引用本文： 陳甫寰, 岳曉彤, 宋慧鋒, 柴家科, 何秀葉, 王統民, 劉玲英. 表皮干細胞向汗腺細胞分化的表型改變及其通路機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(2): 245-250. doi: 10.7507/1002-1892.20160049 復制
大面積深度燒傷創面愈合后汗腺缺失導致的體溫調節障礙，是亟待解決的嚴重影響患者生存質量的問題。近年來干細胞與再生醫學領域研究的飛速發展，使得汗腺重建成為可能[1-2]。表皮干細胞（epidermal stem cells，ESCs）作為皮膚的特異性干細胞，具有包括向汗腺細胞（sweat gland cells，SGCs）、成纖維細胞及毛囊干細胞等多向分化的潛能[3]。并且有研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）中的細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信號通路在汗腺的發生和發育過程中起著重要作用[4-5]。本研究在既往研究基礎上，誘導成人皮膚ESCs向SGCs分化，探討分化過程中ESCs表型的改變，并對MAPK/ERK通路的變化情況進行初步研究，為創面的功能性愈合提供新的思路和實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及主要試劑、儀器
健康成人包皮和全層皮膚取自解放軍總醫院第一附屬醫院行包皮環切和全厚皮膚移植的患者，均取得醫院倫理委員會批準和患者知情同意。
DMEM/F12基礎培養基、FBS、胰蛋白酶-EDTA、無血清細胞培養基（keratinocyte serum free medium，K-SFM）、EGF、中性蛋白酶（GIBCO公司，美國）；PBS、青霉素/鏈霉素/兩性霉素B三抗（PAA公司，美國）；Ⅳ型膠原、Ⅱ型膠原酶、PD98059（Sigma公司、美國）；β1整合素受體單克隆抗體、角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）受體單克隆抗體、CK7受體單克隆抗體、CK18受體單克隆抗體、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）受體單克隆抗體（Abcam公司，英國）；RIPA裂解液（谷歌生物科技有限公司）。倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；離心機（Kubota公司，日本）；流式檢測儀（BD Facsverse公司，美國）；Image Pro-plus6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）；生物凈化工作臺（北京偉達凈化研究所）。
1.2 ESCs及SGCs的體外分離培養及鑒定
1.2.1 ESCs分離培養及鑒定
取健康成人包皮去除皮下組織，修剪成1 cm×1 cm大小的皮片，中性蛋白酶4℃消化10～12 h，分離表皮和真皮層；0.125%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化表皮15～20 min。以離心半徑10 cm、1 300 r/min離心5 min后收集細胞，接種于預先用Ⅳ型膠原鋪板的6孔板，K-SFM培養，待細胞生長融合至70%～80%時傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化。取第3代細胞，采用β1整合素、CK19及p63免疫熒光染色法對培養細胞進行鑒定。
1.2.2 SGCs分離培養及鑒定
取健康成人全層皮膚去除皮下組織，修剪為1 mm×1 mm大小的皮片，5 mLⅡ型膠原酶液（2 g/L）消化，4℃冰箱過夜。倒置相差顯微鏡下用微量移液器挑取汗腺，加入600～800 μL DMEM/F12基礎培養基，待汗腺組織貼壁后在6孔板中補加相同培養基1.5 mL。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化。待細胞長滿6孔板時使用0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化細胞，以離心半徑10 cm、800 r/min離心3 min后收集細胞并傳代，每3天換液，收集第1代細胞上清液，4℃冰箱保存待用。取第1代細胞采用CK7、CK18、CK19和CEA免疫熒光染色法對培養細胞進行鑒定。
1.3 ESCs誘導分化的表型和MAPK/ERK通路檢測
1.3.1 實驗分組
取第2代ESCs分為4組（由同一株細胞傳代而來），按1×106個/mL密度接種于Transwell共培養系統的下室，將Transwell的上室置于下室孔內，按1×106個/mL密度接種第1代SGCs于上室中，上、下室以DMEM/F12基礎培養基相互通融，建立ESCs與SGCs共培養體系，每3天換液1次。A組通過Transwell共培養系統將兩種細胞共培養；B組直接于6孔培養板中加入第1代SGCs上清液培養ESCs；C組在A組基礎上加入濃度為60 ng/mL的EGF；D組在A組基礎上加入濃度為10 mmol/L的PD98059。
1.3.2 倒置相差顯微鏡觀察
培養期間采用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態學變化。
1.3.3 流式細胞儀檢測
各組培養14 d后，采用流式細胞術檢測各組ESCs的CEA和β1整合素表達陽性率；同時檢測同批次的第2代ESCs作為分化前對照組。其中CEA、β1整合素受體單克隆抗體（1∶100） 孵育40 min，PBS清洗細胞；FITC熒光二抗（1∶100） 避光孵育40 min，PBS清洗后上機檢測。
1.3.4 信號通路的Western blot檢測
采用Western blot檢測各組ERK及磷酸化ERK（phosphorylation ERK，P-ERK）表達。取A、C、D組Transwell下室的細胞和B組培養板中的細胞，PBS沖洗，加入RIPA裂解液；冰浴30 min，12 000×g離心5 min后收集上清，SDS-PAGE電泳，灌膠、上樣電泳至溴酚藍出現，進行轉膜，300 mA恒流轉膜30 min，25?V恒壓轉膜過夜。室溫下脫色，封閉1 h，稀釋一抗，4℃孵育過夜，PBS清洗；稀釋二抗，室溫下孵育30 min，PBS清洗，每次5 min。TTBS液沖洗后曝片，膠片用掃描儀成像，Image Pro-plus6.0圖像分析軟件分析灰度值，結果以目的蛋白與β-actin的灰度值比值表示，并且定義A組為標準數1，其他3組數據以與A組的倍數表示。
1.4 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ESCs形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察示，培養細胞24 h貼壁，10 d左右長滿6孔板。細胞外觀呈卵圓形且透亮，細胞之間連接緊密，呈“鋪路石”樣排列；原代與傳代細胞形態無明顯差異。見圖 1。第3代細胞經免疫熒光染色，強烈表達β1整合素，同時表達CK19及p63，全部染色均以DAPI染核，提示培養細胞為ESCs。見圖 2。
圖1
ESCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×50） ?原代細胞 ?第2代細胞 ? ?圖 2 第3代ESCs免疫熒光染色鑒定（熒光顯微鏡×200） ?CK19 ?p63 ?β1整合素 ? ?圖 3 SGCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×50） ?原代細胞 ?細胞生長過程中混雜成纖維細胞生長 ?第2代細胞成纖維化 ? ?圖 4 第1代SGCs免疫熒光染色鑒定（熒光顯微鏡×200） ?CEA ?CK19 ?CK7 ?CK18
Figure1.
ESCs morphology observation (Inverted phase contrast microscope×50) ?Primary cells ?The 2nd passage cells ? ?Fig. 2 Immunofluorescence staining of the 3rd passage ESCs (Fluorescence microscope×200) ?CK19 ?p63 ?β1-integrin ? ?Fig. 3 SGCs morphology observation (Inverted phase contrast microscope×50) ?Primary cells ?Mixed fibroblasts growth ?Fibre-like at passage 2 SGCs ? ?Fig. 4 Immunofluorescence staining of the 1st passage SGCs (Fluorescence microscope×200) ?CEA ?CK19 ?CK7 ?CK18
2.2 SGCs形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察示，正常汗腺組織呈卷曲狀，2～3 d開始貼壁，20 d左右長滿6孔板。細胞呈扁平多角形結構，相鄰細胞膜相互貼附緊密；增殖期間易有成纖維細胞混雜生長；與原代SGCs比較，第2代SGCs已開始成纖維化。見圖 3。第1 代細胞經免疫熒光染色，強烈表達CEA，同時表達CK19、CK7及CK18，全部染色均以DAPI染核，提示培養細胞為SGCs。見圖 4。
2.3 ESCs誘導分化的表型和MAPK/ERK通路檢測
2.3.1 倒置相差顯微鏡觀察
A、C、D組培養后細胞形態變化相似，9 d后細胞失去ESCs卵圓形且透亮的結構，開始出現扁平多角形結構改變。B組形態變化較慢，培養12 d后與其他3組結構相似。見圖 5。
圖2
共培養后各組細胞形態學變化（倒置相差顯微鏡×50） ?A組3 d ?A組7 d ?A組9 d ?B組3 d ?B組7 d ?B組12?d
Figure2.
Morphological changes after co-culturing of each group (Inverted phase contrast microscope×50) ?Group A at 3 days ?Group A at 7?days ?Group A at 9?days ?Group B at 3 days ?Group B at 7 days ?Group B at 12 days
2.3.2 流式細胞儀檢測
分化前對照組β1整合素明顯高表達，CEA幾乎不表達，與A～D組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。B組經上清液培養后，與分化前對照組相比，ESCs的β1整合素表達下降、CEA表達增高，但其β1整合素表達仍顯著高于A、C、D組，CEA表達明顯低于其余3組，差異均有統計學意義（P<0.05）。A、C、D組中，C組CEA表達最低、β1整合素表達最高，D組CEA表達最高、β1整合素表達最低，3組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
流式細胞儀檢測共培養前后ESCsβ1整合素和CEA陽性率（n=5，%，2.3.3 Western blot檢測ESCs分化過程中表型轉化的MAPK/ERK信號通路
各組均有較高水平ERK表達，但B組明顯低于其余3組，差異有統計學意義（P<0.05）；其余3組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。P-ERK表達A組最高、C組最低，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6、表 2。
圖3
Western blot檢測各組ESCs分化過程中表型轉化的MAPK/ERK信號通路 1：A組 2：B組 3：C組 4：D組
Figure3.
MAPK/ERK pathway in ESCs differentiation by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
表2
Western blot檢測各組細胞ESCs分化過程中表型轉化的MAPK/erk信號通路（n=5，3 討論
大面積深度燒傷患者創面愈合后生存質量低下，損傷區汗腺缺失導致體溫調節功能障礙是原因之一，因此汗腺構建是臨床上亟待解決的重要問題。既往研究表明，ESCs作為皮膚中的多能干細胞，具有高度的增殖能力、多向分化潛能、自我更新能力以及低免疫原性等特點，在皮膚創面修復中發揮重要作用[6-7]。
“龕影學說”認為干細胞所處微環境有著較好的誘導分化作用，當干細胞處于某一特定微環境時，接受其分化信號，可對分化細胞進行某些特定變化[8]。目前尚未發現汗腺樣細胞的特異性標志，但研究表明，CEA只在汗腺導管部和分泌部的管腔表達，在表皮的其他部位不表達[9]，在ESCs也不表達，因此本實驗選擇CEA作為ESCs分化程度的檢測指標。β1整合素作為ESCs相對特異性表面標記物已被研究證實[10]，其在ESCs的細胞表面呈現高表達狀態，而在終末分化細胞表面則不表達，因此本實驗將β1整合素作為反向觀察指標以證實ESCs向SGCs分化的表型改變情況。本研究結果顯示，單純使用第1 代SGCs上清液培養SGCs，其表型未發生明顯改變，但通過Transwell共培養系統中細胞與細胞間的相互作用后，表型發生顯著改變，說明細胞與細胞之間相互作用在ESCs的誘導分化中扮演著非常重要的角色。
MAPK/erk通路通過三級磷酸化級聯反應作為主體，構成經典的介導細胞由外到內的重要信號轉導通路，主要調節細胞增殖和凋亡[11-12]。研究表明，β1整合素的表達水平和MAPK/erk的活性高低直接決定著ESCs的增殖和分化能力[13-14]。EGF可促進ESCs的增殖，誘導ERK磷酸化，可作為MAPK/erk通路的相對促進劑。PD98059作為MAPK/erk通路的抑制劑，也已廣泛應用于ERK1/2的研究中，主要通過阻斷ERK磷酸化而發揮作用[15-22]。本研究采用Western blot法測定ESCs中ERK的水平，同時應用PD98059和EGF從正反兩個方向影響該通路，觀察它們對于ESCs表型轉化的影響。結果表明，SGCs與ESCs共培養過程中可激活ESCs中的ERK通路，PD98059可抑制MAPK/erk通路的磷酸化，使其活性降低，促使ESCs退出干細胞群落，向SGCs方向分化；流式細胞術檢測結果顯示ESCs中CEA的表達明顯增多，β1整合素明顯降低。相反，EGF可以激活MAPK通路，維持ESCs向增殖方向發展，抑制ESCs向SGCs分化，因此C組ESCs中的CEA表達少于D組，說明抑制MAPK/erk通路的磷酸化在ESCs向SGCs分化過程中的重要作用。
本研究結果表明，在合適條件下，ESCs可經誘導分化為SGCs，其表型發生相應改變；通過對MAPK/erk通路的控制，可以調節ESCs的分化方向和程度。但汗腺重建是一個復雜過程，其機制尚需要進一步研究予以明確。
大面積深度燒傷創面愈合后汗腺缺失導致的體溫調節障礙，是亟待解決的嚴重影響患者生存質量的問題。近年來干細胞與再生醫學領域研究的飛速發展，使得汗腺重建成為可能[1-2]。表皮干細胞（epidermal stem cells，ESCs）作為皮膚的特異性干細胞，具有包括向汗腺細胞（sweat gland cells，SGCs）、成纖維細胞及毛囊干細胞等多向分化的潛能[3]。并且有研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）中的細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信號通路在汗腺的發生和發育過程中起著重要作用[4-5]。本研究在既往研究基礎上，誘導成人皮膚ESCs向SGCs分化，探討分化過程中ESCs表型的改變，并對MAPK/ERK通路的變化情況進行初步研究，為創面的功能性愈合提供新的思路和實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及主要試劑、儀器
健康成人包皮和全層皮膚取自解放軍總醫院第一附屬醫院行包皮環切和全厚皮膚移植的患者，均取得醫院倫理委員會批準和患者知情同意。
DMEM/F12基礎培養基、FBS、胰蛋白酶-EDTA、無血清細胞培養基（keratinocyte serum free medium，K-SFM）、EGF、中性蛋白酶（GIBCO公司，美國）；PBS、青霉素/鏈霉素/兩性霉素B三抗（PAA公司，美國）；Ⅳ型膠原、Ⅱ型膠原酶、PD98059（Sigma公司、美國）；β1整合素受體單克隆抗體、角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）受體單克隆抗體、CK7受體單克隆抗體、CK18受體單克隆抗體、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）受體單克隆抗體（Abcam公司，英國）；RIPA裂解液（谷歌生物科技有限公司）。倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；離心機（Kubota公司，日本）；流式檢測儀（BD Facsverse公司，美國）；Image Pro-plus6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）；生物凈化工作臺（北京偉達凈化研究所）。
1.2 ESCs及SGCs的體外分離培養及鑒定
1.2.1 ESCs分離培養及鑒定
取健康成人包皮去除皮下組織，修剪成1 cm×1 cm大小的皮片，中性蛋白酶4℃消化10～12 h，分離表皮和真皮層；0.125%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化表皮15～20 min。以離心半徑10 cm、1 300 r/min離心5 min后收集細胞，接種于預先用Ⅳ型膠原鋪板的6孔板，K-SFM培養，待細胞生長融合至70%～80%時傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化。取第3代細胞，采用β1整合素、CK19及p63免疫熒光染色法對培養細胞進行鑒定。
1.2.2 SGCs分離培養及鑒定
取健康成人全層皮膚去除皮下組織，修剪為1 mm×1 mm大小的皮片，5 mLⅡ型膠原酶液（2 g/L）消化，4℃冰箱過夜。倒置相差顯微鏡下用微量移液器挑取汗腺，加入600～800 μL DMEM/F12基礎培養基，待汗腺組織貼壁后在6孔板中補加相同培養基1.5 mL。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化。待細胞長滿6孔板時使用0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化細胞，以離心半徑10 cm、800 r/min離心3 min后收集細胞并傳代，每3天換液，收集第1代細胞上清液，4℃冰箱保存待用。取第1代細胞采用CK7、CK18、CK19和CEA免疫熒光染色法對培養細胞進行鑒定。
1.3 ESCs誘導分化的表型和MAPK/ERK通路檢測
1.3.1 實驗分組
取第2代ESCs分為4組（由同一株細胞傳代而來），按1×106個/mL密度接種于Transwell共培養系統的下室，將Transwell的上室置于下室孔內，按1×106個/mL密度接種第1代SGCs于上室中，上、下室以DMEM/F12基礎培養基相互通融，建立ESCs與SGCs共培養體系，每3天換液1次。A組通過Transwell共培養系統將兩種細胞共培養；B組直接于6孔培養板中加入第1代SGCs上清液培養ESCs；C組在A組基礎上加入濃度為60 ng/mL的EGF；D組在A組基礎上加入濃度為10 mmol/L的PD98059。
1.3.2 倒置相差顯微鏡觀察
培養期間采用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態學變化。
1.3.3 流式細胞儀檢測
各組培養14 d后，采用流式細胞術檢測各組ESCs的CEA和β1整合素表達陽性率；同時檢測同批次的第2代ESCs作為分化前對照組。其中CEA、β1整合素受體單克隆抗體（1∶100） 孵育40 min，PBS清洗細胞；FITC熒光二抗（1∶100） 避光孵育40 min，PBS清洗后上機檢測。
1.3.4 信號通路的Western blot檢測
采用Western blot檢測各組ERK及磷酸化ERK（phosphorylation ERK，P-ERK）表達。取A、C、D組Transwell下室的細胞和B組培養板中的細胞，PBS沖洗，加入RIPA裂解液；冰浴30 min，12 000×g離心5 min后收集上清，SDS-PAGE電泳，灌膠、上樣電泳至溴酚藍出現，進行轉膜，300 mA恒流轉膜30 min，25?V恒壓轉膜過夜。室溫下脫色，封閉1 h，稀釋一抗，4℃孵育過夜，PBS清洗；稀釋二抗，室溫下孵育30 min，PBS清洗，每次5 min。TTBS液沖洗后曝片，膠片用掃描儀成像，Image Pro-plus6.0圖像分析軟件分析灰度值，結果以目的蛋白與β-actin的灰度值比值表示，并且定義A組為標準數1，其他3組數據以與A組的倍數表示。
1.4 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ESCs形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察示，培養細胞24 h貼壁，10 d左右長滿6孔板。細胞外觀呈卵圓形且透亮，細胞之間連接緊密，呈“鋪路石”樣排列；原代與傳代細胞形態無明顯差異。見圖 1。第3代細胞經免疫熒光染色，強烈表達β1整合素，同時表達CK19及p63，全部染色均以DAPI染核，提示培養細胞為ESCs。見圖 2。
圖1
ESCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×50） ?原代細胞 ?第2代細胞 ? ?圖 2 第3代ESCs免疫熒光染色鑒定（熒光顯微鏡×200） ?CK19 ?p63 ?β1整合素 ? ?圖 3 SGCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×50） ?原代細胞 ?細胞生長過程中混雜成纖維細胞生長 ?第2代細胞成纖維化 ? ?圖 4 第1代SGCs免疫熒光染色鑒定（熒光顯微鏡×200） ?CEA ?CK19 ?CK7 ?CK18
Figure1.
ESCs morphology observation (Inverted phase contrast microscope×50) ?Primary cells ?The 2nd passage cells ? ?Fig. 2 Immunofluorescence staining of the 3rd passage ESCs (Fluorescence microscope×200) ?CK19 ?p63 ?β1-integrin ? ?Fig. 3 SGCs morphology observation (Inverted phase contrast microscope×50) ?Primary cells ?Mixed fibroblasts growth ?Fibre-like at passage 2 SGCs ? ?Fig. 4 Immunofluorescence staining of the 1st passage SGCs (Fluorescence microscope×200) ?CEA ?CK19 ?CK7 ?CK18
2.2 SGCs形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察示，正常汗腺組織呈卷曲狀，2～3 d開始貼壁，20 d左右長滿6孔板。細胞呈扁平多角形結構，相鄰細胞膜相互貼附緊密；增殖期間易有成纖維細胞混雜生長；與原代SGCs比較，第2代SGCs已開始成纖維化。見圖 3。第1 代細胞經免疫熒光染色，強烈表達CEA，同時表達CK19、CK7及CK18，全部染色均以DAPI染核，提示培養細胞為SGCs。見圖 4。
2.3 ESCs誘導分化的表型和MAPK/ERK通路檢測
2.3.1 倒置相差顯微鏡觀察
A、C、D組培養后細胞形態變化相似，9 d后細胞失去ESCs卵圓形且透亮的結構，開始出現扁平多角形結構改變。B組形態變化較慢，培養12 d后與其他3組結構相似。見圖 5。
圖2
共培養后各組細胞形態學變化（倒置相差顯微鏡×50） ?A組3 d ?A組7 d ?A組9 d ?B組3 d ?B組7 d ?B組12?d
Figure2.
Morphological changes after co-culturing of each group (Inverted phase contrast microscope×50) ?Group A at 3 days ?Group A at 7?days ?Group A at 9?days ?Group B at 3 days ?Group B at 7 days ?Group B at 12 days
2.3.2 流式細胞儀檢測
分化前對照組β1整合素明顯高表達，CEA幾乎不表達，與A～D組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。B組經上清液培養后，與分化前對照組相比，ESCs的β1整合素表達下降、CEA表達增高，但其β1整合素表達仍顯著高于A、C、D組，CEA表達明顯低于其余3組，差異均有統計學意義（P<0.05）。A、C、D組中，C組CEA表達最低、β1整合素表達最高，D組CEA表達最高、β1整合素表達最低，3組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
流式細胞儀檢測共培養前后ESCsβ1整合素和CEA陽性率（n=5，%，2.3.3 Western blot檢測ESCs分化過程中表型轉化的MAPK/ERK信號通路
各組均有較高水平ERK表達，但B組明顯低于其余3組，差異有統計學意義（P<0.05）；其余3組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。P-ERK表達A組最高、C組最低，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6、表 2。
圖3
Western blot檢測各組ESCs分化過程中表型轉化的MAPK/ERK信號通路 1：A組 2：B組 3：C組 4：D組
Figure3.
MAPK/ERK pathway in ESCs differentiation by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
表2
Western blot檢測各組細胞ESCs分化過程中表型轉化的MAPK/erk信號通路（n=5，3 討論
大面積深度燒傷患者創面愈合后生存質量低下，損傷區汗腺缺失導致體溫調節功能障礙是原因之一，因此汗腺構建是臨床上亟待解決的重要問題。既往研究表明，ESCs作為皮膚中的多能干細胞，具有高度的增殖能力、多向分化潛能、自我更新能力以及低免疫原性等特點，在皮膚創面修復中發揮重要作用[6-7]。
“龕影學說”認為干細胞所處微環境有著較好的誘導分化作用，當干細胞處于某一特定微環境時，接受其分化信號，可對分化細胞進行某些特定變化[8]。目前尚未發現汗腺樣細胞的特異性標志，但研究表明，CEA只在汗腺導管部和分泌部的管腔表達，在表皮的其他部位不表達[9]，在ESCs也不表達，因此本實驗選擇CEA作為ESCs分化程度的檢測指標。β1整合素作為ESCs相對特異性表面標記物已被研究證實[10]，其在ESCs的細胞表面呈現高表達狀態，而在終末分化細胞表面則不表達，因此本實驗將β1整合素作為反向觀察指標以證實ESCs向SGCs分化的表型改變情況。本研究結果顯示，單純使用第1 代SGCs上清液培養SGCs，其表型未發生明顯改變，但通過Transwell共培養系統中細胞與細胞間的相互作用后，表型發生顯著改變，說明細胞與細胞之間相互作用在ESCs的誘導分化中扮演著非常重要的角色。
MAPK/erk通路通過三級磷酸化級聯反應作為主體，構成經典的介導細胞由外到內的重要信號轉導通路，主要調節細胞增殖和凋亡[11-12]。研究表明，β1整合素的表達水平和MAPK/erk的活性高低直接決定著ESCs的增殖和分化能力[13-14]。EGF可促進ESCs的增殖，誘導ERK磷酸化，可作為MAPK/erk通路的相對促進劑。PD98059作為MAPK/erk通路的抑制劑，也已廣泛應用于ERK1/2的研究中，主要通過阻斷ERK磷酸化而發揮作用[15-22]。本研究采用Western blot法測定ESCs中ERK的水平，同時應用PD98059和EGF從正反兩個方向影響該通路，觀察它們對于ESCs表型轉化的影響。結果表明，SGCs與ESCs共培養過程中可激活ESCs中的ERK通路，PD98059可抑制MAPK/erk通路的磷酸化，使其活性降低，促使ESCs退出干細胞群落，向SGCs方向分化；流式細胞術檢測結果顯示ESCs中CEA的表達明顯增多，β1整合素明顯降低。相反，EGF可以激活MAPK通路，維持ESCs向增殖方向發展，抑制ESCs向SGCs分化，因此C組ESCs中的CEA表達少于D組，說明抑制MAPK/erk通路的磷酸化在ESCs向SGCs分化過程中的重要作用。
本研究結果表明，在合適條件下，ESCs可經誘導分化為SGCs，其表型發生相應改變；通過對MAPK/erk通路的控制，可以調節ESCs的分化方向和程度。但汗腺重建是一個復雜過程，其機制尚需要進一步研究予以明確。
