引用本文： 蔡俊, 孫鈺, 戈應濱, 曹曉建. 他克莫司刺激星形膠質細胞分泌EGF促進神經細胞突起生長的研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(11): 1423-1428. doi: 10.7507/1002-1892.20150305 復制
脊髓損傷治療一直是醫學界難題，臨床上缺少有效治療方法。脊髓損傷修復的關鍵是提高神經元的存活和增殖，促進神經元軸突再生。既往研究證實他克莫司（FK506）能夠促進脊髓損傷大鼠的神經功能恢復[1]，但具體作用機制不明確。Martinez等[2]報道星形膠質細胞在甲狀腺激素（T3）誘導小腦神經細胞發育過程中發揮重要作用；同時，FK506能夠影響星形膠質細胞多個信號通路和調節基因的表達[3]。由此我們設想，FK506促進神經功能恢復的作用有可能是通過膠質細胞來間接發揮作用。星形膠質細胞是中樞神經系統主要的膠質細胞，通過調節谷氨酸攝取和釋放、清除自由基、產生細胞因子和一氧化氮等，對神經元提供營養和代謝支持、調節突觸活動和神經元的可塑性、影響神經元的存活；膠質細胞的活化在脊髓損傷早期可改善神經元存活的內環境，促進脊髓損傷修復[4-6]。本實驗用FK506刺激星形膠質細胞獲取上清液培養神經細胞，觀察神經細胞突起生長情況，同時采用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）和EGF抗體中和實驗驗證上清液中EGF的分泌及神經營養作用，觀察EGF促進神經細胞突起生長的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2日齡SD大鼠6只，雌雄不限；孕15 d SD大鼠2只；均由南京醫科大學實驗動物中心提供。
Neurobasal神經細胞培養液、DMEM、DMEM/F12、H-DMEM、胰蛋白酶、FBS、馬血清（GIBCO公司，美國）；兔抗鼠Doublecortin、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）單克隆抗體、小鼠抗大鼠微管相關蛋白（microtubule-associated protein 2，MAP2）單克隆抗體、山羊抗小鼠熒光染料二抗（Alexa568）、山羊抗兔熒光染料二抗（Alexa488）（Santa Cruz公司，美國）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、FK506、Triton X-100（Sigma公司，美國）；DAPI熒光封片劑（Southern Biotech公司，美國）；EGF中和抗體（R&D公司，美國）；反轉錄試劑盒（Fermentas公司，美國）；RT-qPCR試劑盒（ABI公司，美國）；ELISA檢測試劑盒（武漢優爾生商貿有限公司）。
3k超濾離心管（Millipore公司，美國）；Elx800型酶標儀（Bio-Tek公司，美國）；HF90型CO2細胞培養箱（Heal Force公司，美國）；TMS倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）；高速低溫離心機（Beckman Coulter公司，美國）；Step One Plus型RT-qPCR儀（ABI公司，美國）；LSM710激光共聚焦顯微鏡、ZEN2009軟件系統、Zeiss LSM Image Browser軟件（Zeiss公司，德國）。
1.2 FK506促進脊髓星形膠質細胞合成分泌EGF
1.2.1 脊髓星形膠質細胞培養及鑒定
取2日齡SD大鼠，乙醇浸泡處死，取出脊髓，去除硬脊膜后剪成乳糜狀，0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液后，用含10%FBS的H-DMEM培養液終止消化；收集細胞，以5×105個/mL密度接種至培養皿，48 h后更換培養液，以后每3天換液1次。原代培養8～10 d后待細胞長至致密單層時，0.25%胰蛋白酶消化傳代擴增。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態學變化。
鑒定：取第2代培養細胞，以5×105個/mL密度接種于蓋玻片，貼壁生長后，PBS清洗5 min×3次；4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗5 min×3 次；0.2%Triton X-100透膜30 min，PBS洗滌5 min×3次；5%BSA封閉30 min；用1∶200稀釋的GFAP一抗4℃孵育過夜；PBS清洗5 min×3次；將1∶500稀釋的熒光二抗室溫下避光孵育1 h后，PBS清洗5 min×3次。DAPI 染色5 min，封片；熒光顯微鏡下觀察。
1.2.2 條件培養液的制備
星形膠質細胞達80%融合時，用含1%FBS的DMEM培養液培養12 h；更換無血清DMEM培養液3 mL，實驗組加入5 μL FK506濃縮儲存液（FK506原料藥5 mg溶于500 μL無菌DMSO，分裝，避光凍存于-20℃冰箱），使培養液中FK506濃度為20 μmol/L；對照組加入5 μL DMSO。24 h后收集兩組細胞上清，以800×g離心10 min；取上清于3k超濾離心管中，以7 500×g離心20 min；收集濃縮液，加入Neurobasal神經細胞培養液，調整體積與濃縮前體積相同，-20℃保存。
1.2.3 ELISA檢測上清EGF
取兩組條件培養液上清后，按ELISA試劑盒說明書方法檢測兩組EGF濃度。
1.2.4 RT-qPCR檢測EGF
mRNA表達收集兩組細胞，加入Trizol，吹打后離心管中靜置5 min；加入三氯甲烷，震蕩15 s；于4℃、12 000×g離心15 min；取上層水相，加入等體積異丙醇，震蕩后靜置10 min；于4℃、12 000×g離心10 min；棄上清，沉淀中加入1 mL 75%乙醇（DEPC水現配），洗滌沉淀；4℃、7 500×g離心5 min；棄上清，加入RNase-free水，充分溶解。紫外分光光度計檢測RNA濃度。取RNA 1.5 μg、Random primer 1 μL，加入Nuclease-free水補齊至12 μL；混勻，65℃、5 min；加5×反應緩沖液4 μL、dNTP 2 μL、反轉錄酶1 μL、RNA酶抑制劑1 μL，混勻，25℃、5 min，42℃、60 min，70℃、5 min；所得cDNA溶液-20℃保存。反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，40個循環。引物由南京金斯瑞公司合成，EGF上游引物：5'-CTTAGGGATGTGGGGGACTT-3'，下游引物: 5'-TTGGGCTGTTGGTGTTCCTC-3'；對照基因GAPDH上游引物： 5'-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，下游引物: 5'-TACTCAGCACCAGCATCACC-3'。以Ct值比值方法計算兩組EGF基因相對表達量。
1.3 FK506處理后的星形膠質細胞上清促進神經細胞突起生長
1.3.1 脊髓神經元細胞分離培養及鑒定
脫頸椎處死孕15 d SD大鼠，取出胚胎乙醇消毒，經背部剪開皮膚，分離取出脊髓，剝除脊膜及血管組織，將脊髓剪成1 mm3大小；0.05%胰蛋白酶37℃消化15 min；加入1 mL FBS終止消化，分3次吹打并吸取上層液體[7]。梯度離心后，收取梯度面和上面培養液分界面間的神經元細胞層[8]；再次200×g離心6 min后，用含15%FBS的DMEM/F12重懸下層細胞沉淀，調整細胞密度為1×106個/mL，接種至預涂多聚賴氨酸的蓋玻片；37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育。培養3 h后首次換液，清洗去除細胞碎片，倒置相差顯微鏡觀察原代神經細胞形態學變化。
鑒定：待細胞貼壁牢靠后，取出蓋玻片，用冰PBS漂洗3 min×2次，4%多聚甲醛固定30 min；PBS漂洗3 min×3次，0.05%Triton X-100孵育5 min；PBS漂洗3 min×3次，5%BSA室溫封閉30 min；MAP2和Doublecortin單克隆一抗（1∶200）孵育4℃過夜，陰性對照用一抗稀釋液不加一抗抗體；PBS漂洗5 min×3次，Alexa488、Alexa568標記二抗室溫孵育1 h；PBS漂洗3 min×5次，DAPI熒光封片劑封片[9]，熒光顯微鏡下觀察。
1.3.2 實驗分組
為觀察FK506處理后的星形膠質細胞上清對脊髓神經元細胞突起生長的促進作用，分別采用1.2.2中獲得的實驗組和對照組條件培養液培養脊髓神經元細胞（分別為A、B組）；為進一步確認星形膠質細胞分泌的EGF在FK506促進神經細胞突起生長中的作用，將對照組和實驗組條件培養液預先用2 μg/ mL EGF中和抗體處理后再培養脊髓神經元細胞（分別為C、D組）。
1.3.3 神經突長度測量
培養3 d后取出各組細胞爬片，MAP2單克隆一抗（1∶200）孵育4℃過夜；PBS漂洗，Alexa568標記二抗室溫孵育；激光共聚焦顯微鏡下每組標本取40個視野，用ZEN2009軟件系統拍照，每組至少隨機選擇60個獨立神經元，分別用Zeiss LSM Image Browser軟件對單個神經細胞突起長度進行測量，結果用神經突總長度（單個神經細胞從胞體到所有神經突起末端的長度總和）[10]和最長神經突長度兩個指標來衡量神經突起生長情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 FK506促進脊髓星形膠質細胞合成分泌EGF
2.1.1 脊髓星形膠質細胞形態學觀察及免疫熒光染色鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，脊髓星形膠質細胞呈三角形和多角形貼壁生長，突起短、分支多，表面粗糙，隨著細胞增殖可融合成片；傳代后細胞形態無明顯改變。見圖 1。第2代細胞經GFAP免疫熒光染色可見綠色熒光（星形膠質細胞特異性標記），細胞核染為藍色；染色陽性率達95%以上。見圖 2。
圖1
脊髓星形膠質細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40） ? 原代細胞 ? 第1代細胞 ? ?2.1.2 ELISA檢測和RT-qPCR檢測
ELISA檢測示，實驗組EGF含量為0.241±0.044，顯著高于對照組的0.166±0.014，比較差異有統計學意義（t=3.93，P=0.01）。RT-qPCR檢測得到了相同結果，實驗組EGF基因相對表達量為1.12±0.25，顯著高于對照組的0.46±0.11，比較差異有統計學意義（t=5.78，P=0.00）。
2.2 FK506處理后的星形膠質細胞上清促進神經細胞突起生長
2.2.1 脊髓神經元細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，大鼠神經元胞體呈圓形，體積小，透亮；貼壁后逐漸變扁平，呈橢圓形或類圓形，周圍有光暈，從胞體生長出細長突起，逐漸相互交織成網狀。見圖 3。培養細胞經MAP2和Doublecortin免疫熒光雙重染色鑒定示，90%以上細胞呈MAP2和Doublecortin染色陽性，其中MAP2染色呈紅色，神經突起清晰；Doublecortin染色呈綠色。見圖 4。
2.2.2 神經突長度測量
C、D組神經突總長度和最長神經突長度均顯著小于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組神經細胞突總長度和最長神經突長度均明顯大于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 5、表 1。
表1
各組神經突總長度和最長神經突長度比較（n=60，μm，3 討論
FK506是一種強力免疫抑制劑，通過與FK506結合蛋白和鈣依賴磷酸酶結合形成復合體，能夠抑制淋巴細胞增殖。有研究[11-12]發現FK506具有促進脊髓損傷后神經恢復的作用。但FK506的神經保護作用機制還不清楚。Szydlowska 等[13]研究表明FK506能阻斷谷氨酸中毒導致的星形膠質細胞凋亡和腦外傷時的星形膠質細胞死亡過程中ERK1/2信號通路的激活，達到神經系統保護作用。也有相關研究證實FK506治療后，能夠抑制鈣調磷酸酶的活化，可減少脊髓損傷后星形膠質細胞和少突膠質細胞等白質區域細胞的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性[14]。我們既往的實驗結果[1]表明，FK506可促進脊髓損傷后大鼠運動功能恢復，但在體外實驗中未能觀察到FK506明顯促進神經細胞突起的生長。因此我們考慮FK506的神經保護作用需要通過中介細胞來實現。我們前期實驗采用FK506刺激膠質細胞后進行基因譜分析，發現EGF的表達明顯增加。
星形膠質細胞是神經膠質瘢痕增生的主要細胞成分，曾被認為在阻礙中樞神經系統軸突再生過程中起重要作用[15]。近年Rolls等[16]提出在中樞神經損傷中，膠質瘢痕組織形成既能抑制軸突生長，同時也參加內源性局部免疫調節和修復過程，發揮有利于神經功能恢復的雙重作用。Norenberg[17]發現活化增生的膠質瘢痕是脊髓對外界損傷的一個反應性修復過程，是星形膠質細胞增殖、胞體和細胞核過度肥大的過程。如果脊髓損傷后去除增生的星形膠質細胞，可導致神經元變性和運動功能障礙增加[18]。因此，損傷部位的星形膠質細胞反應可能起到保護損傷神經細胞和促進功能恢復的作用。Zawadzka等[3]研究表明FK506能夠影響星形膠質細胞多個信號通路和調節基因的表達，星形膠質細胞的神經營養因子表達調節是親免素配體的潛在神經保護機制。我們假設FK506可能通過調節星形細胞的活性提供神經保護作用。本研究中，我們用FK506處理后的星形膠質細胞上清液培養脊髓神經元細胞，發現神經突長度明顯增加，表明FK506可能刺激星形膠質細胞分泌某種細胞因子來促進神經細胞突起的生長。
此外，有文獻[2]指出EGF/磷脂酰肌醇3-激酶途徑在甲狀腺激素處理的星形膠質細胞促進神經細胞軸突生長過程中發揮重要作用。EGF對于哺乳動物細胞是一強力的有絲分裂因子[19]，可促進中樞神經系統神經元祖細胞、神經元以及神經膠質細胞增殖和分化[20-21]；EGF也是一個重要的神經營養因子，能刺激神經突生長[22]；此外，EGF可通過刺激甲狀腺激素和多功能蛋白聚糖G3片段來促進神經突生長[2, 23]。本研究通過RT-qPCR和ELISA檢測，結果表明FK506處理后的星形膠質細胞上清液中EGF含量明顯增高，用此條件培養液培養神經細胞能夠明顯促進神經細胞突起生長。然后在兩組星形膠質細胞上清條件培養液中加入兔抗大鼠EGF單克隆抗體，與條件培養液中的EGF產生特異性結合來中和其中的EGF，從而阻斷EGF對神經細胞的作用，結果表明兩組條件培養液培養的神經細胞突起長度無顯著性差異。進一步印證了FK506對脊髓損傷的神經保護作用是由星形膠質細胞分泌的EGF來實現的，與既往研究結果中膠質細胞的神經營養作用一致[24-26]。
脊髓損傷治療一直是醫學界難題，臨床上缺少有效治療方法。脊髓損傷修復的關鍵是提高神經元的存活和增殖，促進神經元軸突再生。既往研究證實他克莫司（FK506）能夠促進脊髓損傷大鼠的神經功能恢復[1]，但具體作用機制不明確。Martinez等[2]報道星形膠質細胞在甲狀腺激素（T3）誘導小腦神經細胞發育過程中發揮重要作用；同時，FK506能夠影響星形膠質細胞多個信號通路和調節基因的表達[3]。由此我們設想，FK506促進神經功能恢復的作用有可能是通過膠質細胞來間接發揮作用。星形膠質細胞是中樞神經系統主要的膠質細胞，通過調節谷氨酸攝取和釋放、清除自由基、產生細胞因子和一氧化氮等，對神經元提供營養和代謝支持、調節突觸活動和神經元的可塑性、影響神經元的存活；膠質細胞的活化在脊髓損傷早期可改善神經元存活的內環境，促進脊髓損傷修復[4-6]。本實驗用FK506刺激星形膠質細胞獲取上清液培養神經細胞，觀察神經細胞突起生長情況，同時采用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）和EGF抗體中和實驗驗證上清液中EGF的分泌及神經營養作用，觀察EGF促進神經細胞突起生長的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2日齡SD大鼠6只，雌雄不限；孕15 d SD大鼠2只；均由南京醫科大學實驗動物中心提供。
Neurobasal神經細胞培養液、DMEM、DMEM/F12、H-DMEM、胰蛋白酶、FBS、馬血清（GIBCO公司，美國）；兔抗鼠Doublecortin、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）單克隆抗體、小鼠抗大鼠微管相關蛋白（microtubule-associated protein 2，MAP2）單克隆抗體、山羊抗小鼠熒光染料二抗（Alexa568）、山羊抗兔熒光染料二抗（Alexa488）（Santa Cruz公司，美國）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、FK506、Triton X-100（Sigma公司，美國）；DAPI熒光封片劑（Southern Biotech公司，美國）；EGF中和抗體（R&D公司，美國）；反轉錄試劑盒（Fermentas公司，美國）；RT-qPCR試劑盒（ABI公司，美國）；ELISA檢測試劑盒（武漢優爾生商貿有限公司）。
3k超濾離心管（Millipore公司，美國）；Elx800型酶標儀（Bio-Tek公司，美國）；HF90型CO2細胞培養箱（Heal Force公司，美國）；TMS倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）；高速低溫離心機（Beckman Coulter公司，美國）；Step One Plus型RT-qPCR儀（ABI公司，美國）；LSM710激光共聚焦顯微鏡、ZEN2009軟件系統、Zeiss LSM Image Browser軟件（Zeiss公司，德國）。
1.2 FK506促進脊髓星形膠質細胞合成分泌EGF
1.2.1 脊髓星形膠質細胞培養及鑒定
取2日齡SD大鼠，乙醇浸泡處死，取出脊髓，去除硬脊膜后剪成乳糜狀，0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液后，用含10%FBS的H-DMEM培養液終止消化；收集細胞，以5×105個/mL密度接種至培養皿，48 h后更換培養液，以后每3天換液1次。原代培養8～10 d后待細胞長至致密單層時，0.25%胰蛋白酶消化傳代擴增。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態學變化。
鑒定：取第2代培養細胞，以5×105個/mL密度接種于蓋玻片，貼壁生長后，PBS清洗5 min×3次；4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗5 min×3 次；0.2%Triton X-100透膜30 min，PBS洗滌5 min×3次；5%BSA封閉30 min；用1∶200稀釋的GFAP一抗4℃孵育過夜；PBS清洗5 min×3次；將1∶500稀釋的熒光二抗室溫下避光孵育1 h后，PBS清洗5 min×3次。DAPI 染色5 min，封片；熒光顯微鏡下觀察。
1.2.2 條件培養液的制備
星形膠質細胞達80%融合時，用含1%FBS的DMEM培養液培養12 h；更換無血清DMEM培養液3 mL，實驗組加入5 μL FK506濃縮儲存液（FK506原料藥5 mg溶于500 μL無菌DMSO，分裝，避光凍存于-20℃冰箱），使培養液中FK506濃度為20 μmol/L；對照組加入5 μL DMSO。24 h后收集兩組細胞上清，以800×g離心10 min；取上清于3k超濾離心管中，以7 500×g離心20 min；收集濃縮液，加入Neurobasal神經細胞培養液，調整體積與濃縮前體積相同，-20℃保存。
1.2.3 ELISA檢測上清EGF
取兩組條件培養液上清后，按ELISA試劑盒說明書方法檢測兩組EGF濃度。
1.2.4 RT-qPCR檢測EGF
mRNA表達收集兩組細胞，加入Trizol，吹打后離心管中靜置5 min；加入三氯甲烷，震蕩15 s；于4℃、12 000×g離心15 min；取上層水相，加入等體積異丙醇，震蕩后靜置10 min；于4℃、12 000×g離心10 min；棄上清，沉淀中加入1 mL 75%乙醇（DEPC水現配），洗滌沉淀；4℃、7 500×g離心5 min；棄上清，加入RNase-free水，充分溶解。紫外分光光度計檢測RNA濃度。取RNA 1.5 μg、Random primer 1 μL，加入Nuclease-free水補齊至12 μL；混勻，65℃、5 min；加5×反應緩沖液4 μL、dNTP 2 μL、反轉錄酶1 μL、RNA酶抑制劑1 μL，混勻，25℃、5 min，42℃、60 min，70℃、5 min；所得cDNA溶液-20℃保存。反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，40個循環。引物由南京金斯瑞公司合成，EGF上游引物：5'-CTTAGGGATGTGGGGGACTT-3'，下游引物: 5'-TTGGGCTGTTGGTGTTCCTC-3'；對照基因GAPDH上游引物： 5'-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，下游引物: 5'-TACTCAGCACCAGCATCACC-3'。以Ct值比值方法計算兩組EGF基因相對表達量。
1.3 FK506處理后的星形膠質細胞上清促進神經細胞突起生長
1.3.1 脊髓神經元細胞分離培養及鑒定
脫頸椎處死孕15 d SD大鼠，取出胚胎乙醇消毒，經背部剪開皮膚，分離取出脊髓，剝除脊膜及血管組織，將脊髓剪成1 mm3大小；0.05%胰蛋白酶37℃消化15 min；加入1 mL FBS終止消化，分3次吹打并吸取上層液體[7]。梯度離心后，收取梯度面和上面培養液分界面間的神經元細胞層[8]；再次200×g離心6 min后，用含15%FBS的DMEM/F12重懸下層細胞沉淀，調整細胞密度為1×106個/mL，接種至預涂多聚賴氨酸的蓋玻片；37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育。培養3 h后首次換液，清洗去除細胞碎片，倒置相差顯微鏡觀察原代神經細胞形態學變化。
鑒定：待細胞貼壁牢靠后，取出蓋玻片，用冰PBS漂洗3 min×2次，4%多聚甲醛固定30 min；PBS漂洗3 min×3次，0.05%Triton X-100孵育5 min；PBS漂洗3 min×3次，5%BSA室溫封閉30 min；MAP2和Doublecortin單克隆一抗（1∶200）孵育4℃過夜，陰性對照用一抗稀釋液不加一抗抗體；PBS漂洗5 min×3次，Alexa488、Alexa568標記二抗室溫孵育1 h；PBS漂洗3 min×5次，DAPI熒光封片劑封片[9]，熒光顯微鏡下觀察。
1.3.2 實驗分組
為觀察FK506處理后的星形膠質細胞上清對脊髓神經元細胞突起生長的促進作用，分別采用1.2.2中獲得的實驗組和對照組條件培養液培養脊髓神經元細胞（分別為A、B組）；為進一步確認星形膠質細胞分泌的EGF在FK506促進神經細胞突起生長中的作用，將對照組和實驗組條件培養液預先用2 μg/ mL EGF中和抗體處理后再培養脊髓神經元細胞（分別為C、D組）。
1.3.3 神經突長度測量
培養3 d后取出各組細胞爬片，MAP2單克隆一抗（1∶200）孵育4℃過夜；PBS漂洗，Alexa568標記二抗室溫孵育；激光共聚焦顯微鏡下每組標本取40個視野，用ZEN2009軟件系統拍照，每組至少隨機選擇60個獨立神經元，分別用Zeiss LSM Image Browser軟件對單個神經細胞突起長度進行測量，結果用神經突總長度（單個神經細胞從胞體到所有神經突起末端的長度總和）[10]和最長神經突長度兩個指標來衡量神經突起生長情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 FK506促進脊髓星形膠質細胞合成分泌EGF
2.1.1 脊髓星形膠質細胞形態學觀察及免疫熒光染色鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，脊髓星形膠質細胞呈三角形和多角形貼壁生長，突起短、分支多，表面粗糙，隨著細胞增殖可融合成片；傳代后細胞形態無明顯改變。見圖 1。第2代細胞經GFAP免疫熒光染色可見綠色熒光（星形膠質細胞特異性標記），細胞核染為藍色；染色陽性率達95%以上。見圖 2。
圖1
脊髓星形膠質細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40） ? 原代細胞 ? 第1代細胞 ? ?2.1.2 ELISA檢測和RT-qPCR檢測
ELISA檢測示，實驗組EGF含量為0.241±0.044，顯著高于對照組的0.166±0.014，比較差異有統計學意義（t=3.93，P=0.01）。RT-qPCR檢測得到了相同結果，實驗組EGF基因相對表達量為1.12±0.25，顯著高于對照組的0.46±0.11，比較差異有統計學意義（t=5.78，P=0.00）。
2.2 FK506處理后的星形膠質細胞上清促進神經細胞突起生長
2.2.1 脊髓神經元細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，大鼠神經元胞體呈圓形，體積小，透亮；貼壁后逐漸變扁平，呈橢圓形或類圓形，周圍有光暈，從胞體生長出細長突起，逐漸相互交織成網狀。見圖 3。培養細胞經MAP2和Doublecortin免疫熒光雙重染色鑒定示，90%以上細胞呈MAP2和Doublecortin染色陽性，其中MAP2染色呈紅色，神經突起清晰；Doublecortin染色呈綠色。見圖 4。
2.2.2 神經突長度測量
C、D組神經突總長度和最長神經突長度均顯著小于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組神經細胞突總長度和最長神經突長度均明顯大于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 5、表 1。
表1
各組神經突總長度和最長神經突長度比較（n=60，μm，3 討論
FK506是一種強力免疫抑制劑，通過與FK506結合蛋白和鈣依賴磷酸酶結合形成復合體，能夠抑制淋巴細胞增殖。有研究[11-12]發現FK506具有促進脊髓損傷后神經恢復的作用。但FK506的神經保護作用機制還不清楚。Szydlowska 等[13]研究表明FK506能阻斷谷氨酸中毒導致的星形膠質細胞凋亡和腦外傷時的星形膠質細胞死亡過程中ERK1/2信號通路的激活，達到神經系統保護作用。也有相關研究證實FK506治療后，能夠抑制鈣調磷酸酶的活化，可減少脊髓損傷后星形膠質細胞和少突膠質細胞等白質區域細胞的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性[14]。我們既往的實驗結果[1]表明，FK506可促進脊髓損傷后大鼠運動功能恢復，但在體外實驗中未能觀察到FK506明顯促進神經細胞突起的生長。因此我們考慮FK506的神經保護作用需要通過中介細胞來實現。我們前期實驗采用FK506刺激膠質細胞后進行基因譜分析，發現EGF的表達明顯增加。
星形膠質細胞是神經膠質瘢痕增生的主要細胞成分，曾被認為在阻礙中樞神經系統軸突再生過程中起重要作用[15]。近年Rolls等[16]提出在中樞神經損傷中，膠質瘢痕組織形成既能抑制軸突生長，同時也參加內源性局部免疫調節和修復過程，發揮有利于神經功能恢復的雙重作用。Norenberg[17]發現活化增生的膠質瘢痕是脊髓對外界損傷的一個反應性修復過程，是星形膠質細胞增殖、胞體和細胞核過度肥大的過程。如果脊髓損傷后去除增生的星形膠質細胞，可導致神經元變性和運動功能障礙增加[18]。因此，損傷部位的星形膠質細胞反應可能起到保護損傷神經細胞和促進功能恢復的作用。Zawadzka等[3]研究表明FK506能夠影響星形膠質細胞多個信號通路和調節基因的表達，星形膠質細胞的神經營養因子表達調節是親免素配體的潛在神經保護機制。我們假設FK506可能通過調節星形細胞的活性提供神經保護作用。本研究中，我們用FK506處理后的星形膠質細胞上清液培養脊髓神經元細胞，發現神經突長度明顯增加，表明FK506可能刺激星形膠質細胞分泌某種細胞因子來促進神經細胞突起的生長。
此外，有文獻[2]指出EGF/磷脂酰肌醇3-激酶途徑在甲狀腺激素處理的星形膠質細胞促進神經細胞軸突生長過程中發揮重要作用。EGF對于哺乳動物細胞是一強力的有絲分裂因子[19]，可促進中樞神經系統神經元祖細胞、神經元以及神經膠質細胞增殖和分化[20-21]；EGF也是一個重要的神經營養因子，能刺激神經突生長[22]；此外，EGF可通過刺激甲狀腺激素和多功能蛋白聚糖G3片段來促進神經突生長[2, 23]。本研究通過RT-qPCR和ELISA檢測，結果表明FK506處理后的星形膠質細胞上清液中EGF含量明顯增高，用此條件培養液培養神經細胞能夠明顯促進神經細胞突起生長。然后在兩組星形膠質細胞上清條件培養液中加入兔抗大鼠EGF單克隆抗體，與條件培養液中的EGF產生特異性結合來中和其中的EGF，從而阻斷EGF對神經細胞的作用，結果表明兩組條件培養液培養的神經細胞突起長度無顯著性差異。進一步印證了FK506對脊髓損傷的神經保護作用是由星形膠質細胞分泌的EGF來實現的，與既往研究結果中膠質細胞的神經營養作用一致[24-26]。
