引用本文： 魏冰, 鄒國耀, 宋恩鴻, 管林聰. 不同濃度比例骨保護素與脫蛋白骨凝膠復合物對前交叉韌帶重建術后骨隧道影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(11): 1369-1375. doi: 10.7507/1002-1892.20150295 復制
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）重建術后骨隧道擴大會影響腱-骨愈合過程，從而影響療效。如何加速腱-骨愈合、預防骨隧道擴大是研究熱點。近年來研究發現生長因子，如TGF-β、BMP等，可預防ACL重建術后骨隧道擴大的發生[1-2]。骨保護素（osteoprotegerin，OPG）是一種新發現的生長因子，作為TNF受體超家族的新成員，其具有抑制破骨細胞分化作用，從而增加骨密度[3-4]。單純利用生長因子容易隨關節滑液滲入后流失或失活[5]。脫蛋白骨（deproteinized bone，DPB）是臨床廣泛應用的一種骨替代材料，具有傳導性、誘導性和低免疫原性等特點[6]，其特殊的三維多孔結構能為OPG提供一個緩釋空間。本實驗通過建立兔膝ACL重建模型，分析比較不同濃度比例的OPG與DPB凝膠復合物對ACL重建術后骨隧道的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
5～6月齡健康新西蘭大白兔60只，雌雄不限，體質量（2.7±0.4）kg，由桂林醫學院動物實驗中心提供。實驗動物均適應性飼養1周，觀察雙膝關節活動正常。粉末狀OPG（北京博奧森生物技術有限公司）；牛凝血酶（Sigma公司，美國）。CMT4104微機控制電子萬能試驗機（深圳新三思材料有限公司）；游標卡尺（北京恒奧德儀器儀表有限公司）。
1.2 異種DPB的制備
參照文獻[7]方法制備DPB。取市售新鮮新生小牛股骨骺端，剔除骨皮質，剪成大小約3 mm× 3 mm×3 mm的骨粒，溫水反復沖洗，去除血漬和油脂。將骨粒放入30%H2O2浸泡72 h，再放入體積比為1∶1的甲醇/氯仿溶液中脫脂4 h。洗凈、烘干、環氧乙烷消毒，分裝備用。
1.3 不同濃度比例的OPG/DPB凝膠復合物制備
參照Dynybil等[8]研究中 OPG濃度和趙耀等[9]研究中復合物成分比例選擇以及制備方法，將粉末狀OPG溶于滅菌蒸餾水中，稀釋成3種濃度，分別為30、60、100 μg/mL 。按照2塊DPB浸泡于2 mL OPG溶液的比例，將DPB分別浸泡于3種濃度的OPG溶液中，4℃條件下保存6 h。取OPG/DPB復合物與激活劑（含200 U牛凝血酶、0.1 g/mL氯化鈣溶液）按體積比1∶1混合，37℃水浴反應，直至骨表面析出凝膠，制備30%、60%、100%OPG/DPB凝膠復合物。于- 20℃條件下采用EP管分裝保存備用。
1.4 實驗分組及方法
將60只大白兔隨機分為4組（n=15）：空白對照組（A組）、30%OPG/DPB凝膠復合物組（B組）、60%OPG/DPB凝膠復合物組（C組）、100%OPG/DPB凝膠復合物組（D組）。4組動物術前禁食、水6 h，左膝關節及左側跟腱部位備皮，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉，左膝關節以2%利多卡因局部浸潤輔助麻醉。
手術操作參照鄒國耀等[10]的研究。首先，于左小腿下段后方正中偏內3 mm處作長2～3 cm切口，分離并最大限度切取跟腱，去除殘留肌肉等軟組織，兩端采用4-0真絲編織線縫合后，置于生理鹽水備用。沿左膝髕腱內側緣處作長4～5 cm縱切口，切開關節囊并暴露關節腔，尖刀離斷ACL上、下止點處，以正常起、止點定位股骨、脛骨隧道內口；屈膝位，用2.0 mm克氏針分別鉆取股骨和脛骨隧道，然后分別在股骨隧道外口上方和脛骨隧道外口下方1 cm處鉆取骨橋以固定韌帶。根據分組，取不同濃度比例OPG/DPB凝膠復合物各2塊，無菌條件下搗碎后分別植入B、C、D組股骨及脛骨骨隧道內，然后用1.0 mm克氏針分別經股骨及脛骨隧道將凝膠復合物涂于骨隧道壁上，并將EP管內殘留凝膠復合物涂于移植跟腱表面；A組僅單純行ACL重建，不作其他處理。將移植跟腱自內側副韌帶的淺層經脛骨和股骨隧道穿出，調整位置，于屈膝位拉緊，將兩端打結固定于骨橋，逐層關閉切口。
術后允許動物自由活動，3 d內常規肌肉注射青霉素40萬U/d，定期換藥，預防感染。于術后4、8、12周各組分別取5只動物，過量麻醉處死后于原切口入路取標本進行以下觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 一般情況
術后觀察各組動物存活、飲食及切口愈合、關節活動情況，局部有無化膿性感染等。
1.5.2 大體觀察
各時間點觀察股骨及脛骨隧道內口周圍組織情況。取股骨端標本后，游標卡尺測量股骨隧道內口直徑。按照Webster等[11]的方法計算股骨隧道擴大率，公式為：[術后骨隧道內口直徑-術前骨隧道內口直徑（即克氏針直徑2.0 mm）]/術前骨隧道內口直徑×100%。
1.5.3 組織學觀察
剔除股骨及脛骨隧道內、外口周圍多余組織和縫線。將標本置于10%甲醛溶液固定48 h，20%甲酸脫鈣液浸泡1周后，沿股骨及脛骨骨隧道縱向剖開并修整，制成大小為0.7 cm×0.4 cm×0.3 cm的組織塊，經脫水、固定、石蠟包埋，沿縱軸面切片，片厚5 μm，HE染色，光鏡下觀察標本腱-骨界面組成成分。
1.5.4 生物力學測試
距左膝關節股骨面上方及脛骨平臺面下方約4 cm處截骨，保留重建ACL，離截骨面兩端約1 cm處分別鉆孔并固定無彈性繩，制成股骨-移植肌腱-脛骨標本。于22℃室溫下，將標本兩端無彈性繩分別置于CMT4104微機控制電子萬能試驗機試驗夾具兩端，進行單軸拉伸試驗。加載速度為25 mm/min，記錄移植肌腱斷裂部位、完全斷裂或脫出時的最大抗拉負荷。
1.6 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后A、D組各1只，B、C組各2只動物因切口化膿性感染死亡，均予以補充。術后各組動物左膝關節均出現不同程度腫脹，5～7 d后消失。術后2 周切口均順利愈合，左膝關節活動及飲食恢復正常。
2.2 大體觀察
術后4周，各組股骨及脛骨隧道內口均有少量瘢痕組織覆蓋，重建韌帶呈柱狀。8周，各組股骨及脛骨隧道內口周圍組織呈白色軟骨樣變，其中C、D組較A、B組明顯。12周，A組各標本均有不同程度股骨及脛骨隧道內口擴大，隧道內口形似漏斗狀；B、C組各1例可見股骨骨隧道內口擴大現象；D組股骨及脛骨隧道內口完全封閉。見圖 1～3。
圖1
術后4周各組股骨隧道內口大體觀察 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?各時間點B、C、D組股骨隧道擴大率均顯著低于A組，D組低于B、C組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。除8周時C組股骨隧道擴大率顯著低于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）外，4、12周兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各時間點各組股骨骨隧道擴大率比較（n=5，%，2.3 組織學觀察
術后4周：A組部分肌腱發生壞死，腱-骨界面有少量含血管的纖維結締組織，局部可見少量疏松的纖維結締組織形成，肌腱與隧道壁結合不緊密。B組腱-骨界面見少量含血管的纖維結締組織，肌腱與隧道壁結合不緊密。C組腱-骨界面有雜亂排列的纖維結締組織，部分腱-骨連續性存在。D組腱-骨界面較多含血管的纖維結締組織，偶見長入肌腱的新生骨組織，與其他組相比肌腱與隧道壁結合較緊密。見圖 4。
圖4
術后4周各組組織學觀察（HE×100） F：重建后的ACL B：骨 IF：腱-骨界面 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?術后8周：A組腱-骨界面組織內的血管含量減少，腱性組織和骨連接較4周時緊密，偶見Sharpey纖維連接，走行不規則。B組腱-骨界面有少量Sharpey纖維形成，排列無序，結合疏松，少許新生骨組織向肌腱內長入。C組較多Sharpey纖維形成，走行不規則，較A組結合稍緊密，肌腱內有少量骨組織。D組腱-骨界面可見纖維軟骨連接，少量鈣化軟骨和骨組織，纖維排列較其他組有序，新生骨組織長入肌腱較多。見圖 5。
術后12周：A組較多Sharpey纖維連接并相對排列有序，腱-骨界面可見少量新骨生成，部分肌腱與骨組織呈纖維軟骨連接。B組腱-骨界面有較多骨性組織長入，大量Sharpey纖維形成，排列有序，形成間接止點的結構；局部可見鈣化的纖維軟骨。C組腱-骨界面有鈣化纖維垂直排列，部分可見類似正常止點的4層結構及潮線。D組腱-骨界面有密集排列有序的鈣化軟骨、纖維軟骨，可見典型的4層結構及潮線，與正常ACL止點相似，新生骨組織部分未完全成熟。見圖 6。
2.4 生物力學檢測
除C組12周和D組8、12周時均為韌帶實質斷裂外，其余各時間點主要是從骨隧道拔出，其中以從股骨隧道拔出多見；見表 2。術后4周，D組最大抗拉力負荷顯著大于A、B組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；A、B、C組間比較以及C、D組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。8周，C、D組間最大抗拉力負荷均大于A組，D組大于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其余組間A、C組與B組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。12周，C、D組最大抗拉力負荷均大于A、B組，D組大于C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 3。
表2
各時間點各組重建ACL拔出或斷裂部位
Table2.
The site of ligament pulled-out or ruptured in each group at different time points
表3
各時間點各組最大抗拉力負荷比較（n=5，N，3 討論
移植物重建ACL的關鍵之一是能否在骨隧道中形成正常止點，只有形成正常止點，重建后的ACL才能真正發揮其功能。但移植肌腱與骨隧道壁之間的愈合過程目前尚未完全清楚，且影響因素眾多。研究認為，腱-骨界面以止點的形式發生、發展主要有兩類：直接止點（正常止點）和間接止點（纖維止點）[12-13]。直接止點是由腱性組織、纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨和骨組織組成的典型4層結構，并且在纖維軟骨和鈣化軟骨之間有嗜堿性潮線。間接止點是由腱性組織以一定角度與骨連接，其特點是Sharpey纖維的存在。愈合早期，腱-骨界面主要填充肉芽組織，逐漸演化為膠原纖維，進而出現纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨，最終出現直接止點的4層結構。然而腱-骨界面必然要承擔這些結構變化帶來的應力集中，Oka等[14]研究證實腱-骨愈合過程中最薄弱環節是欠成熟的腱-骨界面。本研究組織學結果提示，術后4周各組均可見走行不規則、排列不一的Sharpey纖維，之后排列逐漸規則，至12周時各復合物組均可見典型的4層結構，其中以D組最顯著，新生骨組織生長明顯，與肌腱結合緊密，然而A組未見明顯的典型4層結構，表明OPG/DPB凝膠復合物對形成直接止點有促進作用。
根據拉脫試驗，生物力學變化可直接反映腱-骨愈合程度[15]。李寧等[16]研究制備兔雙膝ACL重建模型，先將脛骨側骨隧道內口涂薄層耳腦膠封閉內口，并于骨隧道內植入骨髓單個核細胞，然后耳腦膠封閉外口，結果發現實驗組腱-骨界面抗拉伸強度明顯高于對照組（僅在脛骨骨隧道內外口封閉薄層耳腦膠，不植入骨髓單個核細胞），并且隨著時間延長抗拉伸強度增加。本研究結果發現移植肌腱在4周時多從骨隧道中拔出，而12周時多是韌帶實質斷裂，提示早期腱-骨界面未達到成熟愈合。本研究發現C、D組最大抗拉力負荷均高于A組，且12周時D組最大抗拉力負荷與其余3組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）；提示OPG/DPB凝膠復合物能有效增加腱-骨愈合能力，并且在3種濃度中，以100%濃度效果顯著。
另外，Weiler等[17]研究表明，圓形的隧道與扁平的移植物之間形成的憩室易導致關節滑液滲入，重建后移植肌腱暴露于滑液中，繼而導致細胞因子流失，影響腱-骨愈合，即“滑液灌注效應”。這會影響腱-骨愈合早期肌腱和骨道壁之間纖維結締組織的形成，從而延遲止點的形成，甚至造成骨隧道擴大[18]。因此，通過縮小憩室空間來減少關節滑液的滲入可促進腱-骨愈合。翟文亮等[19]于兔ACL重建模型的骨隧道內植入富血小板血漿與脫蛋白骨凝膠復合物，組織學、影像學觀察結果顯示，該復合物能增強早期腱-骨界面的愈合能力，預防骨隧道的擴大。Weimin等[20]將可注射型磷酸鈣水泥復合異種骨粒與BMP復合物填充在移植肌腱與隧道壁之間，以期減少“滑液灌注效應”的影響，結果表明該復合物明顯促進腱-骨愈合過程。本研究將OPG與DPB制備成凝膠復合物，填充在骨隧道中，骨隧道擴大率檢測發現，各復合物組均顯著低于A組，尤以D組明顯，提示通過縮小憩室空間來減少關節滑液的滲入可促進腱-骨愈合，降低骨隧道擴大影響。
綜上述，本研究以DPB為載體，充分利用OPG的成骨能力和DPB的緩釋特性，減少OPG植入骨隧道后的流失，保證其有效濃度，使移植肌腱與骨隧道接觸充分且持久，從而減少“滑液灌注效應”的產生，進一步促進腱-骨界面直接止點的形成，有效預防骨隧道擴大。其中100%OPG/DPB凝膠復合物對腱-骨愈合、預防骨隧道擴大效果最顯著。但本研究僅為動物實驗，該復合物能否用于臨床ACL重建有待進一步研究論證。
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）重建術后骨隧道擴大會影響腱-骨愈合過程，從而影響療效。如何加速腱-骨愈合、預防骨隧道擴大是研究熱點。近年來研究發現生長因子，如TGF-β、BMP等，可預防ACL重建術后骨隧道擴大的發生[1-2]。骨保護素（osteoprotegerin，OPG）是一種新發現的生長因子，作為TNF受體超家族的新成員，其具有抑制破骨細胞分化作用，從而增加骨密度[3-4]。單純利用生長因子容易隨關節滑液滲入后流失或失活[5]。脫蛋白骨（deproteinized bone，DPB）是臨床廣泛應用的一種骨替代材料，具有傳導性、誘導性和低免疫原性等特點[6]，其特殊的三維多孔結構能為OPG提供一個緩釋空間。本實驗通過建立兔膝ACL重建模型，分析比較不同濃度比例的OPG與DPB凝膠復合物對ACL重建術后骨隧道的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
5～6月齡健康新西蘭大白兔60只，雌雄不限，體質量（2.7±0.4）kg，由桂林醫學院動物實驗中心提供。實驗動物均適應性飼養1周，觀察雙膝關節活動正常。粉末狀OPG（北京博奧森生物技術有限公司）；牛凝血酶（Sigma公司，美國）。CMT4104微機控制電子萬能試驗機（深圳新三思材料有限公司）；游標卡尺（北京恒奧德儀器儀表有限公司）。
1.2 異種DPB的制備
參照文獻[7]方法制備DPB。取市售新鮮新生小牛股骨骺端，剔除骨皮質，剪成大小約3 mm× 3 mm×3 mm的骨粒，溫水反復沖洗，去除血漬和油脂。將骨粒放入30%H2O2浸泡72 h，再放入體積比為1∶1的甲醇/氯仿溶液中脫脂4 h。洗凈、烘干、環氧乙烷消毒，分裝備用。
1.3 不同濃度比例的OPG/DPB凝膠復合物制備
參照Dynybil等[8]研究中 OPG濃度和趙耀等[9]研究中復合物成分比例選擇以及制備方法，將粉末狀OPG溶于滅菌蒸餾水中，稀釋成3種濃度，分別為30、60、100 μg/mL 。按照2塊DPB浸泡于2 mL OPG溶液的比例，將DPB分別浸泡于3種濃度的OPG溶液中，4℃條件下保存6 h。取OPG/DPB復合物與激活劑（含200 U牛凝血酶、0.1 g/mL氯化鈣溶液）按體積比1∶1混合，37℃水浴反應，直至骨表面析出凝膠，制備30%、60%、100%OPG/DPB凝膠復合物。于- 20℃條件下采用EP管分裝保存備用。
1.4 實驗分組及方法
將60只大白兔隨機分為4組（n=15）：空白對照組（A組）、30%OPG/DPB凝膠復合物組（B組）、60%OPG/DPB凝膠復合物組（C組）、100%OPG/DPB凝膠復合物組（D組）。4組動物術前禁食、水6 h，左膝關節及左側跟腱部位備皮，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉，左膝關節以2%利多卡因局部浸潤輔助麻醉。
手術操作參照鄒國耀等[10]的研究。首先，于左小腿下段后方正中偏內3 mm處作長2～3 cm切口，分離并最大限度切取跟腱，去除殘留肌肉等軟組織，兩端采用4-0真絲編織線縫合后，置于生理鹽水備用。沿左膝髕腱內側緣處作長4～5 cm縱切口，切開關節囊并暴露關節腔，尖刀離斷ACL上、下止點處，以正常起、止點定位股骨、脛骨隧道內口；屈膝位，用2.0 mm克氏針分別鉆取股骨和脛骨隧道，然后分別在股骨隧道外口上方和脛骨隧道外口下方1 cm處鉆取骨橋以固定韌帶。根據分組，取不同濃度比例OPG/DPB凝膠復合物各2塊，無菌條件下搗碎后分別植入B、C、D組股骨及脛骨骨隧道內，然后用1.0 mm克氏針分別經股骨及脛骨隧道將凝膠復合物涂于骨隧道壁上，并將EP管內殘留凝膠復合物涂于移植跟腱表面；A組僅單純行ACL重建，不作其他處理。將移植跟腱自內側副韌帶的淺層經脛骨和股骨隧道穿出，調整位置，于屈膝位拉緊，將兩端打結固定于骨橋，逐層關閉切口。
術后允許動物自由活動，3 d內常規肌肉注射青霉素40萬U/d，定期換藥，預防感染。于術后4、8、12周各組分別取5只動物，過量麻醉處死后于原切口入路取標本進行以下觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 一般情況
術后觀察各組動物存活、飲食及切口愈合、關節活動情況，局部有無化膿性感染等。
1.5.2 大體觀察
各時間點觀察股骨及脛骨隧道內口周圍組織情況。取股骨端標本后，游標卡尺測量股骨隧道內口直徑。按照Webster等[11]的方法計算股骨隧道擴大率，公式為：[術后骨隧道內口直徑-術前骨隧道內口直徑（即克氏針直徑2.0 mm）]/術前骨隧道內口直徑×100%。
1.5.3 組織學觀察
剔除股骨及脛骨隧道內、外口周圍多余組織和縫線。將標本置于10%甲醛溶液固定48 h，20%甲酸脫鈣液浸泡1周后，沿股骨及脛骨骨隧道縱向剖開并修整，制成大小為0.7 cm×0.4 cm×0.3 cm的組織塊，經脫水、固定、石蠟包埋，沿縱軸面切片，片厚5 μm，HE染色，光鏡下觀察標本腱-骨界面組成成分。
1.5.4 生物力學測試
距左膝關節股骨面上方及脛骨平臺面下方約4 cm處截骨，保留重建ACL，離截骨面兩端約1 cm處分別鉆孔并固定無彈性繩，制成股骨-移植肌腱-脛骨標本。于22℃室溫下，將標本兩端無彈性繩分別置于CMT4104微機控制電子萬能試驗機試驗夾具兩端，進行單軸拉伸試驗。加載速度為25 mm/min，記錄移植肌腱斷裂部位、完全斷裂或脫出時的最大抗拉負荷。
1.6 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后A、D組各1只，B、C組各2只動物因切口化膿性感染死亡，均予以補充。術后各組動物左膝關節均出現不同程度腫脹，5～7 d后消失。術后2 周切口均順利愈合，左膝關節活動及飲食恢復正常。
2.2 大體觀察
術后4周，各組股骨及脛骨隧道內口均有少量瘢痕組織覆蓋，重建韌帶呈柱狀。8周，各組股骨及脛骨隧道內口周圍組織呈白色軟骨樣變，其中C、D組較A、B組明顯。12周，A組各標本均有不同程度股骨及脛骨隧道內口擴大，隧道內口形似漏斗狀；B、C組各1例可見股骨骨隧道內口擴大現象；D組股骨及脛骨隧道內口完全封閉。見圖 1～3。
圖1
術后4周各組股骨隧道內口大體觀察 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?各時間點B、C、D組股骨隧道擴大率均顯著低于A組，D組低于B、C組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。除8周時C組股骨隧道擴大率顯著低于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）外，4、12周兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各時間點各組股骨骨隧道擴大率比較（n=5，%，2.3 組織學觀察
術后4周：A組部分肌腱發生壞死，腱-骨界面有少量含血管的纖維結締組織，局部可見少量疏松的纖維結締組織形成，肌腱與隧道壁結合不緊密。B組腱-骨界面見少量含血管的纖維結締組織，肌腱與隧道壁結合不緊密。C組腱-骨界面有雜亂排列的纖維結締組織，部分腱-骨連續性存在。D組腱-骨界面較多含血管的纖維結締組織，偶見長入肌腱的新生骨組織，與其他組相比肌腱與隧道壁結合較緊密。見圖 4。
圖4
術后4周各組組織學觀察（HE×100） F：重建后的ACL B：骨 IF：腱-骨界面 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?術后8周：A組腱-骨界面組織內的血管含量減少，腱性組織和骨連接較4周時緊密，偶見Sharpey纖維連接，走行不規則。B組腱-骨界面有少量Sharpey纖維形成，排列無序，結合疏松，少許新生骨組織向肌腱內長入。C組較多Sharpey纖維形成，走行不規則，較A組結合稍緊密，肌腱內有少量骨組織。D組腱-骨界面可見纖維軟骨連接，少量鈣化軟骨和骨組織，纖維排列較其他組有序，新生骨組織長入肌腱較多。見圖 5。
術后12周：A組較多Sharpey纖維連接并相對排列有序，腱-骨界面可見少量新骨生成，部分肌腱與骨組織呈纖維軟骨連接。B組腱-骨界面有較多骨性組織長入，大量Sharpey纖維形成，排列有序，形成間接止點的結構；局部可見鈣化的纖維軟骨。C組腱-骨界面有鈣化纖維垂直排列，部分可見類似正常止點的4層結構及潮線。D組腱-骨界面有密集排列有序的鈣化軟骨、纖維軟骨，可見典型的4層結構及潮線，與正常ACL止點相似，新生骨組織部分未完全成熟。見圖 6。
2.4 生物力學檢測
除C組12周和D組8、12周時均為韌帶實質斷裂外，其余各時間點主要是從骨隧道拔出，其中以從股骨隧道拔出多見；見表 2。術后4周，D組最大抗拉力負荷顯著大于A、B組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；A、B、C組間比較以及C、D組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。8周，C、D組間最大抗拉力負荷均大于A組，D組大于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其余組間A、C組與B組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。12周，C、D組最大抗拉力負荷均大于A、B組，D組大于C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 3。
表2
各時間點各組重建ACL拔出或斷裂部位
Table2.
The site of ligament pulled-out or ruptured in each group at different time points
表3
各時間點各組最大抗拉力負荷比較（n=5，N，3 討論
移植物重建ACL的關鍵之一是能否在骨隧道中形成正常止點，只有形成正常止點，重建后的ACL才能真正發揮其功能。但移植肌腱與骨隧道壁之間的愈合過程目前尚未完全清楚，且影響因素眾多。研究認為，腱-骨界面以止點的形式發生、發展主要有兩類：直接止點（正常止點）和間接止點（纖維止點）[12-13]。直接止點是由腱性組織、纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨和骨組織組成的典型4層結構，并且在纖維軟骨和鈣化軟骨之間有嗜堿性潮線。間接止點是由腱性組織以一定角度與骨連接，其特點是Sharpey纖維的存在。愈合早期，腱-骨界面主要填充肉芽組織，逐漸演化為膠原纖維，進而出現纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨，最終出現直接止點的4層結構。然而腱-骨界面必然要承擔這些結構變化帶來的應力集中，Oka等[14]研究證實腱-骨愈合過程中最薄弱環節是欠成熟的腱-骨界面。本研究組織學結果提示，術后4周各組均可見走行不規則、排列不一的Sharpey纖維，之后排列逐漸規則，至12周時各復合物組均可見典型的4層結構，其中以D組最顯著，新生骨組織生長明顯，與肌腱結合緊密，然而A組未見明顯的典型4層結構，表明OPG/DPB凝膠復合物對形成直接止點有促進作用。
根據拉脫試驗，生物力學變化可直接反映腱-骨愈合程度[15]。李寧等[16]研究制備兔雙膝ACL重建模型，先將脛骨側骨隧道內口涂薄層耳腦膠封閉內口，并于骨隧道內植入骨髓單個核細胞，然后耳腦膠封閉外口，結果發現實驗組腱-骨界面抗拉伸強度明顯高于對照組（僅在脛骨骨隧道內外口封閉薄層耳腦膠，不植入骨髓單個核細胞），并且隨著時間延長抗拉伸強度增加。本研究結果發現移植肌腱在4周時多從骨隧道中拔出，而12周時多是韌帶實質斷裂，提示早期腱-骨界面未達到成熟愈合。本研究發現C、D組最大抗拉力負荷均高于A組，且12周時D組最大抗拉力負荷與其余3組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）；提示OPG/DPB凝膠復合物能有效增加腱-骨愈合能力，并且在3種濃度中，以100%濃度效果顯著。
另外，Weiler等[17]研究表明，圓形的隧道與扁平的移植物之間形成的憩室易導致關節滑液滲入，重建后移植肌腱暴露于滑液中，繼而導致細胞因子流失，影響腱-骨愈合，即“滑液灌注效應”。這會影響腱-骨愈合早期肌腱和骨道壁之間纖維結締組織的形成，從而延遲止點的形成，甚至造成骨隧道擴大[18]。因此，通過縮小憩室空間來減少關節滑液的滲入可促進腱-骨愈合。翟文亮等[19]于兔ACL重建模型的骨隧道內植入富血小板血漿與脫蛋白骨凝膠復合物，組織學、影像學觀察結果顯示，該復合物能增強早期腱-骨界面的愈合能力，預防骨隧道的擴大。Weimin等[20]將可注射型磷酸鈣水泥復合異種骨粒與BMP復合物填充在移植肌腱與隧道壁之間，以期減少“滑液灌注效應”的影響，結果表明該復合物明顯促進腱-骨愈合過程。本研究將OPG與DPB制備成凝膠復合物，填充在骨隧道中，骨隧道擴大率檢測發現，各復合物組均顯著低于A組，尤以D組明顯，提示通過縮小憩室空間來減少關節滑液的滲入可促進腱-骨愈合，降低骨隧道擴大影響。
綜上述，本研究以DPB為載體，充分利用OPG的成骨能力和DPB的緩釋特性，減少OPG植入骨隧道后的流失，保證其有效濃度，使移植肌腱與骨隧道接觸充分且持久，從而減少“滑液灌注效應”的產生，進一步促進腱-骨界面直接止點的形成，有效預防骨隧道擴大。其中100%OPG/DPB凝膠復合物對腱-骨愈合、預防骨隧道擴大效果最顯著。但本研究僅為動物實驗，該復合物能否用于臨床ACL重建有待進一步研究論證。
