引用本文： 尹凱, 申傳安, 馬麗, 尚玉茹, 李大偉, 李龍珠, 趙東旭, 程文鳳. 自體表皮細胞懸液移植修復全層皮膚缺損創面的動物實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(2): 219-223. doi: 10.7507/1002-1892.20160045 復制
自體皮匱乏是特大面積深度燒傷治療困難的根本原因，表皮細胞培養與移植技術可為大面積深度燒傷的治療提供充足皮源[1-2]。但目前對表皮細胞懸液移植時的細胞密度尚存在爭議[3-5]。本研究擬通過移植不同細胞密度的自體表皮細胞懸液修復大鼠全層皮膚缺損創面，比較修復效果，探討創面修復適宜的表皮細胞移植密度，為該技術的臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
健康清潔級成年SD大鼠40只，健康清潔級成年Wistar大鼠20只，雌雄不限，體質量210～ 230?g；均由軍事醫學科學院動物中心提供。
限制性角質形成細胞無血清培養基（defined keratinocyte-serum free medium，DK-SFM）、H-DMEM、FBS、中性蛋白酶（GIBCO公司，美國）；兔抗鼠Ⅳ型膠原多克隆抗體、兔抗鼠Ⅶ型膠原多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；Ⅰ型膠原（BD公司，美國）；PBS、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B（北京邁晨科技有限公司）。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image J圖像分析軟件（National Institutes of Health，美國）。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 實驗分組
根據細胞移植密度不同，將40只SD大鼠采用隨機數字表法分為高、中、低細胞密度及空白組（分別為A、B、C、D組），每組10只。A、B、C組細胞移植密度分別為1×106、1×105、1×104 個/cm2，空白組給予DK-SFM。
1.2.2 表皮細胞分離培養及鑒定
4組SD大鼠經腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.10～0.15 mL/100 g）麻醉后，背部去毛，切取大小為3 cm×1 cm的全層皮膚，創面直接拉攏縫合。將獲得的全層皮膚清洗、消毒后，剪成0.3 cm×0.3 cm大小，加入1.25 g/L中性蛋白酶，4℃放置16 h，分離表皮與真皮。將表皮剪碎，置于2.5 g/L胰蛋白酶中，37℃消化5～10 min，加入含10%FBS的H-DMEM培養液終止消化，吹打，先后用200、400目篩網過濾；以離心半徑10 cm、1?200?r/ min離心5 min，吸棄上清液，收集細胞，加入DK-SFM重新懸浮細胞，以1×105個/mL將細胞接種于10 ng/ mLⅠ型膠原包被的6孔板中，置于常規條件培養箱中培養。經流式細胞術鑒定分離培養的細胞為大鼠表皮細胞。
1.2.3 組織移植
取20只Wistar大鼠同上法麻醉后，背部去毛，每只切取2塊大小為3 cm×3 cm的全層皮膚，修剪成中厚皮并打孔，備用。4組SD大鼠取皮后1周，同上法再次麻醉、背部去毛，切除3.3?cm×3.0 cm大小的背部全層皮膚，于創面內緣皮下埋入3.3 cm×3.0 cm大小的鋼絲圈，防止創面收縮[6]。取0.2 mL對應密度的自體表皮細胞懸液或DK-SFM，均勻噴灑于背部創面，然后以制備的同種異體皮覆蓋創面，最后覆蓋凡士林紗條及敷料。術后每天消毒換藥。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察4組大鼠存活情況。于7、14、21 d觀察各組大鼠背部同種異體皮成活、脫落及創面愈合情況。同種異體皮脫落后，創面照相并用Image J圖像分析軟件測量創面愈合面積，根據以下公式計算創面愈合率：創面愈合面積/原創面面積×100%。
1.3.2 組織學觀察
術后21 d頸椎脫臼法處死全部大鼠，完整切取創面皮膚組織，置于10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片，片厚3 μm。取部分切片，常規HE染色，光鏡下觀察創面組織形態結構。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
術后21 d取剩余切片行免疫組織化學染色，一抗為兔抗鼠Ⅳ型膠原多克隆抗體（1∶200）、兔抗鼠Ⅶ型膠原多克隆抗體（1∶200）。光鏡下觀察創面組織中表皮-真皮連接層Ⅳ型膠原和Ⅶ型膠原表達情況，以棕褐色染色為陽性表達。每組取3張不同大鼠切片，于400倍鏡下每張切片隨機選擇不重疊的10個視野，人工計數陽性著色細胞，按以下公式計算陽性細胞百分比：陽性細胞數/總細胞數×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后大鼠均存活至實驗完成。術后7 d，各組大鼠創面同種異體皮均成活，顏色紅潤。14 d，同種異體皮干燥并開始脫痂，創面可見散在片狀皮島。21?d，同種異體皮基本脫落，同種異體皮脫落后A、B組創面表面光滑，可見成片上皮，與皮下連接緊密；C組創面可見少量菲薄上皮，殘留部分肉芽創面；D組創面肉芽組織新鮮，無上皮形成。見圖 1～3。
圖1
術后7 d各組創面大體觀察 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 2 術后14 d各組創面大體觀察 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 3 術后21 d各組創面大體觀察 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組
Figure1.
The general observation of the wound in each group at 7 days after operation ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 2 The general observation of the wound in each group at 14 days after operation ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 3 The general observation of the wound in each group at 21 days after operation ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D
術后21 d同種異體皮脫落后測量各組創面愈合率，A、B、C、D組分別為62.9%±9.6%、64.2%± 9.1%、38.5%±5.7%、22.7%±5.5%。A、B組創面愈合率顯著高于C、D組，C組高于D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 組織學觀察
術后21 d，A、B、C組創面上皮層可見鱗狀上皮細胞，其下可見多層纖維組織，含有大量成纖維細胞。其中A、B組表皮分層明顯，表皮層厚度不均，且細胞排列疏松；C組鱗狀上皮細胞含量較少，表皮層薄，可見較多炎性細胞浸潤。D組均為肉芽組織。見圖 4。
2.3 免疫組織化學染色觀察
術后21 d，A、B、C組表皮-真皮連接層Ⅳ、Ⅶ型膠原表達呈陽性；D組無表皮層，呈陰性。見圖 5、6。A、B、C組Ⅳ型膠原表達陽性細胞百分比分別為65.1%±7.6%、61.8%±8.1%、53.2%±9.1%；Ⅶ型膠原表達陽性細胞百分比分別為62.2%±7.1%、61.6%±8.5%、51.9%±6.9%。A、B組均顯著高于C組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
術后21 d各組創面組織學觀察（HE×100） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 5 術后21 d各組創面Ⅳ型膠原免疫組織化學染色觀察（×100） 箭頭示陽性表達 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 6 術后21 d各組創面Ⅶ型膠原免疫組織化學染色觀察（×100） 箭頭示陽性表達 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組
Figure2.
Histological observation of each group at 21 days after operation (HE×100) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 5 Immunohistochemistry observation for collagen type IV in each group at 21 days after operation (×100) Arrow indicated positive expression ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 6 Immunohistochemistry observation for collagen type VII in each group at 21 days after operation (×100) Arrow indicated positive expression ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D
3 討論
自體皮匱乏是特大面積深度燒傷救治困難的根本原因，繼各種皮片、皮瓣、自體微粒皮移植技術[7-11]應用后，近年又興起表皮細胞培養及體外構建組織工程皮膚技術[12-14]。表皮細胞是構成皮膚表皮的主要細胞，其增殖、分化維系著表皮正常結構和生理功能，同時也是創面愈合過程中的重要種子細胞，可直接應用于創面修復[15]。表皮細胞懸液移植技術通過在體外擴增表皮細胞，極大提高了殘存自體皮的使用效率，同時它可表達多種整合素和生長因子，促進細胞黏附和增殖[16-17]，為特大面積深度燒傷患者的救治提供了新思路。
本實驗采用大鼠全層皮膚缺損創面抗攣縮模型[6]，可以防止創面收縮，有利于創面愈合指標的觀察。同時采用同種異體皮作為生物敷料覆蓋創面，移植后呈白色，后轉為紅潤，說明血管長入，同種異體皮的成活為移植于創面的自體表皮細胞提供了良好的生存環境。隨后同種異體皮最終因機體免疫排斥反應干燥脫落。本實驗觀察到同種異體皮脫落后，A、B、C組有成片上皮形成，說明自體表皮細胞作為成體組織中具有自我更新和一定分化潛能的細胞，克服了同種異體表皮細胞移植的免疫排斥反應及應用的倫理問題[18]，其細胞懸液可直接用于修復全層皮膚缺損創面。
結合既往相關研究[19]，本實驗設計了3個梯度移植密度。結果表明，在表皮細胞移植后14 d，同種異體皮開始脫落，創面可見散在片狀皮島；隨時間延長，皮島面積不斷擴大，逐漸修復殘余創面。組織切片HE染色示，表皮細胞移植可形成表皮層，起到覆蓋創面作用；當移植密度不足時，表皮層較薄，暴露了部分創面，可能是引起炎性細胞浸潤的原因之一。根據既往研究[20]，Ⅳ型和Ⅶ型膠原主要由表皮細胞合成，是構成基底膜的主要成分，其陽性表達說明表皮層成熟度高。本研究免疫組織化學染色示，A、B、C組表皮-真皮連接層Ⅳ型膠原和Ⅶ型膠原的表達呈陽性，D組呈陰性，說明自體表皮細胞懸液在移植后參與創面修復，并使缺損創面的皮膚重構。免疫組織化學染色半定量分析顯示C組Ⅳ型和Ⅶ型膠原表達較少，顯著低于A、B組，可能與移植細胞量較少有關。進一步結合創面愈合率和組織學觀察評價，表明A、B組創面愈合質量優于C組，但A、B組差異無統計學意義，提示1.0×105個/cm2為適宜的表皮細胞移植密度，按照該密度移植自體表皮細胞懸液可有效修復大鼠全層皮膚缺損創面，重構創面皮膚。
自體皮匱乏是特大面積深度燒傷治療困難的根本原因，表皮細胞培養與移植技術可為大面積深度燒傷的治療提供充足皮源[1-2]。但目前對表皮細胞懸液移植時的細胞密度尚存在爭議[3-5]。本研究擬通過移植不同細胞密度的自體表皮細胞懸液修復大鼠全層皮膚缺損創面，比較修復效果，探討創面修復適宜的表皮細胞移植密度，為該技術的臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
健康清潔級成年SD大鼠40只，健康清潔級成年Wistar大鼠20只，雌雄不限，體質量210～ 230?g；均由軍事醫學科學院動物中心提供。
限制性角質形成細胞無血清培養基（defined keratinocyte-serum free medium，DK-SFM）、H-DMEM、FBS、中性蛋白酶（GIBCO公司，美國）；兔抗鼠Ⅳ型膠原多克隆抗體、兔抗鼠Ⅶ型膠原多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；Ⅰ型膠原（BD公司，美國）；PBS、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B（北京邁晨科技有限公司）。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image J圖像分析軟件（National Institutes of Health，美國）。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 實驗分組
根據細胞移植密度不同，將40只SD大鼠采用隨機數字表法分為高、中、低細胞密度及空白組（分別為A、B、C、D組），每組10只。A、B、C組細胞移植密度分別為1×106、1×105、1×104 個/cm2，空白組給予DK-SFM。
1.2.2 表皮細胞分離培養及鑒定
4組SD大鼠經腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.10～0.15 mL/100 g）麻醉后，背部去毛，切取大小為3 cm×1 cm的全層皮膚，創面直接拉攏縫合。將獲得的全層皮膚清洗、消毒后，剪成0.3 cm×0.3 cm大小，加入1.25 g/L中性蛋白酶，4℃放置16 h，分離表皮與真皮。將表皮剪碎，置于2.5 g/L胰蛋白酶中，37℃消化5～10 min，加入含10%FBS的H-DMEM培養液終止消化，吹打，先后用200、400目篩網過濾；以離心半徑10 cm、1?200?r/ min離心5 min，吸棄上清液，收集細胞，加入DK-SFM重新懸浮細胞，以1×105個/mL將細胞接種于10 ng/ mLⅠ型膠原包被的6孔板中，置于常規條件培養箱中培養。經流式細胞術鑒定分離培養的細胞為大鼠表皮細胞。
1.2.3 組織移植
取20只Wistar大鼠同上法麻醉后，背部去毛，每只切取2塊大小為3 cm×3 cm的全層皮膚，修剪成中厚皮并打孔，備用。4組SD大鼠取皮后1周，同上法再次麻醉、背部去毛，切除3.3?cm×3.0 cm大小的背部全層皮膚，于創面內緣皮下埋入3.3 cm×3.0 cm大小的鋼絲圈，防止創面收縮[6]。取0.2 mL對應密度的自體表皮細胞懸液或DK-SFM，均勻噴灑于背部創面，然后以制備的同種異體皮覆蓋創面，最后覆蓋凡士林紗條及敷料。術后每天消毒換藥。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察4組大鼠存活情況。于7、14、21 d觀察各組大鼠背部同種異體皮成活、脫落及創面愈合情況。同種異體皮脫落后，創面照相并用Image J圖像分析軟件測量創面愈合面積，根據以下公式計算創面愈合率：創面愈合面積/原創面面積×100%。
1.3.2 組織學觀察
術后21 d頸椎脫臼法處死全部大鼠，完整切取創面皮膚組織，置于10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片，片厚3 μm。取部分切片，常規HE染色，光鏡下觀察創面組織形態結構。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
術后21 d取剩余切片行免疫組織化學染色，一抗為兔抗鼠Ⅳ型膠原多克隆抗體（1∶200）、兔抗鼠Ⅶ型膠原多克隆抗體（1∶200）。光鏡下觀察創面組織中表皮-真皮連接層Ⅳ型膠原和Ⅶ型膠原表達情況，以棕褐色染色為陽性表達。每組取3張不同大鼠切片，于400倍鏡下每張切片隨機選擇不重疊的10個視野，人工計數陽性著色細胞，按以下公式計算陽性細胞百分比：陽性細胞數/總細胞數×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后大鼠均存活至實驗完成。術后7 d，各組大鼠創面同種異體皮均成活，顏色紅潤。14 d，同種異體皮干燥并開始脫痂，創面可見散在片狀皮島。21?d，同種異體皮基本脫落，同種異體皮脫落后A、B組創面表面光滑，可見成片上皮，與皮下連接緊密；C組創面可見少量菲薄上皮，殘留部分肉芽創面；D組創面肉芽組織新鮮，無上皮形成。見圖 1～3。
圖1
術后7 d各組創面大體觀察 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 2 術后14 d各組創面大體觀察 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 3 術后21 d各組創面大體觀察 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組
Figure1.
The general observation of the wound in each group at 7 days after operation ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 2 The general observation of the wound in each group at 14 days after operation ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 3 The general observation of the wound in each group at 21 days after operation ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D
術后21 d同種異體皮脫落后測量各組創面愈合率，A、B、C、D組分別為62.9%±9.6%、64.2%± 9.1%、38.5%±5.7%、22.7%±5.5%。A、B組創面愈合率顯著高于C、D組，C組高于D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 組織學觀察
術后21 d，A、B、C組創面上皮層可見鱗狀上皮細胞，其下可見多層纖維組織，含有大量成纖維細胞。其中A、B組表皮分層明顯，表皮層厚度不均，且細胞排列疏松；C組鱗狀上皮細胞含量較少，表皮層薄，可見較多炎性細胞浸潤。D組均為肉芽組織。見圖 4。
2.3 免疫組織化學染色觀察
術后21 d，A、B、C組表皮-真皮連接層Ⅳ、Ⅶ型膠原表達呈陽性；D組無表皮層，呈陰性。見圖 5、6。A、B、C組Ⅳ型膠原表達陽性細胞百分比分別為65.1%±7.6%、61.8%±8.1%、53.2%±9.1%；Ⅶ型膠原表達陽性細胞百分比分別為62.2%±7.1%、61.6%±8.5%、51.9%±6.9%。A、B組均顯著高于C組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
術后21 d各組創面組織學觀察（HE×100） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 5 術后21 d各組創面Ⅳ型膠原免疫組織化學染色觀察（×100） 箭頭示陽性表達 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 6 術后21 d各組創面Ⅶ型膠原免疫組織化學染色觀察（×100） 箭頭示陽性表達 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組
Figure2.
Histological observation of each group at 21 days after operation (HE×100) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 5 Immunohistochemistry observation for collagen type IV in each group at 21 days after operation (×100) Arrow indicated positive expression ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 6 Immunohistochemistry observation for collagen type VII in each group at 21 days after operation (×100) Arrow indicated positive expression ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D
3 討論
自體皮匱乏是特大面積深度燒傷救治困難的根本原因，繼各種皮片、皮瓣、自體微粒皮移植技術[7-11]應用后，近年又興起表皮細胞培養及體外構建組織工程皮膚技術[12-14]。表皮細胞是構成皮膚表皮的主要細胞，其增殖、分化維系著表皮正常結構和生理功能，同時也是創面愈合過程中的重要種子細胞，可直接應用于創面修復[15]。表皮細胞懸液移植技術通過在體外擴增表皮細胞，極大提高了殘存自體皮的使用效率，同時它可表達多種整合素和生長因子，促進細胞黏附和增殖[16-17]，為特大面積深度燒傷患者的救治提供了新思路。
本實驗采用大鼠全層皮膚缺損創面抗攣縮模型[6]，可以防止創面收縮，有利于創面愈合指標的觀察。同時采用同種異體皮作為生物敷料覆蓋創面，移植后呈白色，后轉為紅潤，說明血管長入，同種異體皮的成活為移植于創面的自體表皮細胞提供了良好的生存環境。隨后同種異體皮最終因機體免疫排斥反應干燥脫落。本實驗觀察到同種異體皮脫落后，A、B、C組有成片上皮形成，說明自體表皮細胞作為成體組織中具有自我更新和一定分化潛能的細胞，克服了同種異體表皮細胞移植的免疫排斥反應及應用的倫理問題[18]，其細胞懸液可直接用于修復全層皮膚缺損創面。
結合既往相關研究[19]，本實驗設計了3個梯度移植密度。結果表明，在表皮細胞移植后14 d，同種異體皮開始脫落，創面可見散在片狀皮島；隨時間延長，皮島面積不斷擴大，逐漸修復殘余創面。組織切片HE染色示，表皮細胞移植可形成表皮層，起到覆蓋創面作用；當移植密度不足時，表皮層較薄，暴露了部分創面，可能是引起炎性細胞浸潤的原因之一。根據既往研究[20]，Ⅳ型和Ⅶ型膠原主要由表皮細胞合成，是構成基底膜的主要成分，其陽性表達說明表皮層成熟度高。本研究免疫組織化學染色示，A、B、C組表皮-真皮連接層Ⅳ型膠原和Ⅶ型膠原的表達呈陽性，D組呈陰性，說明自體表皮細胞懸液在移植后參與創面修復，并使缺損創面的皮膚重構。免疫組織化學染色半定量分析顯示C組Ⅳ型和Ⅶ型膠原表達較少，顯著低于A、B組，可能與移植細胞量較少有關。進一步結合創面愈合率和組織學觀察評價，表明A、B組創面愈合質量優于C組，但A、B組差異無統計學意義，提示1.0×105個/cm2為適宜的表皮細胞移植密度，按照該密度移植自體表皮細胞懸液可有效修復大鼠全層皮膚缺損創面，重構創面皮膚。
