引用本文： 張濤, 李文杰, 王峰, 張宇, 徐艾強, 沈憶新. 小鼠室管膜下區神經干細胞增殖及分化研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(6): 766-771. doi: 10.7507/1002-1892.20150164 復制
神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是一類起源于神經外胚層，能不斷自我更新，并在一定條件下分化為神經元和膠質細胞的多潛能干細胞。NSCs主要存在于哺乳動物腦部兩個區域：側腦室的室管膜下區（subventricular zone，SVZ）和海馬的齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）。目前體外NSCs分離培養的研究主要集中于來源SGZ的NSCs，對來源SVZ的NSCs研究相對較少。研究發現，來源于SVZ的NSCs不但具有自我更新和多向分化潛能，還可以沿嘴側遷移流通路長距離遷移至嗅球，并且在嗅球可以分化為多巴胺能神經元[1-5]。以往對來源SGZ的NSCs研究，主要選取鼠海馬組織或整個腦組織進行體外培養，因此含有大量雜細胞[6-10]；并選擇血清來誘導NSCs分化，而血清成分比較復雜，可能干擾后期的實驗結果。為研究來源SVZ的NSCs增殖、分化機制及為治療神經系統疾病尋找合適的種子細胞，本次研究特異性選擇小鼠SVZ組織作為體外培養NSCs來源，以減少雜細胞干擾；同時采用無生長因子的培養基誘導NSCs分化，排除生長因子對后期研究結果的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級新生（24 h內）ICR小鼠6只，雌雄不限，體質量2.1～2.5 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；實驗中對動物處置符合動物倫理學要求。
DMEM/F12、Neurobasal、N2、B27、Alexa Fluor 488標記驢抗大鼠IgG、Alexa Fluor 647標記驢抗小鼠IgG（Invitrogen公司，美國）；bFGF、EGF（PeproTech公司，美國）；BrdU、MTT、小鼠抗神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、小鼠抗BrdU（Sigma公司，美國）；大鼠抗巢蛋白（Nestin）（Millipore公司，美國）；山羊抗SOX-2（Santa Cruz公司，美國）；兔抗β-微管蛋白Ⅲ（Tuj-1；Abcam公司，英國）； Cy3偶聯的驢抗兔IgG及驢抗山羊IgG（Jackson Immuno Research公司，美國）。
倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Zeiss公司，德國）；體式顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶聯免疫檢測儀（Tecan公司，奧地利）；TDL-4低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。
1.2 NSCs培養
取新生ICR小鼠，冰上放置至昏迷，剪刀斷頭。無菌鑷打開顱腔取出大腦，D-Hank液浸洗，剝離腦膜和血管。體式顯微鏡下分離SVZ處組織（圖 1），置于4℃預冷的L15基礎培養基中，眼科剪剪碎。將混有組織碎片的基礎培養基移至15 mL離心管中，加入等體積0.01%胰酶和0.01%EDTA，37℃水浴消化10 min。反復機械吹打，靜置后吸除上清并加入雙倍體積的10%FBS基礎培養基終止消化，吹打制成單細胞懸液。經200目濾網過濾，收集濾液，以離心8 cm，1 000 r/min 離心5 min。棄上清，加入37℃復溫的完全培養基[即DMEM/F12和Neurobasal（1∶1），含1%N2、1%B27、20 ng/mL bFGF和20 ng/ mL EGF]，吹打成單細胞懸液并經活細胞計數后，以1×105個 / mL接種于培養皿內；于37℃、5%CO2培養箱中培養，每隔2 d半量更換培養基。培養7 d待原代克隆形成后，收集細胞液于15 mL離心管中，同上法離心5 min，吸除上清后向離心管中加入2 mL完全培養基，并用移液器輕輕吹打細胞液（注意避免產生氣泡）。吹打重懸后接種于完全培養基（細胞密度為1×105 個 / mL），并在37℃、5%CO2培養箱中培養。每隔2 d半量更換培養基，每7天傳代1次。培養期間倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。
圖1
新生小鼠SVZ示意圖 LV：側腦室
Figure1.
Schematic diagram of SVZ of neonatal mice LV: Lateral ventricle
1.3 NSCs鑒定
取第3代細胞，調整細胞密度，以10倍鏡下每視野5～10個神經球接種于含有包被多聚賴氨酸（0.1 g/L）無菌玻片的4孔板中，繼續采用完全培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養7 d，期間每隔2 d半量更換培養基。7 d后行免疫熒光細胞化學染色，用4℃預冷的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min。4℃預冷的PHT室溫孵育30 min，分別加入大鼠抗Nestin、山羊抗SOX-2（1∶200，所有抗體均用PHT稀釋），4℃冰箱內孵育過夜。PBS洗3 次，每次5 min，避光分別加入Alexa Fluor 488 標記的驢抗大鼠IgG、Cy3偶聯的驢抗山羊IgG（1∶1 000）。避光室溫孵育1 h，DAPI復染細胞核，PBS避光洗滌3次，每次5 min。以PBS代替一抗作為陰性對照。避光下用抗淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察培養的SVZ處細胞是否表達干細胞標志物（Nestin、SOX-2），其中綠色熒光代表Nestin表達陽性，紅色熒光表示SOX-2表達陽性，藍色熒光代表DAPI表達陽性。
1.4 體外培養不同時間NSCs增殖能力檢測
1.4.1 BrdU標記法
參照文獻[9]方法進行操作。取第3代NSCs制成單細胞懸液（密度1×105 個 / mL），采用完全培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養。分別于培養2、6 d取部分細胞接種至含包被多聚賴氨酸無菌玻片的4孔板中，繼續培養1 d（即分別培養3、7 d）。然后加入BrdU（終濃度10 μmol/L）共培養4 h后，以4℃預冷的多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次；37℃水浴以2 mol/L HCl 孵育10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。4℃預冷的PHT室溫孵育30 min，加入小鼠抗BrdU抗體（1∶200），4℃冰箱內孵育過夜。取出4孔板，PBS洗滌3次，每次5 min，避光加入Cy3（1∶1 000），其余步驟同NSCs鑒定。于20倍鏡下隨機選取15個視野拍照，計數15個視野中BrdU陽性細胞數，比較培養3、7 d BrdU陽性細胞數差異。實驗重復3次。
1.4.2 MTT法
參照文獻[10]方法進行操作。取第3代NSCs制成單細胞懸液（密度1×105個/mL），接種至96孔板，每孔加入100 μL，采用完全培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養。分別于培養3、7 d對NSCs行MTT檢測。具體步驟：吸棄上清，加入90 μL新鮮培養基，避光加入10 μL MTT溶液，繼續培養4 h后吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO，置搖床上低速搖晃15 min，使結晶充分溶解，在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔吸光度（A）值。比較培養3、7 d細胞A值，實驗重復3次。
1.5 體外培養不同時間NSCs分化能力檢測
取第3代NSCs，以每孔5～10個神經球接種于含有包被多聚賴氨酸無菌玻片的24孔板中，以分化培養基[即DMEM/F12和Neurobasal（1∶1），含1%N2、1%B27]誘導NSCs向神經元、星形膠質細胞分化。于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養，每隔2 d更換分化培養基，分別于3、7 d后行細胞免疫熒光染色。一抗分別用大鼠抗Nestin（1∶200）、兔抗Tuj-1（1∶500）、小鼠抗GFAP（1∶500）標記NSCs、神經元和星形膠質細胞，二抗分別用Cy3偶聯的驢抗兔IgG、Alexa Fluor 488 標記的驢抗大鼠IgG和Alexa Fluor 647 標記的驢抗小鼠IgG（1∶1 000），并用DAPI復染。其余步驟同NSCs鑒定。
激光共聚焦顯微鏡下觀察NSCs分化情況，其中綠色熒光代表Nestin表達陽性，紅色熒光代表Tuj-1（即神經元）表達陽性，藍色熒光代表GFAP（即星形膠質細胞）表達陽性。于20倍鏡下隨機選取15個視野，計數Tuj-1、GFAP陽性細胞，并計算陽性細胞百分比，公式：Tuj-1或GFAP陽性細胞數/總細胞數 ×100%。以Tuj-1陽性細胞百分比評價NSCs向神經元分化的能力，GFAP陽性細胞百分比評價NSCs向星形膠質細胞分化的能力。
1.6 統計學方法
采用Graphpad Prism5軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察及鑒定
倒置顯微鏡下觀察示，原代培養3 d后可見大量透亮、懸浮生長單細胞，同時出現大量大小均一且呈懸浮生長的“神經球”（圖 2 a）；7 d時見大量懸浮生長的“神經球”，且體積較前增大，部分神經球由于體積過大，中心細胞因營養不良呈黑色改變，部分神經球出現融合及貼壁分化現象（圖 2 b～d）。體外傳代培養后，第3代細胞培養7 d 時可見典型神經球形成，并出現神經球融合及貼壁分化現象（圖 2 e、f）。
圖2
倒置顯微鏡下觀察體外培養NSCs形態（×100） ? 原代培養3 d 黑色箭頭示神經球 白色箭頭示單個NSC ? ～? 原代培養7 d 見懸浮生長神經球、神經球融合及貼壁分化 ? 、 ? 第3代細胞培養7 d 見懸浮生長神經球、神經球融合及貼壁分化 ? ?激光共聚焦顯微鏡下觀察示，分離培養的SVZ處細胞Nestin、SOX-2均呈陽性表達，其中Nestin主要表達于細胞質，而SOX-2表達于細胞核。見圖 3。
2.2 體外培養不同時間NSCs增殖能力檢測
BrdU免疫熒光染色提示BrdU主要表達于處于增殖狀態細胞的細胞核（圖 4）。體外培養3 d的 NSCs中BrdU陽性細胞數為（75.817±2.961）個，顯著高于培養7 d的（56.600±4.881）個，比較差異有統計學意義（t=3.366，P=0.028）。
MTT檢測示，體外培養3 d的NSCs A值為0.478±0.025，亦顯著高于培養7 d的0.366±0.032，比較差異有統計學意義（t=2.752，P=0.011）。
2.3 體外培養不同時間NSCs分化能力檢測
經誘導培養后，NSCs能分化為神經元、星形膠質細胞（圖 5）。誘導分化3 d時Tuj-1、GFAP陽性細胞百分比分別為23.1%±3.7%、23.7%±3.8%，顯著低于誘導分化7 d的40.1%±3.6%、37.1%±4.5%，比較差異均有統計學意義（t=3.285，P=0.030；t=3.930，P=0.017）。
圖5
培養不同時間免疫熒光染色觀察NSCs向神經元、星形膠質細胞分化能力（激光共聚焦顯微鏡×200） 從左至右分別為Tuj-1、GFAP、Nestin、重疊 誘導培養3 d 誘導培養7 d
Figure5.
Comparison of differentiation ability of NSCs cultured in vitro for different cultivation time by anti-Tuj-1 and anti-GFAP immunofluorescence staining (Confocal laser scanning microscopy×200) From the left to the right for Tuj-1,GFAP,Nestin,and the overlay of the three markers respectively Induced differentiation of NSCs for 3 days Induced differentiation of NSCs for 7 days
3 討論
動物實驗表明，NSCs可用于治療伴不可逆神經元缺失的疾病或由不可逆神經元缺失而引起的疾病，但將其用于臨床前仍有許多問題需解決，例如如何有效分離和體外擴增NSCs [11]。目前，NSCs的研究主要集中于來源成年或胚胎時期的干細胞[12-13]，而對新生鼠NSCs，特別是新生小鼠SVZ的NSCs研究較少。因此，本研究選擇新生小鼠SVZ作為體外培養NSCs的細胞來源。相對于采用胚胎鼠皮層組織、胚胎或新生小鼠整個腦組織進行體外培養 [14-16]，本研究標本具有定位準確、雜細胞少的優點。
目前主要通過神經球（懸浮培養）法和貼壁培養法體外培養NSCs，其中懸浮培養是NSCs保持其干性的重要條件，主要用于控制神經發生的分子和細胞機制方面研究[17]。因此，本研究在細胞培養、傳代以及比較不同體外培養時間NSCs的增殖能力時，均盡量保持NSCs的懸浮生長；而在比較NSCs分化能力時則盡量促進NSCs的貼壁分化。為了提高實驗的客觀性，本研究選取了兩個干細胞的特異性標志物：Nestin和SOX-2。Nestin作為NSCs的標志物，被定義為第6類中間絲蛋白[18]。Nestin在未分化的中樞神經系統、正常成年中樞系統以及中樞神經系統腫瘤細胞中都有表達，有研究提示其在增生的內皮祖細胞中也有表達[19]。SOX-2是一種高遷移率組DNA結合蛋白，在鼠發育各個階段的多能NSCs，特別是在神經發生區如SVZ和SGZ處NSCs中都有表達[20-25]。我們發現，分離培養的SVZ處細胞表達神經干細胞的標志物Nestin、SOX-2，提示體外分離培養的細胞為NSCs。
以往對于新生大鼠NSCs的研究，多偏向于探討如何促進NSCs向神經元分化，而對于NSCs增殖能力的研究較少[7-8]。本研究對體外培養不同時間NSCs 的分化及增殖能力均進行了觀察。通過比較體外培養3、7 d時NSCs增殖及分化能力發現，與體外培養7 d相比，3 d時NSCs增殖能力較強，但向神經元和星形膠質細胞分化的能力較弱。我們分析原因可能是隨著培養時間延長，由于NSCs可以自我增殖，細胞數量不斷增多，而NSCs生長具有一定濃度依賴性，過高的細胞濃度可導致較大的神經球形成及神經球之間的融合，神經球中央細胞由于缺乏營養物質而呈黑色改變，甚至發生凋亡。此外NSCs數量增多也可增加細胞貼壁幾率，從而使更多的NSCs及由NSCs形成的神經球發生貼壁分化。
脊髓損傷病程中膠質瘢痕的形成常常阻礙了損傷后神經軸突的再生，而星形膠質細胞在膠質瘢痕的形成中起著重要作用，因此在移植NSCs治療脊髓損傷時的研究中，如何促進移植的NSCs向神經元分化，并抑制其向星形膠質細胞的分化，進而減少脊髓損傷后膠質瘢痕的形成，一直是研究熱點。我們發現相對于體外培養3 d NSCs，7 d時NSCs向神經元及星形膠質細胞分化的能力較強，這一結果為以后探索NSCs向神經元分化的具體機制提供了線索，也為移植NSCs治療小鼠脊髓損傷提供了重要參考。此外本研究主要比較了不同體外培養時間NSCs向神經元及星形膠質細胞分化能力的差別，而未研究NSCs具體向何種類型的神經元分化。因此NSCs向神經元分化的潛在調節機制，以及NSCs具體分化為何種類型的神經元將是下一步研究重點。
綜上所述，本研究建立了穩定的新生小鼠SVZ的NSCs體外分離、培養和鑒定體系，初步證實了新生小鼠SVZ細胞在體外進行分離后可高效培養成NSCs，同時研究了不同體外培養時間SVZ 的NSCs增殖、分化能力，為進一步探索NSCs的增殖、分化機制，以及為以后應用NSCs治療神經系統疾病提供了參考。
神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是一類起源于神經外胚層，能不斷自我更新，并在一定條件下分化為神經元和膠質細胞的多潛能干細胞。NSCs主要存在于哺乳動物腦部兩個區域：側腦室的室管膜下區（subventricular zone，SVZ）和海馬的齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）。目前體外NSCs分離培養的研究主要集中于來源SGZ的NSCs，對來源SVZ的NSCs研究相對較少。研究發現，來源于SVZ的NSCs不但具有自我更新和多向分化潛能，還可以沿嘴側遷移流通路長距離遷移至嗅球，并且在嗅球可以分化為多巴胺能神經元[1-5]。以往對來源SGZ的NSCs研究，主要選取鼠海馬組織或整個腦組織進行體外培養，因此含有大量雜細胞[6-10]；并選擇血清來誘導NSCs分化，而血清成分比較復雜，可能干擾后期的實驗結果。為研究來源SVZ的NSCs增殖、分化機制及為治療神經系統疾病尋找合適的種子細胞，本次研究特異性選擇小鼠SVZ組織作為體外培養NSCs來源，以減少雜細胞干擾；同時采用無生長因子的培養基誘導NSCs分化，排除生長因子對后期研究結果的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級新生（24 h內）ICR小鼠6只，雌雄不限，體質量2.1～2.5 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；實驗中對動物處置符合動物倫理學要求。
DMEM/F12、Neurobasal、N2、B27、Alexa Fluor 488標記驢抗大鼠IgG、Alexa Fluor 647標記驢抗小鼠IgG（Invitrogen公司，美國）；bFGF、EGF（PeproTech公司，美國）；BrdU、MTT、小鼠抗神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、小鼠抗BrdU（Sigma公司，美國）；大鼠抗巢蛋白（Nestin）（Millipore公司，美國）；山羊抗SOX-2（Santa Cruz公司，美國）；兔抗β-微管蛋白Ⅲ（Tuj-1；Abcam公司，英國）； Cy3偶聯的驢抗兔IgG及驢抗山羊IgG（Jackson Immuno Research公司，美國）。
倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Zeiss公司，德國）；體式顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶聯免疫檢測儀（Tecan公司，奧地利）；TDL-4低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。
1.2 NSCs培養
取新生ICR小鼠，冰上放置至昏迷，剪刀斷頭。無菌鑷打開顱腔取出大腦，D-Hank液浸洗，剝離腦膜和血管。體式顯微鏡下分離SVZ處組織（圖 1），置于4℃預冷的L15基礎培養基中，眼科剪剪碎。將混有組織碎片的基礎培養基移至15 mL離心管中，加入等體積0.01%胰酶和0.01%EDTA，37℃水浴消化10 min。反復機械吹打，靜置后吸除上清并加入雙倍體積的10%FBS基礎培養基終止消化，吹打制成單細胞懸液。經200目濾網過濾，收集濾液，以離心8 cm，1 000 r/min 離心5 min。棄上清，加入37℃復溫的完全培養基[即DMEM/F12和Neurobasal（1∶1），含1%N2、1%B27、20 ng/mL bFGF和20 ng/ mL EGF]，吹打成單細胞懸液并經活細胞計數后，以1×105個 / mL接種于培養皿內；于37℃、5%CO2培養箱中培養，每隔2 d半量更換培養基。培養7 d待原代克隆形成后，收集細胞液于15 mL離心管中，同上法離心5 min，吸除上清后向離心管中加入2 mL完全培養基，并用移液器輕輕吹打細胞液（注意避免產生氣泡）。吹打重懸后接種于完全培養基（細胞密度為1×105 個 / mL），并在37℃、5%CO2培養箱中培養。每隔2 d半量更換培養基，每7天傳代1次。培養期間倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。
圖1
新生小鼠SVZ示意圖 LV：側腦室
Figure1.
Schematic diagram of SVZ of neonatal mice LV: Lateral ventricle
1.3 NSCs鑒定
取第3代細胞，調整細胞密度，以10倍鏡下每視野5～10個神經球接種于含有包被多聚賴氨酸（0.1 g/L）無菌玻片的4孔板中，繼續采用完全培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養7 d，期間每隔2 d半量更換培養基。7 d后行免疫熒光細胞化學染色，用4℃預冷的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min。4℃預冷的PHT室溫孵育30 min，分別加入大鼠抗Nestin、山羊抗SOX-2（1∶200，所有抗體均用PHT稀釋），4℃冰箱內孵育過夜。PBS洗3 次，每次5 min，避光分別加入Alexa Fluor 488 標記的驢抗大鼠IgG、Cy3偶聯的驢抗山羊IgG（1∶1 000）。避光室溫孵育1 h，DAPI復染細胞核，PBS避光洗滌3次，每次5 min。以PBS代替一抗作為陰性對照。避光下用抗淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察培養的SVZ處細胞是否表達干細胞標志物（Nestin、SOX-2），其中綠色熒光代表Nestin表達陽性，紅色熒光表示SOX-2表達陽性，藍色熒光代表DAPI表達陽性。
1.4 體外培養不同時間NSCs增殖能力檢測
1.4.1 BrdU標記法
參照文獻[9]方法進行操作。取第3代NSCs制成單細胞懸液（密度1×105 個 / mL），采用完全培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養。分別于培養2、6 d取部分細胞接種至含包被多聚賴氨酸無菌玻片的4孔板中，繼續培養1 d（即分別培養3、7 d）。然后加入BrdU（終濃度10 μmol/L）共培養4 h后，以4℃預冷的多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次；37℃水浴以2 mol/L HCl 孵育10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。4℃預冷的PHT室溫孵育30 min，加入小鼠抗BrdU抗體（1∶200），4℃冰箱內孵育過夜。取出4孔板，PBS洗滌3次，每次5 min，避光加入Cy3（1∶1 000），其余步驟同NSCs鑒定。于20倍鏡下隨機選取15個視野拍照，計數15個視野中BrdU陽性細胞數，比較培養3、7 d BrdU陽性細胞數差異。實驗重復3次。
1.4.2 MTT法
參照文獻[10]方法進行操作。取第3代NSCs制成單細胞懸液（密度1×105個/mL），接種至96孔板，每孔加入100 μL，采用完全培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養。分別于培養3、7 d對NSCs行MTT檢測。具體步驟：吸棄上清，加入90 μL新鮮培養基，避光加入10 μL MTT溶液，繼續培養4 h后吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO，置搖床上低速搖晃15 min，使結晶充分溶解，在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔吸光度（A）值。比較培養3、7 d細胞A值，實驗重復3次。
1.5 體外培養不同時間NSCs分化能力檢測
取第3代NSCs，以每孔5～10個神經球接種于含有包被多聚賴氨酸無菌玻片的24孔板中，以分化培養基[即DMEM/F12和Neurobasal（1∶1），含1%N2、1%B27]誘導NSCs向神經元、星形膠質細胞分化。于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養，每隔2 d更換分化培養基，分別于3、7 d后行細胞免疫熒光染色。一抗分別用大鼠抗Nestin（1∶200）、兔抗Tuj-1（1∶500）、小鼠抗GFAP（1∶500）標記NSCs、神經元和星形膠質細胞，二抗分別用Cy3偶聯的驢抗兔IgG、Alexa Fluor 488 標記的驢抗大鼠IgG和Alexa Fluor 647 標記的驢抗小鼠IgG（1∶1 000），并用DAPI復染。其余步驟同NSCs鑒定。
激光共聚焦顯微鏡下觀察NSCs分化情況，其中綠色熒光代表Nestin表達陽性，紅色熒光代表Tuj-1（即神經元）表達陽性，藍色熒光代表GFAP（即星形膠質細胞）表達陽性。于20倍鏡下隨機選取15個視野，計數Tuj-1、GFAP陽性細胞，并計算陽性細胞百分比，公式：Tuj-1或GFAP陽性細胞數/總細胞數 ×100%。以Tuj-1陽性細胞百分比評價NSCs向神經元分化的能力，GFAP陽性細胞百分比評價NSCs向星形膠質細胞分化的能力。
1.6 統計學方法
采用Graphpad Prism5軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察及鑒定
倒置顯微鏡下觀察示，原代培養3 d后可見大量透亮、懸浮生長單細胞，同時出現大量大小均一且呈懸浮生長的“神經球”（圖 2 a）；7 d時見大量懸浮生長的“神經球”，且體積較前增大，部分神經球由于體積過大，中心細胞因營養不良呈黑色改變，部分神經球出現融合及貼壁分化現象（圖 2 b～d）。體外傳代培養后，第3代細胞培養7 d 時可見典型神經球形成，并出現神經球融合及貼壁分化現象（圖 2 e、f）。
圖2
倒置顯微鏡下觀察體外培養NSCs形態（×100） ? 原代培養3 d 黑色箭頭示神經球 白色箭頭示單個NSC ? ～? 原代培養7 d 見懸浮生長神經球、神經球融合及貼壁分化 ? 、 ? 第3代細胞培養7 d 見懸浮生長神經球、神經球融合及貼壁分化 ? ?激光共聚焦顯微鏡下觀察示，分離培養的SVZ處細胞Nestin、SOX-2均呈陽性表達，其中Nestin主要表達于細胞質，而SOX-2表達于細胞核。見圖 3。
2.2 體外培養不同時間NSCs增殖能力檢測
BrdU免疫熒光染色提示BrdU主要表達于處于增殖狀態細胞的細胞核（圖 4）。體外培養3 d的 NSCs中BrdU陽性細胞數為（75.817±2.961）個，顯著高于培養7 d的（56.600±4.881）個，比較差異有統計學意義（t=3.366，P=0.028）。
MTT檢測示，體外培養3 d的NSCs A值為0.478±0.025，亦顯著高于培養7 d的0.366±0.032，比較差異有統計學意義（t=2.752，P=0.011）。
2.3 體外培養不同時間NSCs分化能力檢測
經誘導培養后，NSCs能分化為神經元、星形膠質細胞（圖 5）。誘導分化3 d時Tuj-1、GFAP陽性細胞百分比分別為23.1%±3.7%、23.7%±3.8%，顯著低于誘導分化7 d的40.1%±3.6%、37.1%±4.5%，比較差異均有統計學意義（t=3.285，P=0.030；t=3.930，P=0.017）。
圖5
培養不同時間免疫熒光染色觀察NSCs向神經元、星形膠質細胞分化能力（激光共聚焦顯微鏡×200） 從左至右分別為Tuj-1、GFAP、Nestin、重疊 誘導培養3 d 誘導培養7 d
Figure5.
Comparison of differentiation ability of NSCs cultured in vitro for different cultivation time by anti-Tuj-1 and anti-GFAP immunofluorescence staining (Confocal laser scanning microscopy×200) From the left to the right for Tuj-1,GFAP,Nestin,and the overlay of the three markers respectively Induced differentiation of NSCs for 3 days Induced differentiation of NSCs for 7 days
3 討論
動物實驗表明，NSCs可用于治療伴不可逆神經元缺失的疾病或由不可逆神經元缺失而引起的疾病，但將其用于臨床前仍有許多問題需解決，例如如何有效分離和體外擴增NSCs [11]。目前，NSCs的研究主要集中于來源成年或胚胎時期的干細胞[12-13]，而對新生鼠NSCs，特別是新生小鼠SVZ的NSCs研究較少。因此，本研究選擇新生小鼠SVZ作為體外培養NSCs的細胞來源。相對于采用胚胎鼠皮層組織、胚胎或新生小鼠整個腦組織進行體外培養 [14-16]，本研究標本具有定位準確、雜細胞少的優點。
目前主要通過神經球（懸浮培養）法和貼壁培養法體外培養NSCs，其中懸浮培養是NSCs保持其干性的重要條件，主要用于控制神經發生的分子和細胞機制方面研究[17]。因此，本研究在細胞培養、傳代以及比較不同體外培養時間NSCs的增殖能力時，均盡量保持NSCs的懸浮生長；而在比較NSCs分化能力時則盡量促進NSCs的貼壁分化。為了提高實驗的客觀性，本研究選取了兩個干細胞的特異性標志物：Nestin和SOX-2。Nestin作為NSCs的標志物，被定義為第6類中間絲蛋白[18]。Nestin在未分化的中樞神經系統、正常成年中樞系統以及中樞神經系統腫瘤細胞中都有表達，有研究提示其在增生的內皮祖細胞中也有表達[19]。SOX-2是一種高遷移率組DNA結合蛋白，在鼠發育各個階段的多能NSCs，特別是在神經發生區如SVZ和SGZ處NSCs中都有表達[20-25]。我們發現，分離培養的SVZ處細胞表達神經干細胞的標志物Nestin、SOX-2，提示體外分離培養的細胞為NSCs。
以往對于新生大鼠NSCs的研究，多偏向于探討如何促進NSCs向神經元分化，而對于NSCs增殖能力的研究較少[7-8]。本研究對體外培養不同時間NSCs 的分化及增殖能力均進行了觀察。通過比較體外培養3、7 d時NSCs增殖及分化能力發現，與體外培養7 d相比，3 d時NSCs增殖能力較強，但向神經元和星形膠質細胞分化的能力較弱。我們分析原因可能是隨著培養時間延長，由于NSCs可以自我增殖，細胞數量不斷增多，而NSCs生長具有一定濃度依賴性，過高的細胞濃度可導致較大的神經球形成及神經球之間的融合，神經球中央細胞由于缺乏營養物質而呈黑色改變，甚至發生凋亡。此外NSCs數量增多也可增加細胞貼壁幾率，從而使更多的NSCs及由NSCs形成的神經球發生貼壁分化。
脊髓損傷病程中膠質瘢痕的形成常常阻礙了損傷后神經軸突的再生，而星形膠質細胞在膠質瘢痕的形成中起著重要作用，因此在移植NSCs治療脊髓損傷時的研究中，如何促進移植的NSCs向神經元分化，并抑制其向星形膠質細胞的分化，進而減少脊髓損傷后膠質瘢痕的形成，一直是研究熱點。我們發現相對于體外培養3 d NSCs，7 d時NSCs向神經元及星形膠質細胞分化的能力較強，這一結果為以后探索NSCs向神經元分化的具體機制提供了線索，也為移植NSCs治療小鼠脊髓損傷提供了重要參考。此外本研究主要比較了不同體外培養時間NSCs向神經元及星形膠質細胞分化能力的差別，而未研究NSCs具體向何種類型的神經元分化。因此NSCs向神經元分化的潛在調節機制，以及NSCs具體分化為何種類型的神經元將是下一步研究重點。
綜上所述，本研究建立了穩定的新生小鼠SVZ的NSCs體外分離、培養和鑒定體系，初步證實了新生小鼠SVZ細胞在體外進行分離后可高效培養成NSCs，同時研究了不同體外培養時間SVZ 的NSCs增殖、分化能力，為進一步探索NSCs的增殖、分化機制，以及為以后應用NSCs治療神經系統疾病提供了參考。
