引用本文： 吳莉, 趙嫻, 何波, 陳澤谷, 陸林, 魏韓笑, 張承磊, 劉流. 內皮祖細胞促進組織工程骨體內成骨. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(1): 95-101. doi: 10.7507/1002-1892.20160020 復制
炎癥、外傷、腫瘤切除所致大面積骨缺損修復是臨床難題，隨著組織工程技術的發展，組織工程骨為骨缺損修復提供了新方法。組織工程骨的微血管化是骨組織工程研究的核心問題[1]。目前可通過加入促血管生成因子、改造支架結構等方法促進組織工程骨血管形成[2]，但效果并不理想。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）在體內外可分化為血管內皮細胞生成血管，且在特定微環境下可促進MSCs成骨[3]。因此，本研究擬將自體外周血來源的EPCs與BMSCs直接共培養，體外復合至包被纖維粘連蛋白（fibronectin，FN）的部分脫蛋白生物骨（partially deproteinised bone，PDPB）支架上，并異位移植至兔四肢肌袋內，觀察EPCs微血管化能力，旨在探討EPCs在BMSCs成骨中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡新西蘭大耳兔9只，體質量（2.5±0.5）kg，購自昆明醫科大學動物科。
PDPB由本課題組自制[4]。H-DMEM培養基、L-DMEM培養基、15%FBS（HyClone公司，美國）；兔淋巴細胞分離液（Sigma公司，美國）；胰蛋白酶、Trizol（Takara公司，日本）；兔CD34、CD133、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、CD29、CD90、CD105、緊密連接蛋白1（zonula occludens protein 1，ZO-1）一抗（北京博奧森生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；熒光定量PCR試劑盒及引物設計（大連寶生物工程有限公司）；Loading Buffer、DNA ladder（Fermantas公司，立陶宛）。細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；低溫離心機（北京醫用離心機廠）；RT-PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；光學顯微鏡、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Leica Qwin 2.3軟件（Leica公司，德國）；Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 外周血EPCs及BMSCs共培養體系的建立
1.2.1 外周血EPCs分離培養及鑒定
全身肝素化后抽取1～9號新西蘭大耳兔耳中央動脈外周血5mL，采用兔淋巴細胞分離液分離單核細胞，密度梯度離心法及貼壁法分離EPCs[5]，同時標記第1～9 號兔細胞；原代細胞生長至70%融合時，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。取第3代細胞行免疫熒光染色觀察CD34、CD133、vWF表達，DAPI染核，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.2.2 BMSCs分離培養及鑒定
抽取第1～9號新西蘭大耳兔雙側脛骨、股骨肝素抗凝骨髓血5 mL，采用密度梯度離心法及貼壁法分離BMSCs[5]，同時標記第1～9號兔細胞。原代細胞生長至70%融合時，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代。取第3 代細胞行免疫熒光染色觀察CD29、CD34、CD90表達，DAPI染核，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.2.3 外周血EPCs及BMSCs共培養體系建立
將第3代1～9號兔BMSCs加入成骨誘導分化培養基[6]（含10%FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/ mL鏈霉素、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50μmol/L 維生素C的H-DMEM培養液），2 d換液1次。誘導7 d后，均收集1×106個細胞，加入0.5×106 個相同序號的第3代EPCs，即BMSCs∶EPCs=2∶1[5]，加入前述成骨誘導分化培養基及成血管誘導分化培養基[7]（含10%FBS、50ng/ mL VEGF 及20μg/ mL牛腦垂體提取物的甲基纖維素半固體基礎培養基）各半進行培養，即為1～9 號外周血EPCs及BMSCs共培養體系。
1.3 組織工程骨構建
1.3.1 生物支架準備
生物支架為本課題組預先制備的包被FN的PDPB[4]，大小為0.5cm×0.5cm× 0.3cm，于4℃冰箱儲存備用。
1.3.2 組織工程骨構建
分別制備3種復合不同細胞的組織工程骨。取出54塊PDPB，置于裝有DMEM的培養皿中預濕；于培養皿中分別加入混有20 μL PBS的1～9號兔來源的單純EPCs、單純BM SCs 及共培養細胞各1×106個，分別構建A、B、C 3 種組織工程骨（n=18）。于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養4 h后，分別置于96孔板，C組加成骨及成血管誘導分化混合培養基，A、B組加成骨誘導分化培養基至總量100μL，置37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，隔日換液。
1.4 動物體內移植實驗
1.4.1 組織工程骨兔自體異位移植
取1～9號新西蘭大耳兔，水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉，分別于右上肢、左上肢、右下肢剃毛、消毒，皮膚、皮下分層切開，切開肌膜，鈍性分離肌肉束，擴充1cm× 1cm×1 cm大小的肌袋。組織工程骨體外復合培養4d后，分別將1～9號兔來源的A、B、C 3種組織工程骨移植至同序號兔右上肢、左上肢、右下肢肌袋[8]，每個肢體移植2塊組織工程骨。
1.4.2 大體觀察
移植后2、4、8周，隨機取3只兔，切開術區觀察各組組織工程骨生長情況。
1.4.3 組織學及免疫組織化學染色觀察
大體觀察后取各組組織工程骨，于4%多聚甲醛固定，脫鈣液脫鈣、石蠟包埋組織切片，中心部分連續切片3 張，片厚0.5 μm。常規行HE染色及CD34、CD105、ZO-1免疫組織化學染色，光鏡下觀察。每張HE染色切片隨機取3個視野，采用Leica Qwin 2.3軟件分析成骨面積，按以下公式計算骨長入率： （骨長入區域面積/植入物區域面積）×100%；采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析免疫組織化學染色切片，得到陽性細胞平均吸光度（A）值，比較各組CD34、CD105、ZO-1表達量變化。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較及組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 外周血EPCs、BMSCs形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，外周血EPCs培養14d呈典型“鋪路石”樣外觀，21 d細胞連接成片。第3 代細胞CD34、CD133、vWF免疫熒光染色均為陽性。見圖 1。BMSCs培養7 d形成小型細胞集落；9d細胞集落數目增多，雙核、梭形、紡錘形細胞螺旋狀聚攏。第3代BMSCs免疫熒光染色CD29、CD90呈陽性，CD34呈陰性。見圖 2。
圖1
外周血EPCs形態學觀察及鑒定 ? 第3代EPCs培養3 d形態學觀察（倒置相差顯微鏡×200）? CD34免疫熒光染色陽性（熒光顯微鏡×200） ? CD133免疫熒光染色陽性（熒光顯微鏡×200）? vWF免疫熒光染色陽性（熒光顯微鏡×200） 圖 2 BMSCs形態學觀察及鑒定 ? 第3代BMSCs培養3 d形態學觀察（倒置相差顯微鏡×400） ? CD29免疫熒光染色陽性（熒光顯微鏡 ×400） ? CD90免疫熒光染色陽性（熒光顯微鏡×400） ? CD34免疫熒光染色陰性（熒光顯微鏡×400） 圖 3 移植后各時間點各組組織工程骨大體觀察 ? A組2周 ? B組2周 ? C組2周 ? A組4周 ? B組4周 ? C組4周 ? A組8周 ? B組8周 ? C組8周
Figure1.
Morphology observation and identification of peripheral blood EPCs ? Morphology observation of the third generation EPCs after 3 days of culture (Inverted phase contrast microscope×200) ? Immunofluorescence staining positive result for CD34 (Fluorescence microscope×200) ? Immunofluorescence staining positive result for CD133 (Fluorescence microscope×200) ? Immunofluorescence staining positive result for vWF (Fluorescence microscope×200) Fig. 2 Morphology observation and identification of BMSCs ? Morphology observation of the third generation BMSCs after 3 days of culture (Inverted phase contrast microscope×400) ? Immunofluorescence staining positive result for CD29 (Fluorescence microscope×400) ? Immunofluorescence staining positive result for CD90 (Fluorescence microscope×400) ? Immunofluorescence staining negative result for CD34 (Fluorescence microscope×400) Fig. 3 The general observation of tissue engineered bone in each group at each time point after transplantation ? Group A at 2 weeks ? Group B at 2 weeks ? Group C at 2 weeks ? Group A at 4 weeks ? Group B at 4weeks ? Group C at 4weeks ? Group A at 8 weeks ? Group B at 8 weeks ? Group C at 8 weeks
2.2 動物體內移植實驗
2.2.1 大體觀察
移植后2周，各組組織工程骨均被周圍軟組織包繞，C組較A、B組包繞緊密，局部不可分開；切開后各組切緣銳利，切面均可見組織工程骨原有孔隙，C組切面邊緣見少許鮮紅軟組織長入。4周，各組包繞組織工程骨的軟組織增多、增厚，C組切緣見鮮紅軟組織進一步向孔隙內填充，B組長入組織工程骨內鮮紅軟組織較少，A組更少，各組均未見明確血管長入組織工程骨內。8周，各組周圍軟組織與組織工程骨分界不清，組織工程骨邊緣圓潤；C組切面大部分組織工程骨原有孔隙由鮮紅軟組織填充，可見迂曲小血管網長入組織工程骨中心，A、B組組織工程骨中心仍有未被填充的原有孔隙。見圖 3。
2.2.2 組織學觀察
移植后2周，各組組織工程骨內均見少量血管，管腔形成不明顯，未見明顯骨組織長入。4周，各組組織工程骨內毛細血管逐漸形成管腔，A、C組較明顯；B、C組可見膠原纖維生長，C組更明顯。8周，各組可見毛細血管明顯增多，管腔內出現紅細胞，膠原纖維增多，可見骨小梁和新生骨，以C組明顯，其次為B組。見圖 4。移植后4、8 周，C組骨長入率顯著高于A、B組，B組高于A組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
圖2
移植后各時間點各組組織學觀察（HE×200） ? A組2周 ? B組2周 ? C組2周 ? A組4周 ? B組4周 ? C組4周 ? A組8周 ? B組8周 ? C組8周 圖 5 移植后8周各組免疫組織化學染色觀察（×200） ? A組CD34 ? B組CD34 ? C組CD34 ? A組CD105 ? B組CD105 ? C組CD105 ? A組ZO-1 ? B組ZO-1 ? C組ZO-1
Figure2.
Histological observation of tissue engineered bone in each group at each time point after transplantation (HE×200) ? Group A at 2 weeks ? Group B at 2 weeks ? Group C at 2 weeks ? Group A at 4 weeks ? Group B at 4 weeks ? Group C at 4 weeks ? Group A at 8 weeks ? Group B at 8weeks ? Group C at 8 weeks Fig. 5 Immunohistochemical staining observation of tissue engineered bone in each group at 8weeks after transplantation (HE×200) ? Group A ,CD34 ? Group B,CD34 ? Group C,CD34 ? Group A,CD 105 ? Group B,CD105 ? Group C,CD 105 ? Group A,ZO-1 ? Group B,ZO-1 ? Group C,ZO-1
表1
移植后各時間點各組組織工程骨骨長入率比較（n=6，%，2.2.3 免疫組織化學染色觀察
移植后2、4、8周，隨時間延長，3組組織工程骨CD34、CD105、ZO-1表達量均逐漸增多，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。組間比較：移植后2周，A、C組見少許陽性細胞，B組未見陽性細胞；僅CD105表達量3組間兩兩比較差異有統計學意義（F=9.854，P=0.000）；4、8周，3組間CD34、CD105、ZO-1表達量兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），C組最多，B組最少。4周，A、C組新生內皮細胞逐漸圍成管腔形成新生血管，少量管腔內可見紅細胞，B組管腔形成不明顯；8周，C組見明顯新生血管管腔且部分與宿主血管溝通，A組新生血管增多，B組少許新生血管。見圖 5。
表2
移植后各時間點各組CD34、CD105及ZO-1表達量比較（n=6，3 討論
組織工程支架上的種子細胞只有在有氧代謝、細胞灌注充足、合理營養物質供應和代謝產物及時排出時才能存活[9-10]；然而，種子細胞與支架材料復合移植后，周圍宿主血管內營養物質的擴散深度僅約150 μm/h[11]。因此，尋找有效方法及時建立組織工程骨與宿主之間的有效血液循環，保證干細胞有持續營養物質供應，是干細胞存活的關鍵。
Martin等[10]將EPCs和BMSCs采用Transwell小室間接共培養及兩種細胞直接接觸共培養進行比較，結果顯示直接接觸共培養的兩種細胞成骨更明顯，認為可能由于兩種細胞的直接接觸改變了共培養環境，促進了兩種細胞之間的信號交流及生長因子分泌，從而促進了成骨。因此，本研究采用直接接觸共培養方法，將按1∶2比例共培養的自體外周血來源EPCs-BMSCs及單純培養的EPCs、BMSCs分別復合于PDPB上，同時自體移植至兔四肢肌袋內行異位體內誘導成骨培養，觀察組織工程骨及周圍組織的變化。移植8周后，3組組織工程骨支架均未出現排斥反應，且逐步降解，由膠原、骨小梁及新生骨替代。其中C組組織工程骨成血管及成骨趨勢最好，隨時間延長至8周時骨長入率為1.47%±0.21%，明顯高于其余兩組，與文獻報道一致[12]。免疫組織化學染色觀察示，移植后8周C組組織工程骨內新生血管明顯增多，且部分與宿主血管溝通，見大量表達CD34、CD105、ZO-1的血管內皮細胞，C組各因子表達量均顯著高于A、B組。
本研究結果顯示，將EPCs與BMSCs按1∶2比例共培養具有協同作用，促進了組織工程骨微血管化進程，增強了BMSCs的成骨活性，與國外研究結果一致[13]。BMSCs有高度自我更新及多向分化潛能，在體內外不同微環境下均可誘導分化為成骨細胞、成軟骨細胞和破骨細胞[14]，其在成骨過程中旁分泌多種可溶性細胞因子，如VEGF、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、BMP-2等，其中VEGF可與EPCs上的VEGF受體特異性結合，活化受體細胞內段偶聯的絡氨酸激酶，催化下游信號蛋白，促使EPCs增殖并定向內皮細胞分化，促進新生血管管腔形成[15]，因此VEGF是EPCs促進血管生成的最重要因子[16]。G-CSF可通過提高VEGF表達，提高外周血EPCs增殖能力及歸巢能力[17]。BMP-2可由BMSCs分泌，亦是EPCs分泌的重要生長因子[18]，可在移植后15min內促進MSCs成骨分化[19]。而EPCs可明顯提高BMSCs的干性功能、增殖能力及成骨分化能力，溫麗[20]研究表明在EPCs旁分泌因子的作用下，EPCs還可提高BMSCs分泌VEGF及BMP-2等成骨、成血管因子，從而促進新生血管形成及新骨形成。
本研究采用免疫組織化學染色檢測了各組組織工程骨中CD34、CD105、ZO-1陽性細胞的表達，結果顯示C組組織工程骨移植后4周即形成了血管管腔結構，并逐漸與周圍軟組織內血管溝通，形成功能性微血管（ZO-1陽性），促進了營養物質輸送，增加BMSCs存活數量，提高其增殖和成骨分化能力。CD34是血管內皮細胞特異性的標記物，能突出顯示較小的不成熟微血管和單個內皮細胞，但成熟的血管內皮細胞CD34也可表現為陽性；CD105是新生血管特異性標記物，能突出顯示新生血管，在研究腫瘤、組織工程移植物時廣泛應用；ZO-1是緊密連接蛋白，其表達表示血管為功能性血管，同時可見血管內紅細胞，ZO-1與CD105同時表達即可認為新生血管為功能性血管，具有攜帶營養物質并帶走代謝產物的功能[21]。本研究結果顯示，移植2周時3組間ZO-1表達量比較差異均無統計學意義，說明此時3組均未生成功能性微血管，而移植后4、8周，C組ZO-1表達量較其余兩組均明顯增加，生成了功能性微血管。
綜上述，將EPCs與BMSCs聯合培養可增加組織工程骨微血管網的形成及促進成骨，為自體細胞復合構建血管化組織工程骨提供了理論依據。但這兩種細胞相互作用的確切分子機制尚未完全明確，有待于進一步研究。
炎癥、外傷、腫瘤切除所致大面積骨缺損修復是臨床難題，隨著組織工程技術的發展，組織工程骨為骨缺損修復提供了新方法。組織工程骨的微血管化是骨組織工程研究的核心問題[1]。目前可通過加入促血管生成因子、改造支架結構等方法促進組織工程骨血管形成[2]，但效果并不理想。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）在體內外可分化為血管內皮細胞生成血管，且在特定微環境下可促進MSCs成骨[3]。因此，本研究擬將自體外周血來源的EPCs與BMSCs直接共培養，體外復合至包被纖維粘連蛋白（fibronectin，FN）的部分脫蛋白生物骨（partially deproteinised bone，PDPB）支架上，并異位移植至兔四肢肌袋內，觀察EPCs微血管化能力，旨在探討EPCs在BMSCs成骨中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡新西蘭大耳兔9只，體質量（2.5±0.5）kg，購自昆明醫科大學動物科。
PDPB由本課題組自制[4]。H-DMEM培養基、L-DMEM培養基、15%FBS（HyClone公司，美國）；兔淋巴細胞分離液（Sigma公司，美國）；胰蛋白酶、Trizol（Takara公司，日本）；兔CD34、CD133、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、CD29、CD90、CD105、緊密連接蛋白1（zonula occludens protein 1，ZO-1）一抗（北京博奧森生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；熒光定量PCR試劑盒及引物設計（大連寶生物工程有限公司）；Loading Buffer、DNA ladder（Fermantas公司，立陶宛）。細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；低溫離心機（北京醫用離心機廠）；RT-PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；光學顯微鏡、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Leica Qwin 2.3軟件（Leica公司，德國）；Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 外周血EPCs及BMSCs共培養體系的建立
1.2.1 外周血EPCs分離培養及鑒定
全身肝素化后抽取1～9號新西蘭大耳兔耳中央動脈外周血5mL，采用兔淋巴細胞分離液分離單核細胞，密度梯度離心法及貼壁法分離EPCs[5]，同時標記第1～9 號兔細胞；原代細胞生長至70%融合時，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。取第3代細胞行免疫熒光染色觀察CD34、CD133、vWF表達，DAPI染核，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.2.2 BMSCs分離培養及鑒定
抽取第1～9號新西蘭大耳兔雙側脛骨、股骨肝素抗凝骨髓血5 mL，采用密度梯度離心法及貼壁法分離BMSCs[5]，同時標記第1～9號兔細胞。原代細胞生長至70%融合時，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代。取第3 代細胞行免疫熒光染色觀察CD29、CD34、CD90表達，DAPI染核，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.2.3 外周血EPCs及BMSCs共培養體系建立
將第3代1～9號兔BMSCs加入成骨誘導分化培養基[6]（含10%FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/ mL鏈霉素、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50μmol/L 維生素C的H-DMEM培養液），2 d換液1次。誘導7 d后，均收集1×106個細胞，加入0.5×106 個相同序號的第3代EPCs，即BMSCs∶EPCs=2∶1[5]，加入前述成骨誘導分化培養基及成血管誘導分化培養基[7]（含10%FBS、50ng/ mL VEGF 及20μg/ mL牛腦垂體提取物的甲基纖維素半固體基礎培養基）各半進行培養，即為1～9 號外周血EPCs及BMSCs共培養體系。
1.3 組織工程骨構建
1.3.1 生物支架準備
生物支架為本課題組預先制備的包被FN的PDPB[4]，大小為0.5cm×0.5cm× 0.3cm，于4℃冰箱儲存備用。
1.3.2 組織工程骨構建
分別制備3種復合不同細胞的組織工程骨。取出54塊PDPB，置于裝有DMEM的培養皿中預濕；于培養皿中分別加入混有20 μL PBS的1～9號兔來源的單純EPCs、單純BM SCs 及共培養細胞各1×106個，分別構建A、B、C 3 種組織工程骨（n=18）。于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養4 h后，分別置于96孔板，C組加成骨及成血管誘導分化混合培養基，A、B組加成骨誘導分化培養基至總量100μL，置37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，隔日換液。
1.4 動物體內移植實驗
1.4.1 組織工程骨兔自體異位移植
取1～9號新西蘭大耳兔，水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉，分別于右上肢、左上肢、右下肢剃毛、消毒，皮膚、皮下分層切開，切開肌膜，鈍性分離肌肉束，擴充1cm× 1cm×1 cm大小的肌袋。組織工程骨體外復合培養4d后，分別將1～9號兔來源的A、B、C 3種組織工程骨移植至同序號兔右上肢、左上肢、右下肢肌袋[8]，每個肢體移植2塊組織工程骨。
1.4.2 大體觀察
移植后2、4、8周，隨機取3只兔，切開術區觀察各組組織工程骨生長情況。
1.4.3 組織學及免疫組織化學染色觀察
大體觀察后取各組組織工程骨，于4%多聚甲醛固定，脫鈣液脫鈣、石蠟包埋組織切片，中心部分連續切片3 張，片厚0.5 μm。常規行HE染色及CD34、CD105、ZO-1免疫組織化學染色，光鏡下觀察。每張HE染色切片隨機取3個視野，采用Leica Qwin 2.3軟件分析成骨面積，按以下公式計算骨長入率： （骨長入區域面積/植入物區域面積）×100%；采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析免疫組織化學染色切片，得到陽性細胞平均吸光度（A）值，比較各組CD34、CD105、ZO-1表達量變化。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較及組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 外周血EPCs、BMSCs形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，外周血EPCs培養14d呈典型“鋪路石”樣外觀，21 d細胞連接成片。第3 代細胞CD34、CD133、vWF免疫熒光染色均為陽性。見圖 1。BMSCs培養7 d形成小型細胞集落；9d細胞集落數目增多，雙核、梭形、紡錘形細胞螺旋狀聚攏。第3代BMSCs免疫熒光染色CD29、CD90呈陽性，CD34呈陰性。見圖 2。
圖1
外周血EPCs形態學觀察及鑒定 ? 第3代EPCs培養3 d形態學觀察（倒置相差顯微鏡×200）? CD34免疫熒光染色陽性（熒光顯微鏡×200） ? CD133免疫熒光染色陽性（熒光顯微鏡×200）? vWF免疫熒光染色陽性（熒光顯微鏡×200） 圖 2 BMSCs形態學觀察及鑒定 ? 第3代BMSCs培養3 d形態學觀察（倒置相差顯微鏡×400） ? CD29免疫熒光染色陽性（熒光顯微鏡 ×400） ? CD90免疫熒光染色陽性（熒光顯微鏡×400） ? CD34免疫熒光染色陰性（熒光顯微鏡×400） 圖 3 移植后各時間點各組組織工程骨大體觀察 ? A組2周 ? B組2周 ? C組2周 ? A組4周 ? B組4周 ? C組4周 ? A組8周 ? B組8周 ? C組8周
Figure1.
Morphology observation and identification of peripheral blood EPCs ? Morphology observation of the third generation EPCs after 3 days of culture (Inverted phase contrast microscope×200) ? Immunofluorescence staining positive result for CD34 (Fluorescence microscope×200) ? Immunofluorescence staining positive result for CD133 (Fluorescence microscope×200) ? Immunofluorescence staining positive result for vWF (Fluorescence microscope×200) Fig. 2 Morphology observation and identification of BMSCs ? Morphology observation of the third generation BMSCs after 3 days of culture (Inverted phase contrast microscope×400) ? Immunofluorescence staining positive result for CD29 (Fluorescence microscope×400) ? Immunofluorescence staining positive result for CD90 (Fluorescence microscope×400) ? Immunofluorescence staining negative result for CD34 (Fluorescence microscope×400) Fig. 3 The general observation of tissue engineered bone in each group at each time point after transplantation ? Group A at 2 weeks ? Group B at 2 weeks ? Group C at 2 weeks ? Group A at 4 weeks ? Group B at 4weeks ? Group C at 4weeks ? Group A at 8 weeks ? Group B at 8 weeks ? Group C at 8 weeks
2.2 動物體內移植實驗
2.2.1 大體觀察
移植后2周，各組組織工程骨均被周圍軟組織包繞，C組較A、B組包繞緊密，局部不可分開；切開后各組切緣銳利，切面均可見組織工程骨原有孔隙，C組切面邊緣見少許鮮紅軟組織長入。4周，各組包繞組織工程骨的軟組織增多、增厚，C組切緣見鮮紅軟組織進一步向孔隙內填充，B組長入組織工程骨內鮮紅軟組織較少，A組更少，各組均未見明確血管長入組織工程骨內。8周，各組周圍軟組織與組織工程骨分界不清，組織工程骨邊緣圓潤；C組切面大部分組織工程骨原有孔隙由鮮紅軟組織填充，可見迂曲小血管網長入組織工程骨中心，A、B組組織工程骨中心仍有未被填充的原有孔隙。見圖 3。
2.2.2 組織學觀察
移植后2周，各組組織工程骨內均見少量血管，管腔形成不明顯，未見明顯骨組織長入。4周，各組組織工程骨內毛細血管逐漸形成管腔，A、C組較明顯；B、C組可見膠原纖維生長，C組更明顯。8周，各組可見毛細血管明顯增多，管腔內出現紅細胞，膠原纖維增多，可見骨小梁和新生骨，以C組明顯，其次為B組。見圖 4。移植后4、8 周，C組骨長入率顯著高于A、B組，B組高于A組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
圖2
移植后各時間點各組組織學觀察（HE×200） ? A組2周 ? B組2周 ? C組2周 ? A組4周 ? B組4周 ? C組4周 ? A組8周 ? B組8周 ? C組8周 圖 5 移植后8周各組免疫組織化學染色觀察（×200） ? A組CD34 ? B組CD34 ? C組CD34 ? A組CD105 ? B組CD105 ? C組CD105 ? A組ZO-1 ? B組ZO-1 ? C組ZO-1
Figure2.
Histological observation of tissue engineered bone in each group at each time point after transplantation (HE×200) ? Group A at 2 weeks ? Group B at 2 weeks ? Group C at 2 weeks ? Group A at 4 weeks ? Group B at 4 weeks ? Group C at 4 weeks ? Group A at 8 weeks ? Group B at 8weeks ? Group C at 8 weeks Fig. 5 Immunohistochemical staining observation of tissue engineered bone in each group at 8weeks after transplantation (HE×200) ? Group A ,CD34 ? Group B,CD34 ? Group C,CD34 ? Group A,CD 105 ? Group B,CD105 ? Group C,CD 105 ? Group A,ZO-1 ? Group B,ZO-1 ? Group C,ZO-1
表1
移植后各時間點各組組織工程骨骨長入率比較（n=6，%，2.2.3 免疫組織化學染色觀察
移植后2、4、8周，隨時間延長，3組組織工程骨CD34、CD105、ZO-1表達量均逐漸增多，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。組間比較：移植后2周，A、C組見少許陽性細胞，B組未見陽性細胞；僅CD105表達量3組間兩兩比較差異有統計學意義（F=9.854，P=0.000）；4、8周，3組間CD34、CD105、ZO-1表達量兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），C組最多，B組最少。4周，A、C組新生內皮細胞逐漸圍成管腔形成新生血管，少量管腔內可見紅細胞，B組管腔形成不明顯；8周，C組見明顯新生血管管腔且部分與宿主血管溝通，A組新生血管增多，B組少許新生血管。見圖 5。
表2
移植后各時間點各組CD34、CD105及ZO-1表達量比較（n=6，3 討論
組織工程支架上的種子細胞只有在有氧代謝、細胞灌注充足、合理營養物質供應和代謝產物及時排出時才能存活[9-10]；然而，種子細胞與支架材料復合移植后，周圍宿主血管內營養物質的擴散深度僅約150 μm/h[11]。因此，尋找有效方法及時建立組織工程骨與宿主之間的有效血液循環，保證干細胞有持續營養物質供應，是干細胞存活的關鍵。
Martin等[10]將EPCs和BMSCs采用Transwell小室間接共培養及兩種細胞直接接觸共培養進行比較，結果顯示直接接觸共培養的兩種細胞成骨更明顯，認為可能由于兩種細胞的直接接觸改變了共培養環境，促進了兩種細胞之間的信號交流及生長因子分泌，從而促進了成骨。因此，本研究采用直接接觸共培養方法，將按1∶2比例共培養的自體外周血來源EPCs-BMSCs及單純培養的EPCs、BMSCs分別復合于PDPB上，同時自體移植至兔四肢肌袋內行異位體內誘導成骨培養，觀察組織工程骨及周圍組織的變化。移植8周后，3組組織工程骨支架均未出現排斥反應，且逐步降解，由膠原、骨小梁及新生骨替代。其中C組組織工程骨成血管及成骨趨勢最好，隨時間延長至8周時骨長入率為1.47%±0.21%，明顯高于其余兩組，與文獻報道一致[12]。免疫組織化學染色觀察示，移植后8周C組組織工程骨內新生血管明顯增多，且部分與宿主血管溝通，見大量表達CD34、CD105、ZO-1的血管內皮細胞，C組各因子表達量均顯著高于A、B組。
本研究結果顯示，將EPCs與BMSCs按1∶2比例共培養具有協同作用，促進了組織工程骨微血管化進程，增強了BMSCs的成骨活性，與國外研究結果一致[13]。BMSCs有高度自我更新及多向分化潛能，在體內外不同微環境下均可誘導分化為成骨細胞、成軟骨細胞和破骨細胞[14]，其在成骨過程中旁分泌多種可溶性細胞因子，如VEGF、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、BMP-2等，其中VEGF可與EPCs上的VEGF受體特異性結合，活化受體細胞內段偶聯的絡氨酸激酶，催化下游信號蛋白，促使EPCs增殖并定向內皮細胞分化，促進新生血管管腔形成[15]，因此VEGF是EPCs促進血管生成的最重要因子[16]。G-CSF可通過提高VEGF表達，提高外周血EPCs增殖能力及歸巢能力[17]。BMP-2可由BMSCs分泌，亦是EPCs分泌的重要生長因子[18]，可在移植后15min內促進MSCs成骨分化[19]。而EPCs可明顯提高BMSCs的干性功能、增殖能力及成骨分化能力，溫麗[20]研究表明在EPCs旁分泌因子的作用下，EPCs還可提高BMSCs分泌VEGF及BMP-2等成骨、成血管因子，從而促進新生血管形成及新骨形成。
本研究采用免疫組織化學染色檢測了各組組織工程骨中CD34、CD105、ZO-1陽性細胞的表達，結果顯示C組組織工程骨移植后4周即形成了血管管腔結構，并逐漸與周圍軟組織內血管溝通，形成功能性微血管（ZO-1陽性），促進了營養物質輸送，增加BMSCs存活數量，提高其增殖和成骨分化能力。CD34是血管內皮細胞特異性的標記物，能突出顯示較小的不成熟微血管和單個內皮細胞，但成熟的血管內皮細胞CD34也可表現為陽性；CD105是新生血管特異性標記物，能突出顯示新生血管，在研究腫瘤、組織工程移植物時廣泛應用；ZO-1是緊密連接蛋白，其表達表示血管為功能性血管，同時可見血管內紅細胞，ZO-1與CD105同時表達即可認為新生血管為功能性血管，具有攜帶營養物質并帶走代謝產物的功能[21]。本研究結果顯示，移植2周時3組間ZO-1表達量比較差異均無統計學意義，說明此時3組均未生成功能性微血管，而移植后4、8周，C組ZO-1表達量較其余兩組均明顯增加，生成了功能性微血管。
綜上述，將EPCs與BMSCs聯合培養可增加組織工程骨微血管網的形成及促進成骨，為自體細胞復合構建血管化組織工程骨提供了理論依據。但這兩種細胞相互作用的確切分子機制尚未完全明確，有待于進一步研究。
