引用本文： 孫振, 尹合勇, 眭翔, 余曉明, 彭江, 王玉, 汪愛媛, 郭全義, 劉舒云, 孟昊業, 盧世璧. 冰凍切片法觀察不脫鈣骨組織的熒光分布. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(11): 1429-1433. doi: 10.7507/1002-1892.20150306 復制
隨著骨和軟骨組織工程研究的深入，熒光標記的藥物、修復材料和細胞應用越來越廣泛[1]。通過熒光標記方法觀察種子細胞、支架材料和藥物的轉歸、功能、相互作用成為研究熱點[2-4]。然而傳統骨切片制備需要脫鈣、石蠟包埋等一系列處理，熒光成分會在處理過程中丟失[5]。如何直接在顯微鏡下觀察熒光表達，對于傳統切片方法來說仍是一個挑戰[6-7]。另外，一些實驗需要進行酶組織化學、組織化學染色和熒光標記骨切片觀察，比如鈣黃綠素標記，而這種熒光標記的骨切片必須來源于不脫鈣骨組織[8]；不脫鈣骨組織冰凍切片還可用于酶組織化學、免疫雜交、自動射線照相術、可視化熒光骨標記等研究[9]。所以，尋找一種與軟組織冰凍切片技術類似的切片方法，直接制備新鮮骨和軟骨組織切片，使其既能在熒光顯微鏡下觀察，又能進行常規染色，對于骨科基礎研究的發展具有重要意義。我們借鑒前人的切片技術[10]，探索出一套不脫鈣骨組織冰凍切片方法。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
清潔級健康成年雄性綠色熒光蛋白（green fluo rescent protein，GFP）轉基因SD大鼠3只，體質量230～260 g，由第三軍醫大學野戰外科研究所饋贈。實驗方法通過解放軍總醫院醫學倫理委員會批準。
艾利不干膠高透薄膜（艾利中國有限公司）。兔來源Ⅰ型膠原一抗抗體、兔來源Ⅱ型膠原一抗抗體（Abcam公司，美國）；羅丹明標記山羊抗兔IgG熒光二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。冰凍切片機（Leica 公司，德國）；OCT冰凍切片包埋劑（Sakura公司，美國）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 冰凍切片制備方法
1.2.1 切片前處理
采用頸椎脫臼法處死3只大鼠，取兩側膝關節標本，保留股骨遠端、脛骨近端及關節周圍軟組織。將標本浸入50%蔗糖，待沉底后轉移至液氮罐口速凍，然后使用OCT冰凍切片包埋劑包埋。將標本轉移至冰凍切片機冷室內，冷室內溫度及刀片溫度均提前預冷至-25～-20℃。待包埋劑完全包埋膝關節樣本后，冷室內放置30 min，使其降至冷室內溫度。見圖 1。
圖1
膝關節樣本包埋后大體觀察 ? ?1.2.2 冰凍切片方法
將包埋好的樣本轉移至樣品固定裝置上，調整位置使膝關節長軸與刀片長軸平行，旋緊螺絲將樣本牢固固定，避免在切片過程中松動。將表面涂有合成橡膠的艾利不干膠高透薄膜黏附于樣本上，用預冷紗布塊按壓使兩者充分接觸。使用一次性刀片緩慢切片，保證切片過程中速度一致。刀片向前緩慢移動同時提起薄膜，直至組織切割完畢，將薄膜完全提起置于載玻片上。切片觀測前轉置室溫，融化包埋劑，觀察前將切片浸泡于100%乙醇中10 min，以去除氣泡。
1.3 觀察指標
1.3.1 GFP熒光觀察
將切片置于載玻片，使用蓋玻片封片。熒光顯微鏡下觀察切片熒光顯示，綠色熒光使用395 nm藍色光束激發。
1.3.2 免疫熒光染色觀察
將切片置于4%多聚甲醛固定10 min，然后轉移至蒸餾水中浸泡2 min；取出切片，去除多余水分，PBS洗3次，每次5 min；3% H2O2浸泡5～20 min；PBS洗3次，每次5 min；將切片置于濕盒，加兔來源Ⅰ、Ⅱ型膠原一抗抗體，4℃冰箱過夜；棄一抗，PBS洗3次，每次5 min；加羅丹明標記山羊抗兔IgG熒光二抗，室溫避光15～30 min，PBS洗3次，每次5 min，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察Ⅰ、Ⅱ型膠原熒光分布。
1.3.3 組織學觀察
將切片置于光鏡下觀察組織結構；然后置于4%多聚甲醛固定10 min，進行組織學染色觀察。具體操作步驟如下：① 甲苯胺藍染色：將切片置于1%甲苯胺藍染液10～30 s，浸水5 min，使用甘油封片。② 茜素紅染色：將切片置于1%茜素紅染液5～10 s，甘油封片。③ HE染色：將切片置于蘇木素1 min，反復浸水數次；用濾紙吸干切片上的多余水分，置于鹽酸乙醇分化5 s，反復浸水數次；吸干多余水分，浸入氨水返藍20 s，再次浸水；吸干水分，最后將切片置于伊紅染色30 s，浸水，甘油封片。封片前僅裁剪組織周圍多余薄膜，剩余薄膜連同組織一并封片。
2 結果
2.1 切片觀察
實驗制備的大鼠膝關節冰凍切片厚度均為6 μm。大體觀察示，與包埋樣本比較，關節周圍軟組織、半月板、上下關節面軟骨、軟骨下骨、骨小梁以及股骨皮質骨均完整切割。見圖 2。光鏡下觀察示，未染色切片能清晰分辨軟骨各層細胞形態以及軟骨下骨、骨小梁的排列走行。見圖 3。
2.2 GFP熒光觀察
熒光顯微鏡觀察示，關節周圍軟組織、髕骨、半月板、脛骨平臺、股骨滑車、脛骨股骨的皮質骨以及骺板均表達綠色熒光，能清晰分辨各部分組織。局部放大可見骨小梁，邊界清楚；骺板內可見縱行排列的骺軟骨細胞；脛骨平臺軟骨細胞分層明顯。見圖 4。
2.3 免疫熒光染色觀察
冰凍切片法獲得的不脫鈣骨組織切片免疫熒光染色成功。熒光顯微鏡下觀察示軟骨下骨、骨小梁區域可見大量Ⅰ型膠原陽性表達，髕腱區域也可見Ⅰ型膠原陽性表達。上、下關節面軟骨區域可見Ⅱ型膠原陽性表達。見圖 5。
圖5
免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100） 從左至右分別為陽性染色、自發熒光、整合疊加后 ? Ⅰ型膠原 ? Ⅱ型膠原 ? ?2.4 組織學觀察
HE染色示關節軟骨完整保存，表面光滑，軟骨下骨和骨小梁清晰可見，局部放大后可觀察到各層軟骨細胞著色，分辨出潮線及軟骨下骨，骨小梁結構完整（圖 6）。甲苯胺藍染色示關節軟骨、半月板軟骨所在區域細胞外基質分布均一（圖 7）。茜素紅染色示軟骨下的骨板、半月板內部組織結構完整，而且脛骨近端的皮質骨連續性存在（圖 8）。
3 討論
目前，已有將新鮮硬組織通過冰凍切片方法用于特定研究的相關報道[11-12]。但通過將組織黏附在膠帶上進行冰凍切片的方法，不能完全滿足切片要求。如在低溫環境下，表面涂有橡膠的薄膜不能很好黏附切下的組織，以致無法保證切下組織的完整性，并且橡膠在熒光顯微鏡下會自發熒光，干擾組織熒光的觀察[13-14]。Aaron等[15]提出了一項新鮮骨組織切片制備技術，他們使用一種壓力敏感黏合劑黏附骨組織，并在表面涂覆高分子聚合物，以保證獲得完整組織切片。我們前期對各類型表面涂有黏附劑的薄膜進行了相關實驗，結果顯示艾利不干膠高透薄膜既能夠在低溫環境下具備良好的黏附性，確保切下組織的完整性，又能夠做到橡膠本身不攜帶自發熒光，成功解決了切片組織不完整、熒光觀察存在干擾的問題。本研究切片前后比較顯示，膝關節周圍的肌腱、滑膜、脂肪墊以及關節內部的骨組織均完整保留，GFP熒光表達以及免疫熒光、組織學染色均成功。提示我們提出的不脫鈣骨組織冰凍切片方法可行。
為了得到完整切片，需注意以下問題：① 堅硬鋒利的刀片是獲得高質量切片的關鍵，如果刀片不夠堅硬，則不能獲得厚度一致、表面完整的切片[16]。② 切片操作過程需在低溫下進行，而表面涂有橡膠的薄膜黏附能力和透明度對組織學染色分析具有重要影響，如果黏附能力差將會影響組織的完整性，染色后鏡下觀察不能呈現組織原有的形態特征，影響結果分析，而且薄膜透明度差，薄膜內部存在雜質，同樣直接干擾組織在鏡下的結果分析[17]。③ 在使用OCT包埋組織塊時要避免組織反復凍融，以減少冰晶形成，因冰晶形成對細胞的組織形態學評價結果有顯著影響[18-19]。為此，本研究采用將標本置于液氮罐口使其快速冷卻來降低冰晶形成對組織分析的影響。④ 為了保證骨與軟骨兩種不同介質冰凍切片的組織完整性，在切片前需將切片機冷室內溫度降至-25℃左右，減少骨和軟骨組織脫片、破損或位移的發生[7, 20]。⑤ 熒光顯微鏡下觀察免疫熒光染色結果前，應將切片表面水分晾干，避免水界面形成折射、反射光干擾觀察結果。
綜上述，本研究采用的不脫鈣骨組織冰凍切片法可行，其既能與脫鈣石蠟包埋切片一樣用于組織學、組織化學染色觀察，又能與軟組織切片一樣，快速獲得樣本用于實驗分析。但該方法能否對較大標本進行切片，以及是否能用于骨組織以外的其他硬組織研究，還需進一步驗證。
隨著骨和軟骨組織工程研究的深入，熒光標記的藥物、修復材料和細胞應用越來越廣泛[1]。通過熒光標記方法觀察種子細胞、支架材料和藥物的轉歸、功能、相互作用成為研究熱點[2-4]。然而傳統骨切片制備需要脫鈣、石蠟包埋等一系列處理，熒光成分會在處理過程中丟失[5]。如何直接在顯微鏡下觀察熒光表達，對于傳統切片方法來說仍是一個挑戰[6-7]。另外，一些實驗需要進行酶組織化學、組織化學染色和熒光標記骨切片觀察，比如鈣黃綠素標記，而這種熒光標記的骨切片必須來源于不脫鈣骨組織[8]；不脫鈣骨組織冰凍切片還可用于酶組織化學、免疫雜交、自動射線照相術、可視化熒光骨標記等研究[9]。所以，尋找一種與軟組織冰凍切片技術類似的切片方法，直接制備新鮮骨和軟骨組織切片，使其既能在熒光顯微鏡下觀察，又能進行常規染色，對于骨科基礎研究的發展具有重要意義。我們借鑒前人的切片技術[10]，探索出一套不脫鈣骨組織冰凍切片方法。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
清潔級健康成年雄性綠色熒光蛋白（green fluo rescent protein，GFP）轉基因SD大鼠3只，體質量230～260 g，由第三軍醫大學野戰外科研究所饋贈。實驗方法通過解放軍總醫院醫學倫理委員會批準。
艾利不干膠高透薄膜（艾利中國有限公司）。兔來源Ⅰ型膠原一抗抗體、兔來源Ⅱ型膠原一抗抗體（Abcam公司，美國）；羅丹明標記山羊抗兔IgG熒光二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。冰凍切片機（Leica 公司，德國）；OCT冰凍切片包埋劑（Sakura公司，美國）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 冰凍切片制備方法
1.2.1 切片前處理
采用頸椎脫臼法處死3只大鼠，取兩側膝關節標本，保留股骨遠端、脛骨近端及關節周圍軟組織。將標本浸入50%蔗糖，待沉底后轉移至液氮罐口速凍，然后使用OCT冰凍切片包埋劑包埋。將標本轉移至冰凍切片機冷室內，冷室內溫度及刀片溫度均提前預冷至-25～-20℃。待包埋劑完全包埋膝關節樣本后，冷室內放置30 min，使其降至冷室內溫度。見圖 1。
圖1
膝關節樣本包埋后大體觀察 ? ?1.2.2 冰凍切片方法
將包埋好的樣本轉移至樣品固定裝置上，調整位置使膝關節長軸與刀片長軸平行，旋緊螺絲將樣本牢固固定，避免在切片過程中松動。將表面涂有合成橡膠的艾利不干膠高透薄膜黏附于樣本上，用預冷紗布塊按壓使兩者充分接觸。使用一次性刀片緩慢切片，保證切片過程中速度一致。刀片向前緩慢移動同時提起薄膜，直至組織切割完畢，將薄膜完全提起置于載玻片上。切片觀測前轉置室溫，融化包埋劑，觀察前將切片浸泡于100%乙醇中10 min，以去除氣泡。
1.3 觀察指標
1.3.1 GFP熒光觀察
將切片置于載玻片，使用蓋玻片封片。熒光顯微鏡下觀察切片熒光顯示，綠色熒光使用395 nm藍色光束激發。
1.3.2 免疫熒光染色觀察
將切片置于4%多聚甲醛固定10 min，然后轉移至蒸餾水中浸泡2 min；取出切片，去除多余水分，PBS洗3次，每次5 min；3% H2O2浸泡5～20 min；PBS洗3次，每次5 min；將切片置于濕盒，加兔來源Ⅰ、Ⅱ型膠原一抗抗體，4℃冰箱過夜；棄一抗，PBS洗3次，每次5 min；加羅丹明標記山羊抗兔IgG熒光二抗，室溫避光15～30 min，PBS洗3次，每次5 min，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察Ⅰ、Ⅱ型膠原熒光分布。
1.3.3 組織學觀察
將切片置于光鏡下觀察組織結構；然后置于4%多聚甲醛固定10 min，進行組織學染色觀察。具體操作步驟如下：① 甲苯胺藍染色：將切片置于1%甲苯胺藍染液10～30 s，浸水5 min，使用甘油封片。② 茜素紅染色：將切片置于1%茜素紅染液5～10 s，甘油封片。③ HE染色：將切片置于蘇木素1 min，反復浸水數次；用濾紙吸干切片上的多余水分，置于鹽酸乙醇分化5 s，反復浸水數次；吸干多余水分，浸入氨水返藍20 s，再次浸水；吸干水分，最后將切片置于伊紅染色30 s，浸水，甘油封片。封片前僅裁剪組織周圍多余薄膜，剩余薄膜連同組織一并封片。
2 結果
2.1 切片觀察
實驗制備的大鼠膝關節冰凍切片厚度均為6 μm。大體觀察示，與包埋樣本比較，關節周圍軟組織、半月板、上下關節面軟骨、軟骨下骨、骨小梁以及股骨皮質骨均完整切割。見圖 2。光鏡下觀察示，未染色切片能清晰分辨軟骨各層細胞形態以及軟骨下骨、骨小梁的排列走行。見圖 3。
2.2 GFP熒光觀察
熒光顯微鏡觀察示，關節周圍軟組織、髕骨、半月板、脛骨平臺、股骨滑車、脛骨股骨的皮質骨以及骺板均表達綠色熒光，能清晰分辨各部分組織。局部放大可見骨小梁，邊界清楚；骺板內可見縱行排列的骺軟骨細胞；脛骨平臺軟骨細胞分層明顯。見圖 4。
2.3 免疫熒光染色觀察
冰凍切片法獲得的不脫鈣骨組織切片免疫熒光染色成功。熒光顯微鏡下觀察示軟骨下骨、骨小梁區域可見大量Ⅰ型膠原陽性表達，髕腱區域也可見Ⅰ型膠原陽性表達。上、下關節面軟骨區域可見Ⅱ型膠原陽性表達。見圖 5。
圖5
免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100） 從左至右分別為陽性染色、自發熒光、整合疊加后 ? Ⅰ型膠原 ? Ⅱ型膠原 ? ?2.4 組織學觀察
HE染色示關節軟骨完整保存，表面光滑，軟骨下骨和骨小梁清晰可見，局部放大后可觀察到各層軟骨細胞著色，分辨出潮線及軟骨下骨，骨小梁結構完整（圖 6）。甲苯胺藍染色示關節軟骨、半月板軟骨所在區域細胞外基質分布均一（圖 7）。茜素紅染色示軟骨下的骨板、半月板內部組織結構完整，而且脛骨近端的皮質骨連續性存在（圖 8）。
3 討論
目前，已有將新鮮硬組織通過冰凍切片方法用于特定研究的相關報道[11-12]。但通過將組織黏附在膠帶上進行冰凍切片的方法，不能完全滿足切片要求。如在低溫環境下，表面涂有橡膠的薄膜不能很好黏附切下的組織，以致無法保證切下組織的完整性，并且橡膠在熒光顯微鏡下會自發熒光，干擾組織熒光的觀察[13-14]。Aaron等[15]提出了一項新鮮骨組織切片制備技術，他們使用一種壓力敏感黏合劑黏附骨組織，并在表面涂覆高分子聚合物，以保證獲得完整組織切片。我們前期對各類型表面涂有黏附劑的薄膜進行了相關實驗，結果顯示艾利不干膠高透薄膜既能夠在低溫環境下具備良好的黏附性，確保切下組織的完整性，又能夠做到橡膠本身不攜帶自發熒光，成功解決了切片組織不完整、熒光觀察存在干擾的問題。本研究切片前后比較顯示，膝關節周圍的肌腱、滑膜、脂肪墊以及關節內部的骨組織均完整保留，GFP熒光表達以及免疫熒光、組織學染色均成功。提示我們提出的不脫鈣骨組織冰凍切片方法可行。
為了得到完整切片，需注意以下問題：① 堅硬鋒利的刀片是獲得高質量切片的關鍵，如果刀片不夠堅硬，則不能獲得厚度一致、表面完整的切片[16]。② 切片操作過程需在低溫下進行，而表面涂有橡膠的薄膜黏附能力和透明度對組織學染色分析具有重要影響，如果黏附能力差將會影響組織的完整性，染色后鏡下觀察不能呈現組織原有的形態特征，影響結果分析，而且薄膜透明度差，薄膜內部存在雜質，同樣直接干擾組織在鏡下的結果分析[17]。③ 在使用OCT包埋組織塊時要避免組織反復凍融，以減少冰晶形成，因冰晶形成對細胞的組織形態學評價結果有顯著影響[18-19]。為此，本研究采用將標本置于液氮罐口使其快速冷卻來降低冰晶形成對組織分析的影響。④ 為了保證骨與軟骨兩種不同介質冰凍切片的組織完整性，在切片前需將切片機冷室內溫度降至-25℃左右，減少骨和軟骨組織脫片、破損或位移的發生[7, 20]。⑤ 熒光顯微鏡下觀察免疫熒光染色結果前，應將切片表面水分晾干，避免水界面形成折射、反射光干擾觀察結果。
綜上述，本研究采用的不脫鈣骨組織冰凍切片法可行，其既能與脫鈣石蠟包埋切片一樣用于組織學、組織化學染色觀察，又能與軟組織切片一樣，快速獲得樣本用于實驗分析。但該方法能否對較大標本進行切片，以及是否能用于骨組織以外的其他硬組織研究，還需進一步驗證。
