引用本文： 宋登新, 曹云, 丁徐, 何小文, 黃濤, 趙毅, 祁軍. 高遷移率族蛋白1在骨關節炎滑膜細胞中的表達及意義. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(11): 1376-1380. doi: 10.7507/1002-1892.20150296 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是目前最常見的一種關節病變，我國流行病學研究顯示，OA患者主要集中在老年人群，65歲以上人群發病率＞50%，75歲以上則達到80%以上[1]。在OA不同階段，多種細胞因子在關節組織損傷中發揮了重要作用[2]。高遷移率族蛋白1（high mobility group box chromosomal protein 1，HMGB1）是一個與慢性關節炎有關的重要炎性介質，可激活細胞內信號轉導途徑，啟動多種炎性因子介導關節組織的炎性損傷。本研究從人膝關節組織中分離滑膜細胞，建立OA和正常膝關節滑膜細胞株，觀察HMGB1的分布，利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）基因沉默技術抑制OA滑膜細胞株的HMGB1基因，通過與干擾前OA滑膜細胞株比較，研究HMGB1基因表達下調對OA滑膜細胞分泌IL-1β和TNF-α的影響，為進一步闡明OA發生的分子機制提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM培養液、FBS（GIBCO公司，美國）；牛胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；兔抗人HMGB1多克隆抗體、熒光二抗FITC（深圳晶美生物工程有限公司）；IL-1β及TNF-α ELISA試劑盒（Biosource公司，美國）；Pgenesil-1質粒和大腸桿菌DH5α由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院骨科實驗室保存；限制性內切酶HindⅢ、BamHⅠ以及T4 DNA Ligase、SalⅠ（NEB）、G418（華美生物工程有限公司）；脂質體Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美國）；SP免疫組織化學試劑盒、DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）；引物由上海Sangon公司合成。倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image Quant TL軟件（華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院實驗中心）。
1.2 實驗標本
收集2013年1月－2015年1月于上海市第一人民醫院寶山醫院骨科34例行關節手術患者的關節滑膜組織。其中，OA患者23例，男8例，女15例；年齡49～70歲，平均59.6歲；患者均根據中華醫學會風濕病學分會2010年版指南標準確診為OA，接受人工膝關節表面置換。正常膝關節11例，男7例，女4例；年齡47～73歲，平均51.9歲；均為膝關節半月板損傷，行關節鏡下手術；經關節鏡診斷未達OA診斷標準且無其他關節病變，取鏡下觀察正常滑膜組織。膝關節滑膜標本取材均經患者知情同意，由上海市第一人民醫院寶山分院倫理委員會批準。
1.3 滑膜細胞體外培養及觀測
1.3.1 細胞培養及形態學觀察
取OA及正常膝關節滑膜組織，采用組織塊培養法，在超凈工作臺內用D-Hank液漂洗3次，剪碎至2 mm×2 mm×2 mm的小塊。將組織小塊以5 mm左右間距放入裝有少量DMEM培養液的培養瓶內，置入37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內，4 h后再緩慢加入DMEM培養液覆蓋組織小塊。培養3 d后更換培養液，除去未貼壁的組織塊，加入新鮮培養液。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，待細胞鋪滿90%培養瓶底面，用牛胰蛋白酶消化細胞并調整細胞濃度為1×105 個 / mL，按每孔2 mL加入6孔板，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。培養1 d后收集OA滑膜細胞上清液，- 80℃保存待測。
1.3.2 免疫熒光染色及免疫組織化學染色觀察
取OA及正常膝關節滑膜細胞，調整細胞濃度至1×104 個/mL，滴入放有蓋玻片的6孔培養板內，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，爬片良好后，移除孔內液體。PBS液沖洗3次，37℃4%多聚甲醛固定30 min，滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫20 min，移除多余液體。滴加兔抗人HMGB 1多克隆抗體（1∶200），37℃ 孵育2 h，PBS洗3次。滴加熒光二抗FITC，室溫避光反應1 h。PBS沖洗玻片3 次，緩沖甘油封片。熒光顯微鏡下于490 nm波長觀察，細胞呈綠色熒光為陽性。
取細胞爬片按照免疫組織化學染色試劑盒說明操作，干燥后水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察棕色顆粒的位置和強弱。
1.3.3 Western
blot檢測取OA及正常膝關節滑膜細胞，加入RIPA裂解緩沖液在冰上裂解60 min，超聲勻漿，4℃以離心半徑16 cm，12 000 r/min離心3～5 min。取上清，經15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后，兔抗人HMGB1多克隆抗體4℃孵育過夜；TBS洗膜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育60 min；TBS洗膜，ECL增強發光，壓片顯影。以β-actin為對照。掃描后應用軟件Image Quant TL進行灰度分析，測定條帶吸光度（A）值，以OA或正常膝關節滑膜細胞A值與對照A值的比值作為HMGB1蛋白表達水平。
1.4 siRNA表達載體的構建、酶切鑒定及轉染
將人HMGB1的DNA序列提交siRNA設計網站（www.qiagen.com）選擇最佳干擾的DNA位點，本研究選取4個靶位點構建siRNA表達質粒，通過轉染后Western blot篩選出最有效的質粒，篩選的靶序列為3'非編碼區的5'-AGACCTGAGAATGTATCCCCAAA-3'，針對靶位點設計2條互補的寡核苷酸序列5'-GATCCAGACCTGAGAATGTATCCCCAAATTCAAGACGTTTGGGGATACATTCTCAGGTCTTTTTTTGTCGACA-3'和5'-AGCTTGTCGACAAAAAAAGACCTGAGAATGTATCCCCAAACGTCTTGAATTTGGGGATACAT-TCTCAGGTCTG-3'，構建的siRNA表達載體片段里含有SalⅠ的酶切位點，用BamHⅠ和SalⅠ進行酶切鑒定，將鑒定正確的陽性克隆命名為Pgenesil-1/HMGB1 siRNA。在脂質體Lipofectamine2000的介導下，分別將Pgenesil-1/HMGB1 siRNA與Pgenesil-1質粒轉染至OA滑膜細胞中，作為siRNA轉染組和空載體轉染組。轉染48 h后，更換培養液繼續培養24 h，更換濃度為1 000 μg/mL 的G418培養液篩選細胞。12 h后熒光顯微鏡下觀察siRNA轉染組細胞中綠色熒光蛋白的表達，觀察轉染效率（熒光陽性細胞數/同一視野內光鏡下總細胞數×100%）。挑取陽性克隆繼續在濃度為500 μg/mL的G418培養液中擴大培養6 d后進行觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 Western
blot檢測取siRNA轉染組、空載體轉染組滑膜細胞以及未轉染的OA滑膜細胞（未轉染組），同1.3.3方法行Western blot檢測HMGB1蛋白表達。
1.5.2 ELISA法檢測
取siRNA轉染組及空載體轉染組滑膜細胞，采用胰蛋白酶消化并調整細胞濃度為1×105個/mL，以每孔2 mL加入6孔板內，培養1 d后收集上清液，-80℃保存。將保存的siRNA轉染組、空載體轉染組上清液及1.3.1中收集的OA滑膜細胞上清液（未轉染組），置于冰盒完全解凍，每組取細胞培養上清液100 μL，采用ELISA試劑盒方法檢測IL-1β和TNF-α含量。
1.6 統計學方法
采用SPSS12.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞培養觀察
2.1.1 細胞形態觀察
組織塊原代培養5 d后可見大量滑膜細胞從滑膜組織塊邊緣爬出，呈長梭狀極向排列，大部分為成纖維細胞樣細胞，也有部分樹突樣細胞和巨噬細胞樣細胞，7～10 d形成密集的單層細胞鋪滿90%瓶壁，部分區域呈漩渦狀生長。原代OA及正常膝關節滑膜細胞形態無明顯差異，但正常膝關節滑膜細胞更易貼壁生長。見圖 1。
圖1
滑膜細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×200） ? OA滑膜細胞培養3 d ? 正常膝關節滑膜細胞培養3 d ? ?2.1.2 免疫熒光染色及免疫組織化學染色觀察
OA滑膜細胞HMGB1標記顯示細胞質呈棕色陽性反應，而細胞核多為陰性反應或淺黃色弱陽性反應；免疫熒光染色示HMGB1以細胞質分布為主，細胞核中較少。正常膝關節滑膜細胞HMGB1標記顯示細胞核呈深棕色強陽性反應，而細胞質多為陰性反應或淺黃色弱陽性反應；免疫熒光染色示HMGB1以細胞核分布為主，細胞質中較少。見圖 2、3。
2.1.3 Western
blot檢測 OA滑膜細胞中HMGB1高表達，表達量為0.687±0.025，顯著高于正常膝關節滑膜細胞的0.172±0.030，比較差異有統計學意義（t=32.159，P=0.000）。見圖 4。
2.2 細胞轉染觀測
2.2.1 Pgenesil-1/HMGB1
siRNA真核表達載體的酶切鑒定及轉染效率 Pgenesil-1/HMGB1 siRNA載體目的基因片段里含SalⅠ的酶切位點，用BamHⅠ 和SalⅠ酶切后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，顯示1條約400 bp的條帶，表明Pgenesil-1/HMGB1 siRNA真核表達載體構建成功（圖 5）。Pgenesil-1/HMGB1 siRNA轉染OA滑膜細胞后，熒光顯微鏡下觀察見綠色熒光，轉染率達 89%。見圖 6。
2.2.2 Western
blot檢測 siRNA轉染組HMGB1蛋白表達為0.134±0.048，顯著低于空載體轉染組的0.581±0.032及未轉染組的0.514±0.069，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；空載體轉染組與未轉染組HMGB1蛋白表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 7。
2.2.3 ELISA法檢測
siRNA轉染組、空載體轉染組及未轉染組IL-1β含量分別為（27.165±0.953）、（65.433±1.453）、（67.510±1.236）pg/mL，TNF-α含量為（253.462±13.435）、（635.470±17.380）、（571.743± 16.848）pg/mL。siRNA轉染組IL-1β及TNF-α含量均顯著低于空載體轉染組及未轉染組，差異有統計學意義（P＜0.05）；空載體轉染組與未轉染組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
OA的發生過程是一種生物力學改建過程，是機械性損傷因素和生物因素相互作用引起的軟骨細胞、細胞外基質、軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯失衡的結果[3-4]。在OA的發展病程中，各種致病因素刺激關節滑膜引起滑膜炎癥，釋放多種趨化因子[5]和炎性介質，進一步介導關節軟骨和滑膜中各種蛋白酶產生，引起關節軟骨降解，并形成惡性循環。有學者認為滑膜炎癥的存在是導致OA關節軟骨退變的重要原因[6-7]，因此探討滑膜細胞的炎性因子釋放機制成為OA研究重點。
HMGB1是與染色體結合的非組蛋白成分之一，是一種特殊的炎性因子，具有分泌晚、持續時間長的特點，因而被界定為晚期炎性介質，與炎癥性疾病的發生密切相關[8]。有研究證實HMGB1通過與配體結合，激活包括NF-κB在內的細胞內信號轉導途徑，啟動多種炎性因子（包括TNF-α、IL-1、IL-6、黏附分子等）轉錄介導炎性反應[9]，針對多種組織發揮作用[10-12]。近年來發現它在多種骨關節炎性疾病中高表達[8, 13]，研究發現OA患者關節軟骨及滑膜組織中的HMGB1上調，同時關節液及血清中也存在較高濃度[4, 13]，提示關節組織細胞中的HMGB1在OA發生，發展過程中起重要作用。本研究結果也提示OA滑膜細胞中HMGB1表達上調，以細胞質分布為主；而正常膝關節滑膜細胞HMGB1以細胞核分布為主。因此細胞核外的HMGB1可能是OA炎癥過程中的重要影響因素[14]，但其從細胞核內移出的具體機制及與OA發生、發展的關系目前還不清楚，進一步研究其功能具有十分重要的意義。
為進一步研究HMGB1的功能，本研究利用siRNA技術構建了HMGB1基因siRNA表達載體Pgenesil-1/HMGB1 siRNA并轉染OA滑膜細胞，發現轉染后OA滑膜細胞HMGB1下調，同時分泌IL-1β和TNF-α能力明顯下降。提示其可能的機制是Pgenesil-1/HMGB1 siRNA真核表達載體抑制了HMGB1基因的表達，進而影響其下游的信號傳導通路，抑制炎性因子IL-1β和TNF-α轉錄和釋放。IL-lβ和TNF-α是關節組織損傷發生的主要啟動因子，二者可增加骨吸收，激活基質金屬蛋白酶，降解軟骨膠原及蛋白多糖，增加一氧化氮生成，加快軟骨細胞凋亡，導致滑膜炎癥和軟骨退變[15-17]。本研究結果提示OA滑膜細胞中的HMGB1上調對OA的發生發揮著重要作用，抑制關節滑膜細胞中的HMGB1基因，可減少IL-1β和TNF-α的產生，減緩OA炎性反應進程。目前對于HMGB1參與OA的研究尚處于起步階段，其中許多問題，如HMGB1從細胞核轉移至細胞質的具體時期、其釋放的調節機制等需進行深入研究和闡明。隨著這一系列問題的逐步解決，有望為OA治療提供一種新的思路。
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是目前最常見的一種關節病變，我國流行病學研究顯示，OA患者主要集中在老年人群，65歲以上人群發病率＞50%，75歲以上則達到80%以上[1]。在OA不同階段，多種細胞因子在關節組織損傷中發揮了重要作用[2]。高遷移率族蛋白1（high mobility group box chromosomal protein 1，HMGB1）是一個與慢性關節炎有關的重要炎性介質，可激活細胞內信號轉導途徑，啟動多種炎性因子介導關節組織的炎性損傷。本研究從人膝關節組織中分離滑膜細胞，建立OA和正常膝關節滑膜細胞株，觀察HMGB1的分布，利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）基因沉默技術抑制OA滑膜細胞株的HMGB1基因，通過與干擾前OA滑膜細胞株比較，研究HMGB1基因表達下調對OA滑膜細胞分泌IL-1β和TNF-α的影響，為進一步闡明OA發生的分子機制提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM培養液、FBS（GIBCO公司，美國）；牛胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；兔抗人HMGB1多克隆抗體、熒光二抗FITC（深圳晶美生物工程有限公司）；IL-1β及TNF-α ELISA試劑盒（Biosource公司，美國）；Pgenesil-1質粒和大腸桿菌DH5α由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院骨科實驗室保存；限制性內切酶HindⅢ、BamHⅠ以及T4 DNA Ligase、SalⅠ（NEB）、G418（華美生物工程有限公司）；脂質體Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美國）；SP免疫組織化學試劑盒、DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）；引物由上海Sangon公司合成。倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image Quant TL軟件（華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院實驗中心）。
1.2 實驗標本
收集2013年1月－2015年1月于上海市第一人民醫院寶山醫院骨科34例行關節手術患者的關節滑膜組織。其中，OA患者23例，男8例，女15例；年齡49～70歲，平均59.6歲；患者均根據中華醫學會風濕病學分會2010年版指南標準確診為OA，接受人工膝關節表面置換。正常膝關節11例，男7例，女4例；年齡47～73歲，平均51.9歲；均為膝關節半月板損傷，行關節鏡下手術；經關節鏡診斷未達OA診斷標準且無其他關節病變，取鏡下觀察正常滑膜組織。膝關節滑膜標本取材均經患者知情同意，由上海市第一人民醫院寶山分院倫理委員會批準。
1.3 滑膜細胞體外培養及觀測
1.3.1 細胞培養及形態學觀察
取OA及正常膝關節滑膜組織，采用組織塊培養法，在超凈工作臺內用D-Hank液漂洗3次，剪碎至2 mm×2 mm×2 mm的小塊。將組織小塊以5 mm左右間距放入裝有少量DMEM培養液的培養瓶內，置入37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內，4 h后再緩慢加入DMEM培養液覆蓋組織小塊。培養3 d后更換培養液，除去未貼壁的組織塊，加入新鮮培養液。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，待細胞鋪滿90%培養瓶底面，用牛胰蛋白酶消化細胞并調整細胞濃度為1×105 個 / mL，按每孔2 mL加入6孔板，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。培養1 d后收集OA滑膜細胞上清液，- 80℃保存待測。
1.3.2 免疫熒光染色及免疫組織化學染色觀察
取OA及正常膝關節滑膜細胞，調整細胞濃度至1×104 個/mL，滴入放有蓋玻片的6孔培養板內，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，爬片良好后，移除孔內液體。PBS液沖洗3次，37℃4%多聚甲醛固定30 min，滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫20 min，移除多余液體。滴加兔抗人HMGB 1多克隆抗體（1∶200），37℃ 孵育2 h，PBS洗3次。滴加熒光二抗FITC，室溫避光反應1 h。PBS沖洗玻片3 次，緩沖甘油封片。熒光顯微鏡下于490 nm波長觀察，細胞呈綠色熒光為陽性。
取細胞爬片按照免疫組織化學染色試劑盒說明操作，干燥后水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察棕色顆粒的位置和強弱。
1.3.3 Western
blot檢測取OA及正常膝關節滑膜細胞，加入RIPA裂解緩沖液在冰上裂解60 min，超聲勻漿，4℃以離心半徑16 cm，12 000 r/min離心3～5 min。取上清，經15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后，兔抗人HMGB1多克隆抗體4℃孵育過夜；TBS洗膜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育60 min；TBS洗膜，ECL增強發光，壓片顯影。以β-actin為對照。掃描后應用軟件Image Quant TL進行灰度分析，測定條帶吸光度（A）值，以OA或正常膝關節滑膜細胞A值與對照A值的比值作為HMGB1蛋白表達水平。
1.4 siRNA表達載體的構建、酶切鑒定及轉染
將人HMGB1的DNA序列提交siRNA設計網站（www.qiagen.com）選擇最佳干擾的DNA位點，本研究選取4個靶位點構建siRNA表達質粒，通過轉染后Western blot篩選出最有效的質粒，篩選的靶序列為3'非編碼區的5'-AGACCTGAGAATGTATCCCCAAA-3'，針對靶位點設計2條互補的寡核苷酸序列5'-GATCCAGACCTGAGAATGTATCCCCAAATTCAAGACGTTTGGGGATACATTCTCAGGTCTTTTTTTGTCGACA-3'和5'-AGCTTGTCGACAAAAAAAGACCTGAGAATGTATCCCCAAACGTCTTGAATTTGGGGATACAT-TCTCAGGTCTG-3'，構建的siRNA表達載體片段里含有SalⅠ的酶切位點，用BamHⅠ和SalⅠ進行酶切鑒定，將鑒定正確的陽性克隆命名為Pgenesil-1/HMGB1 siRNA。在脂質體Lipofectamine2000的介導下，分別將Pgenesil-1/HMGB1 siRNA與Pgenesil-1質粒轉染至OA滑膜細胞中，作為siRNA轉染組和空載體轉染組。轉染48 h后，更換培養液繼續培養24 h，更換濃度為1 000 μg/mL 的G418培養液篩選細胞。12 h后熒光顯微鏡下觀察siRNA轉染組細胞中綠色熒光蛋白的表達，觀察轉染效率（熒光陽性細胞數/同一視野內光鏡下總細胞數×100%）。挑取陽性克隆繼續在濃度為500 μg/mL的G418培養液中擴大培養6 d后進行觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 Western
blot檢測取siRNA轉染組、空載體轉染組滑膜細胞以及未轉染的OA滑膜細胞（未轉染組），同1.3.3方法行Western blot檢測HMGB1蛋白表達。
1.5.2 ELISA法檢測
取siRNA轉染組及空載體轉染組滑膜細胞，采用胰蛋白酶消化并調整細胞濃度為1×105個/mL，以每孔2 mL加入6孔板內，培養1 d后收集上清液，-80℃保存。將保存的siRNA轉染組、空載體轉染組上清液及1.3.1中收集的OA滑膜細胞上清液（未轉染組），置于冰盒完全解凍，每組取細胞培養上清液100 μL，采用ELISA試劑盒方法檢測IL-1β和TNF-α含量。
1.6 統計學方法
采用SPSS12.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞培養觀察
2.1.1 細胞形態觀察
組織塊原代培養5 d后可見大量滑膜細胞從滑膜組織塊邊緣爬出，呈長梭狀極向排列，大部分為成纖維細胞樣細胞，也有部分樹突樣細胞和巨噬細胞樣細胞，7～10 d形成密集的單層細胞鋪滿90%瓶壁，部分區域呈漩渦狀生長。原代OA及正常膝關節滑膜細胞形態無明顯差異，但正常膝關節滑膜細胞更易貼壁生長。見圖 1。
圖1
滑膜細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×200） ? OA滑膜細胞培養3 d ? 正常膝關節滑膜細胞培養3 d ? ?2.1.2 免疫熒光染色及免疫組織化學染色觀察
OA滑膜細胞HMGB1標記顯示細胞質呈棕色陽性反應，而細胞核多為陰性反應或淺黃色弱陽性反應；免疫熒光染色示HMGB1以細胞質分布為主，細胞核中較少。正常膝關節滑膜細胞HMGB1標記顯示細胞核呈深棕色強陽性反應，而細胞質多為陰性反應或淺黃色弱陽性反應；免疫熒光染色示HMGB1以細胞核分布為主，細胞質中較少。見圖 2、3。
2.1.3 Western
blot檢測 OA滑膜細胞中HMGB1高表達，表達量為0.687±0.025，顯著高于正常膝關節滑膜細胞的0.172±0.030，比較差異有統計學意義（t=32.159，P=0.000）。見圖 4。
2.2 細胞轉染觀測
2.2.1 Pgenesil-1/HMGB1
siRNA真核表達載體的酶切鑒定及轉染效率 Pgenesil-1/HMGB1 siRNA載體目的基因片段里含SalⅠ的酶切位點，用BamHⅠ 和SalⅠ酶切后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，顯示1條約400 bp的條帶，表明Pgenesil-1/HMGB1 siRNA真核表達載體構建成功（圖 5）。Pgenesil-1/HMGB1 siRNA轉染OA滑膜細胞后，熒光顯微鏡下觀察見綠色熒光，轉染率達 89%。見圖 6。
2.2.2 Western
blot檢測 siRNA轉染組HMGB1蛋白表達為0.134±0.048，顯著低于空載體轉染組的0.581±0.032及未轉染組的0.514±0.069，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；空載體轉染組與未轉染組HMGB1蛋白表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 7。
2.2.3 ELISA法檢測
siRNA轉染組、空載體轉染組及未轉染組IL-1β含量分別為（27.165±0.953）、（65.433±1.453）、（67.510±1.236）pg/mL，TNF-α含量為（253.462±13.435）、（635.470±17.380）、（571.743± 16.848）pg/mL。siRNA轉染組IL-1β及TNF-α含量均顯著低于空載體轉染組及未轉染組，差異有統計學意義（P＜0.05）；空載體轉染組與未轉染組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
OA的發生過程是一種生物力學改建過程，是機械性損傷因素和生物因素相互作用引起的軟骨細胞、細胞外基質、軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯失衡的結果[3-4]。在OA的發展病程中，各種致病因素刺激關節滑膜引起滑膜炎癥，釋放多種趨化因子[5]和炎性介質，進一步介導關節軟骨和滑膜中各種蛋白酶產生，引起關節軟骨降解，并形成惡性循環。有學者認為滑膜炎癥的存在是導致OA關節軟骨退變的重要原因[6-7]，因此探討滑膜細胞的炎性因子釋放機制成為OA研究重點。
HMGB1是與染色體結合的非組蛋白成分之一，是一種特殊的炎性因子，具有分泌晚、持續時間長的特點，因而被界定為晚期炎性介質，與炎癥性疾病的發生密切相關[8]。有研究證實HMGB1通過與配體結合，激活包括NF-κB在內的細胞內信號轉導途徑，啟動多種炎性因子（包括TNF-α、IL-1、IL-6、黏附分子等）轉錄介導炎性反應[9]，針對多種組織發揮作用[10-12]。近年來發現它在多種骨關節炎性疾病中高表達[8, 13]，研究發現OA患者關節軟骨及滑膜組織中的HMGB1上調，同時關節液及血清中也存在較高濃度[4, 13]，提示關節組織細胞中的HMGB1在OA發生，發展過程中起重要作用。本研究結果也提示OA滑膜細胞中HMGB1表達上調，以細胞質分布為主；而正常膝關節滑膜細胞HMGB1以細胞核分布為主。因此細胞核外的HMGB1可能是OA炎癥過程中的重要影響因素[14]，但其從細胞核內移出的具體機制及與OA發生、發展的關系目前還不清楚，進一步研究其功能具有十分重要的意義。
為進一步研究HMGB1的功能，本研究利用siRNA技術構建了HMGB1基因siRNA表達載體Pgenesil-1/HMGB1 siRNA并轉染OA滑膜細胞，發現轉染后OA滑膜細胞HMGB1下調，同時分泌IL-1β和TNF-α能力明顯下降。提示其可能的機制是Pgenesil-1/HMGB1 siRNA真核表達載體抑制了HMGB1基因的表達，進而影響其下游的信號傳導通路，抑制炎性因子IL-1β和TNF-α轉錄和釋放。IL-lβ和TNF-α是關節組織損傷發生的主要啟動因子，二者可增加骨吸收，激活基質金屬蛋白酶，降解軟骨膠原及蛋白多糖，增加一氧化氮生成，加快軟骨細胞凋亡，導致滑膜炎癥和軟骨退變[15-17]。本研究結果提示OA滑膜細胞中的HMGB1上調對OA的發生發揮著重要作用，抑制關節滑膜細胞中的HMGB1基因，可減少IL-1β和TNF-α的產生，減緩OA炎性反應進程。目前對于HMGB1參與OA的研究尚處于起步階段，其中許多問題，如HMGB1從細胞核轉移至細胞質的具體時期、其釋放的調節機制等需進行深入研究和闡明。隨著這一系列問題的逐步解決，有望為OA治療提供一種新的思路。
