引用本文： 李騰飛, 王江寧, 高磊, 尹葉鋒. 體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統采用遠端缺血處理灌注方法對保存斷肢的作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(1): 91-94. doi: 10.7507/1002-1892.20160019 復制
為解決長時間有效保存離斷肢體，本課題組前期將血液濾過裝置與心胸外科體外循環系統結合起來，成功建立了體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統 [1-2]。該系統優勢在于延長斷肢體外保存時間的同時可以清除骨骼肌缺血再灌注損傷產生的毒素，從而提高斷肢再植成功率和患者生存率[3]。遠端缺血處理（remote ischemic conditioning，RIC）的概念最早于20世紀80年代提出[4]，指組織和器官的缺血耐受性會因為遠端位置短暫缺血而明顯增強，這種適應性保護作用可以發生在同一器官的不同部位，也可發生于不同器官之間[5-6]。RIC技術操作簡便且抗缺血再灌注損傷效果顯著，首先用于心肌梗死及腦卒中等缺血再灌注損傷疾病的治療[7-8]。進一步研究證實，RIC技術亦能顯著抑制缺血再灌注引起的骨骼肌損傷[9]，具體操作方法也已明確[10]。降低骨骼肌的缺血再灌注損傷程度是提高斷肢再植成功率的關鍵[11]，但是我們前期體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統的動物實驗中，斷肢由于長時間體外寄養會出現一定程度的骨骼肌缺血再灌注損傷。為了進一步完善體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統，我們根據相關文獻[12-14]設計了RIC灌注方法：在持續血液灌注之前，先執行6次灌注-缺血循環（持續泵血10 min后停止泵血10 min為1個循環）。本次實驗擬在動物缺血模型中采用RIC灌注方法體外寄養斷肢，以研究體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統采用RIC灌注方法對保存斷肢的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年雄性巴馬小型豬18只，體質量24～30 kg，由首都醫科大學動物實驗中心提供。動物實驗過程符合2006年中華人民共和國科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統由本課題組設計并制作[15]。
線粒體分離試劑盒、Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國）；ELISA試劑盒（R&D Systems公司，美國）；B淋巴細胞瘤 2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體、β-actin、RAPI裂解液(上海生工生物工程技術服務有限公司)；BCA試劑盒（Pierce公司，美國）。Spectra Max Plus384分光光度計（Molecular Devices公司，美國）；ODYSSEY雙色紅外激光成像系統（LI-COR公司，美國）；550型酶標儀（Bio-Rad公司，美國）；VisionWorks LS軟件系統（UVP公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將18只小型豬隨機分為3組（n=6），分別為正常對照組（A組）、持續血液灌注組（B組）、RIC灌注組（C組）。A組不作任何缺血處理。B、C組動物制備骨骼肌缺血模型[16]。術前禁食12 h，采用肌肉注射氯胺酮（10 mg/kg）聯合氣管插管麻醉，用5%葡萄糖注射液按照1∶5比例稀釋丙泊酚，經耳緣靜脈持續滴注以維持麻醉。取右后肢脫毛、常規消毒鋪巾，采用顯微外科技術從近端結扎股動、靜脈及股神經，并于該結扎平面迅速離斷右后肢；室溫下保存離斷肢體3 h后，骨骼肌缺血模型建立。
骨骼肌缺血模型建立后行斷端血管內插管，并通過導管對斷端血管進行肝素化，最后將導管接入體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統的動、靜脈端。B組進行持續血液灌注，灌注流量為170 mL/ min，溫度設置為10℃，膜肺裝置氧體積分數設定為10%[16]；C組采用RIC灌注方法，即經過6個灌注-缺血循環（持續泵血10 min后停止泵血10 min為1個循環）后再進行持續血液灌注，灌注流量、溫度及氧體積分數均與B組相同。斷肢體外寄養過程中灌注效果良好，動靜脈血液含氧量差異明顯（圖 1）。灌注8 h后取骨骼肌標本（股四頭肌），A組同時間點取材，分別行透射電鏡觀察及Western blot、ELISA檢測。
圖1
斷肢體外寄養灌注過程中動、靜脈血液觀察紅色箭頭：動脈血黑色箭頭：靜脈血 圖 2 ? 骨骼肌組織透射電鏡觀察 A組（×5000） ? B組（×3 000） ? C組（×5 000） 圖 3 Western blot檢測各組Bcl-2及Caspase-3蛋白水平 Mr：相對分子質量 1：A組 2：B組 3：C組 ? Bcl-2 ? Caspase-3
Figure1.
The blood observation of artery and vein during the perfusion procedures Red arrow for artery blood Black arrow for vein blood Fig. 2 Transmission electron microscope observation of skeletal muscle tissues ? Group A (×5 000) ? Group B (×3 000) ? Group C (×5 000) Fig. 3 The protein levels of Bcl-2 and Caspase-3 in each group by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C ? Bcl-2 ? Caspase-3
1.3 觀測指標
1.3.1 透射電鏡觀察
將各組骨骼肌標本置于戊二醛固定，按照常規透射電鏡標本制備方法進行脫水、包埋、切片，透射電鏡下觀察骨骼肌組織形態學改變。
1.3.2 Western blot檢測Bcl-2及Caspase-3蛋白水平
①將保存于—80℃液氮中的組織標本取出，加入RAPI裂解液，以12 000×g 離心30 min，提取總蛋白；采取BCA法測定總蛋白濃度。檢測標本中凋亡壞死相關標記物Bcl-2以及Caspase-3，以β-actin作為內參；使用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統掃描聚偏氟乙烯膜，VisionWorks LS軟件系統計算灰度值，將目標蛋白灰度值與內參灰度值比值作為目標蛋白表達量。
1.3.3 ELISA檢測細胞色素C含量
取各組標本，用含0.25 mg/mL胰島素的骨骼肌細胞提取緩沖液沖洗浸泡，經10 min冰浴后，棄上清；所得沉淀經沖洗后研磨搗碎并加入0.4%Ⅰ型膠原酶，消化10 min后得到上清；4℃，經6004×g、離心5 min后獲上清；上清再經11000×g、離心10 min，最后得到的上清中含有細胞基質，沉淀中含有線粒體。參照文獻[17]方法，采用ELISA試劑盒檢測線粒體及細胞基質內細胞色素C含量。每個標本重復測量3次，取均值。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 透射電鏡觀察
A組為正常骨骼肌，肌絲排列整齊緊湊，肌纖維的I帶、A線、Z線清晰可見，排列規整，胞內細胞核位置、形態正常，線粒體、肌漿網形態正常；B組骨骼肌纖維排列紊亂，出現溶解，I帶、A線、Z線部分結構喪失，內質網和線粒體腫脹、溶解破壞；C組骨骼肌纖維排列較整齊，肌纖維溶解不明顯，I帶、A線、Z線結構仍清晰可見，內質網、線粒體稍腫脹。見圖 2。
2.2 Western blot檢測
A、B、C組Bcl-2蛋白表達量分別為0.16±0.01、0.29±0.12、0.47±0.15，Caspase-3蛋白表達量分別為0.25±0.07、0.70±0.13、0.44±0.05。與A組相比，B、C組Bcl-2及Caspase-3蛋白水平均明顯升高；與B組比較，C組Bcl-2蛋白水平顯著升高，而Caspase-3蛋白水平顯著降低；組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
2.3 ELISA檢測
A、B、C組線粒體內細胞色素C含量分別為（19.9.87±0.81）、（10.90±0.36）、（19.13±0.40） ng，細胞基質內含量分別為（12.07±0.85）、（20.43±0.67）、（12.93± 0.32）ng。與A、C組比較，B組線粒體內細胞色素C含量顯著降低，但細胞基質內含量明顯升高，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。與A組比較，C組線粒體內細胞色素C含量亦降低，且細胞基質內含量升高，但差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
長時間缺血以及后續再灌注會引起嚴重的骨骼肌細胞凋亡壞死，進而導致斷肢再植手術失敗率增加，甚至患者死亡[18]。研究表明，在骨骼肌缺血再灌注過程中，凋亡因子Bax被激活并與線粒體膜結合，導致線粒體膜破裂，使線粒體通透性增加，因此細胞色素C（凋亡過程中必不可少的促凋亡蛋白）外泄增加，并激活凋亡因子Caspase-3，從而誘導凋亡通路開放，導致骨骼肌細胞凋亡壞死[19-20]。在此通路中，抗凋亡因子Bcl-2能夠特異性結合凋亡因子Bax，抑制凋亡因子Bax激活，從而減少細胞色素C外泄，抑制凋亡通路的開放，進而對抗骨骼肌細胞的凋亡壞死[21]。本研究中，C組Bcl-2和Caspase-3蛋白水平較A組顯著升高，但細胞色素C含量與A組比較無明顯差異；經相同時間體外寄養，透射電鏡示C組骨骼肌形態結構明顯優于B組，Western blot及ELISA檢測發現其Bcl-2蛋白水平及線粒體內細胞色素C含量均高于B組，而Caspase-3蛋白水平和細胞基質內細胞色素C含量均低于B組。說明RIC灌注方法可以通過升高Bcl-2蛋白水平減少細胞色素C外泄，從而抑制Caspase-3激活，進而阻礙凋亡通路的開放，對抗骨骼肌細胞凋亡壞死；與持續血液灌注相比，RIC灌注方法對骨骼肌的缺血再灌注損傷有顯著保護作用。
在體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統中，灌注方法可以對斷肢的保存時間產生重要影響，有效的灌注方法能夠延長斷肢保存時間[22]。本研究結果表明，體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統采用RIC灌注方法可以顯著抑制缺血再灌注導致的骨骼肌損傷，是一種較為有效的灌注方法，可能會延長斷肢體外保存時間，但具體效果有待進一步研究驗證。
為解決長時間有效保存離斷肢體，本課題組前期將血液濾過裝置與心胸外科體外循環系統結合起來，成功建立了體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統 [1-2]。該系統優勢在于延長斷肢體外保存時間的同時可以清除骨骼肌缺血再灌注損傷產生的毒素，從而提高斷肢再植成功率和患者生存率[3]。遠端缺血處理（remote ischemic conditioning，RIC）的概念最早于20世紀80年代提出[4]，指組織和器官的缺血耐受性會因為遠端位置短暫缺血而明顯增強，這種適應性保護作用可以發生在同一器官的不同部位，也可發生于不同器官之間[5-6]。RIC技術操作簡便且抗缺血再灌注損傷效果顯著，首先用于心肌梗死及腦卒中等缺血再灌注損傷疾病的治療[7-8]。進一步研究證實，RIC技術亦能顯著抑制缺血再灌注引起的骨骼肌損傷[9]，具體操作方法也已明確[10]。降低骨骼肌的缺血再灌注損傷程度是提高斷肢再植成功率的關鍵[11]，但是我們前期體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統的動物實驗中，斷肢由于長時間體外寄養會出現一定程度的骨骼肌缺血再灌注損傷。為了進一步完善體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統，我們根據相關文獻[12-14]設計了RIC灌注方法：在持續血液灌注之前，先執行6次灌注-缺血循環（持續泵血10 min后停止泵血10 min為1個循環）。本次實驗擬在動物缺血模型中采用RIC灌注方法體外寄養斷肢，以研究體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統采用RIC灌注方法對保存斷肢的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年雄性巴馬小型豬18只，體質量24～30 kg，由首都醫科大學動物實驗中心提供。動物實驗過程符合2006年中華人民共和國科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統由本課題組設計并制作[15]。
線粒體分離試劑盒、Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國）；ELISA試劑盒（R&D Systems公司，美國）；B淋巴細胞瘤 2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體、β-actin、RAPI裂解液(上海生工生物工程技術服務有限公司)；BCA試劑盒（Pierce公司，美國）。Spectra Max Plus384分光光度計（Molecular Devices公司，美國）；ODYSSEY雙色紅外激光成像系統（LI-COR公司，美國）；550型酶標儀（Bio-Rad公司，美國）；VisionWorks LS軟件系統（UVP公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將18只小型豬隨機分為3組（n=6），分別為正常對照組（A組）、持續血液灌注組（B組）、RIC灌注組（C組）。A組不作任何缺血處理。B、C組動物制備骨骼肌缺血模型[16]。術前禁食12 h，采用肌肉注射氯胺酮（10 mg/kg）聯合氣管插管麻醉，用5%葡萄糖注射液按照1∶5比例稀釋丙泊酚，經耳緣靜脈持續滴注以維持麻醉。取右后肢脫毛、常規消毒鋪巾，采用顯微外科技術從近端結扎股動、靜脈及股神經，并于該結扎平面迅速離斷右后肢；室溫下保存離斷肢體3 h后，骨骼肌缺血模型建立。
骨骼肌缺血模型建立后行斷端血管內插管，并通過導管對斷端血管進行肝素化，最后將導管接入體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統的動、靜脈端。B組進行持續血液灌注，灌注流量為170 mL/ min，溫度設置為10℃，膜肺裝置氧體積分數設定為10%[16]；C組采用RIC灌注方法，即經過6個灌注-缺血循環（持續泵血10 min后停止泵血10 min為1個循環）后再進行持續血液灌注，灌注流量、溫度及氧體積分數均與B組相同。斷肢體外寄養過程中灌注效果良好，動靜脈血液含氧量差異明顯（圖 1）。灌注8 h后取骨骼肌標本（股四頭肌），A組同時間點取材，分別行透射電鏡觀察及Western blot、ELISA檢測。
圖1
斷肢體外寄養灌注過程中動、靜脈血液觀察紅色箭頭：動脈血黑色箭頭：靜脈血 圖 2 ? 骨骼肌組織透射電鏡觀察 A組（×5000） ? B組（×3 000） ? C組（×5 000） 圖 3 Western blot檢測各組Bcl-2及Caspase-3蛋白水平 Mr：相對分子質量 1：A組 2：B組 3：C組 ? Bcl-2 ? Caspase-3
Figure1.
The blood observation of artery and vein during the perfusion procedures Red arrow for artery blood Black arrow for vein blood Fig. 2 Transmission electron microscope observation of skeletal muscle tissues ? Group A (×5 000) ? Group B (×3 000) ? Group C (×5 000) Fig. 3 The protein levels of Bcl-2 and Caspase-3 in each group by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C ? Bcl-2 ? Caspase-3
1.3 觀測指標
1.3.1 透射電鏡觀察
將各組骨骼肌標本置于戊二醛固定，按照常規透射電鏡標本制備方法進行脫水、包埋、切片，透射電鏡下觀察骨骼肌組織形態學改變。
1.3.2 Western blot檢測Bcl-2及Caspase-3蛋白水平
①將保存于—80℃液氮中的組織標本取出，加入RAPI裂解液，以12 000×g 離心30 min，提取總蛋白；采取BCA法測定總蛋白濃度。檢測標本中凋亡壞死相關標記物Bcl-2以及Caspase-3，以β-actin作為內參；使用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統掃描聚偏氟乙烯膜，VisionWorks LS軟件系統計算灰度值，將目標蛋白灰度值與內參灰度值比值作為目標蛋白表達量。
1.3.3 ELISA檢測細胞色素C含量
取各組標本，用含0.25 mg/mL胰島素的骨骼肌細胞提取緩沖液沖洗浸泡，經10 min冰浴后，棄上清；所得沉淀經沖洗后研磨搗碎并加入0.4%Ⅰ型膠原酶，消化10 min后得到上清；4℃，經6004×g、離心5 min后獲上清；上清再經11000×g、離心10 min，最后得到的上清中含有細胞基質，沉淀中含有線粒體。參照文獻[17]方法，采用ELISA試劑盒檢測線粒體及細胞基質內細胞色素C含量。每個標本重復測量3次，取均值。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 透射電鏡觀察
A組為正常骨骼肌，肌絲排列整齊緊湊，肌纖維的I帶、A線、Z線清晰可見，排列規整，胞內細胞核位置、形態正常，線粒體、肌漿網形態正常；B組骨骼肌纖維排列紊亂，出現溶解，I帶、A線、Z線部分結構喪失，內質網和線粒體腫脹、溶解破壞；C組骨骼肌纖維排列較整齊，肌纖維溶解不明顯，I帶、A線、Z線結構仍清晰可見，內質網、線粒體稍腫脹。見圖 2。
2.2 Western blot檢測
A、B、C組Bcl-2蛋白表達量分別為0.16±0.01、0.29±0.12、0.47±0.15，Caspase-3蛋白表達量分別為0.25±0.07、0.70±0.13、0.44±0.05。與A組相比，B、C組Bcl-2及Caspase-3蛋白水平均明顯升高；與B組比較，C組Bcl-2蛋白水平顯著升高，而Caspase-3蛋白水平顯著降低；組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
2.3 ELISA檢測
A、B、C組線粒體內細胞色素C含量分別為（19.9.87±0.81）、（10.90±0.36）、（19.13±0.40） ng，細胞基質內含量分別為（12.07±0.85）、（20.43±0.67）、（12.93± 0.32）ng。與A、C組比較，B組線粒體內細胞色素C含量顯著降低，但細胞基質內含量明顯升高，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。與A組比較，C組線粒體內細胞色素C含量亦降低，且細胞基質內含量升高，但差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
長時間缺血以及后續再灌注會引起嚴重的骨骼肌細胞凋亡壞死，進而導致斷肢再植手術失敗率增加，甚至患者死亡[18]。研究表明，在骨骼肌缺血再灌注過程中，凋亡因子Bax被激活并與線粒體膜結合，導致線粒體膜破裂，使線粒體通透性增加，因此細胞色素C（凋亡過程中必不可少的促凋亡蛋白）外泄增加，并激活凋亡因子Caspase-3，從而誘導凋亡通路開放，導致骨骼肌細胞凋亡壞死[19-20]。在此通路中，抗凋亡因子Bcl-2能夠特異性結合凋亡因子Bax，抑制凋亡因子Bax激活，從而減少細胞色素C外泄，抑制凋亡通路的開放，進而對抗骨骼肌細胞的凋亡壞死[21]。本研究中，C組Bcl-2和Caspase-3蛋白水平較A組顯著升高，但細胞色素C含量與A組比較無明顯差異；經相同時間體外寄養，透射電鏡示C組骨骼肌形態結構明顯優于B組，Western blot及ELISA檢測發現其Bcl-2蛋白水平及線粒體內細胞色素C含量均高于B組，而Caspase-3蛋白水平和細胞基質內細胞色素C含量均低于B組。說明RIC灌注方法可以通過升高Bcl-2蛋白水平減少細胞色素C外泄，從而抑制Caspase-3激活，進而阻礙凋亡通路的開放，對抗骨骼肌細胞凋亡壞死；與持續血液灌注相比，RIC灌注方法對骨骼肌的缺血再灌注損傷有顯著保護作用。
在體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統中，灌注方法可以對斷肢的保存時間產生重要影響，有效的灌注方法能夠延長斷肢保存時間[22]。本研究結果表明，體外模擬體內生理環境寄養斷肢系統采用RIC灌注方法可以顯著抑制缺血再灌注導致的骨骼肌損傷，是一種較為有效的灌注方法，可能會延長斷肢體外保存時間，但具體效果有待進一步研究驗證。
