞相容性，但PLA/BMG多孔復合材料較單一PLA材料的生物相容性更佳，達到了復合不同材料取長補短的目的。
