引用本文： 魯文龍, 馮超. 自產氧型材料在組織工程學中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(5): 636-639. doi: 10.7507/1002-1892.20150136 復制
作為一項新興技術，組織工程學旨在將各種細胞及支架材料進行有效結合，以修復機體缺損，恢復相應生理功能[1]。近二十余年，該領域研究呈現飛速發展態勢。但要將這一技術應用于臨床，仍有許多關鍵問題有待解決，其中如何保證材料內部的氧供是重要環節。當材料厚度超過1 mm時，一般情況下氧氣無法在材料內部進行有效彌散，進而導致組織缺血壞死 [2]。針對這一問題，學者們提出了多種解決方案，例如在材料中添加VEGF促血管化、通過材料與富含血管的組織橋接進行回植前預血管化等。這些方法是通過在材料內部構建豐富的毛細血管網，以保證氧氣在材料內部的充分輸送[3-4]；但操作成本較高，而且對技術要求高，影響了技術的廣泛推廣。
“自產氧”概念的引入為解決這一問題提供了新思路。“自產氧”是指在材料制備過程中將產氧物質融合其中，得到的生物材料稱為“自產氧型材料”。 該類材料通過其自身理化屬性在體內外自行為材料本身及相關種子細胞提供氧分，從而保證組織工程修復重建過程的順利進行。其不僅具有良好生物相容性，而且能恒速、持久地釋放氧氣。同時，這種氧氣的釋放過程可在數日至數周時間內被精確調控，充分保障種子細胞在材料內部的活性、材料的快速血管化以及材料植入體內后的存活[5]。現就該技術的最新研究進展作一綜述。
1 自產氧物質的選擇
1.1 人工氧氣載體
人工氧氣載體是指通過體外制備技術，參照血紅蛋白結合和釋放氧氣的原理構建的一套仿真氧氣輸送運載體系，包括改良后的血紅蛋白體系或液態氟體系，其中液態氟是研究較早的產氧底物之一[6]。液態氟本身不具備釋氧能力，但能將各類重要氣體，如氧氣、二氧化碳等溶于其中[7-8]。當液態氟根據設定要求建立對應的液體體系后，氧氣可隨著液態氟到達材料任何部位[9-10]。但因液態氟會引起血管攣縮及細胞毒性反應，限制了該技術的臨床應用[11]。作為第1代產氧底物，目前已鮮有相關液態氟的研究報道。
1.2 無機固體過氧化物
無機固體過氧化物是目前制備自產氧型材料最常用的產氧底物，主要包括過碳酸鈉[(Na2CO3) 2·1.5H2O2]、過氧化鈣(CaO2) 及過氧化鎂(MgO2) 。上述物質與水相接觸后，均能產生過氧化氫（H2O2），在第2步反應中H2O2進一步分解出氧氣和水[12-14]。該原理是利用無機固體過氧化物作為產氧底物的基礎。
但進一步研究發現，不同的過氧化物具有不同的產氧屬性。在(Na2CO3) 2·1.5H2O2、CaO2以及MgO2中，MgO2的水溶解度最低，因而釋氧能力最弱[15]；同時由于制備過程中CaO2提純度顯著高于MgO2 [9]，所以CaO2作為產氧底物的價值高于MgO2。有關(Na2CO3) 2·1.5H2O2和CaO2作為產氧底物的比較研究顯示，(Na2CO3) 2·1.5H2O2體內釋氧時間為24～72 h，而CaO2經處理后釋氧時間長達10 d以上[16-17]。但該類物質作為產氧底物仍有一定缺陷，例如在第1步反應中所生成的H2O2中，往往還需添加催化劑，以調控第2步反應速率[18]。如果氧氣釋放速率控制不佳，過量超氧化物的產生反而會對材料上的種子細胞或機體周圍正常組織產生不良影響[19]。
1.3 生物產氧體系
生物產氧體系是自產氧型材料制備中的新概念。目前相關研究較多的是將生物藻類細胞作為產氧底物，如小球藻細胞等。當這些細胞接觸自然光源持續照射時，通過光合作用能產生并釋放氧氣，根據其工作原理，這一方法又稱為HULK法（Hyperoxie Unter Licht Konditionierung）[20-21]。此方法不僅對機體正常組織無明顯副作用，而且對相關的厭氧菌有一定程度抑菌作用。同時在體外實驗中能夠和成纖維細胞共存[22]，更重要的是該類產氧底物的產氧作用時間可進行調控，一旦生物材料血供得到良好構建后，可通過相對簡便方法將這些藻類細胞完全剔除，并且不會影響目標生物材料[23]。研究結果顯示，利用HULK法制備的自產氧型材料釋氧能力較細胞正常生長生理需要量高出近50倍，而其他方法制備的自產氧型材料產氧能力一般僅為正常生長生理需要量水平的1.2倍[10]。因此，該方法被研究者們認為是自產氧型材料的終極研發模式。
2 自產氧型材料的制備方法
2.1 自產氧型材料液態模式
將氧氣結合運氧物質制備成液態產氧材料，是早期研究的一種自產氧型材料構建模式。利用液態氟對氧氣的高溶解率，Chin等[24]將全氟溴辛烷與藻酸鹽共混乳化后，包裹于細胞表面，細胞的攝氧量較包裹前增加了8%～15%，初步表明該類液態產氧材料在細胞輸送氧氣方面起到一定作用。Li等[25]將H2O2與2-乙烯吡咯烷酮綁定后，采用殼芯結構將上述成分包裹于聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA]中制備成產氧微球，進一步和目標細胞進行共混。實驗結果顯示，這種液態的產氧合成材料能夠使細胞具有更好的生長活性，甚至維持細胞的分化進程，且材料釋氧能力能持續2 周。
2.2 含產氧底物的納米纖維
通過靜電紡絲技術，將產氧底物和靜電紡絲原料進行共混紡織或同軸共紡，制備自產氧型材料。此類研究報道較少，但可行性已獲得肯定。Schneider等[26]將不同濃度的CaO2混入聚己內酯（polycaprolactone，PCL）中進行靜電紡絲，制備CaO2-PCL納米纖維。釋氧能力檢測顯示，在釋氧第1天該材料的釋氧量呈爆發性增長，隨后趨于穩定；細胞毒性檢測顯示，釋氧第1天材料細胞毒性略大于后續數天，但仍在可接受范圍內。此外，他們還發現CaO2-PCL納米纖維可減少菌落在纖維上的聚集，降低感染發生率。上述研究結果證實了自產氧納米纖維的可行性，但材料的釋氧量、釋氧速率調控方面有待深入探究。
2.3 直接混合產氧底物的生物材料
在支架材料制備過程中直接混入各類產氧底物，是目前常用的自產氧型材料制備方法。Harrison等[16]將(Na2CO3) 2·1.5H2O2與PLGA混合后，采用溶劑澆筑法構建三維支架材料，材料釋氧時間達70 h。在后續研究中，他們將CaO2與PLGA共混構建三維支架材料，最終材料的釋氧時間提升至10 d[17]。而在目前最新的光合產氧材料研究中[21]，選擇將藻類細胞與纖維蛋白原混合構建產氧支架，該組合模式不僅可讓產氧細胞在固定部位發揮相應的釋氧作用，而且纖維蛋白原更適合藻類細胞的生長及其所產生的氧氣彌散。
3 自產氧型材料在組織工程領域的應用研究
3.1 液態自產氧型材料相關研究
早期組織工程領域相關研究主要選擇液相狀態的自產氧型材料，利用這種液態材料來提高體內目標細胞的活性狀態。研究結果顯示，采用液態氟產氧體系對肝臟細胞進行體外培養，能夠使肝細胞的攝氧量顯著增加，而且細胞活性即使在低氧環境下也能夠保持相對穩定[24]。隨后Li等[25]的心肌疾病相關研究中也顯示，將以產氧微球為主的混懸溶液注射入動物心肌梗死區域后，該產氧材料能保證心肌細胞的存活。此外，心肌球源性細胞在供氧充足的情況下，可高表達心肌細胞特征性mRNA，但在缺氧狀態下這種特征性表達開始減弱，而自產氧型材料介入后，這種高表達又會再次出現，提示心肌球源性細胞再次向心肌細胞開始分化。當自產氧型材料內的氧氣成分耗盡后，心肌球源性細胞的這種分化過程會立即停止，這一現象也提示自產氧型材料的時效與目標細胞的功能化表現密切相關。Ward等[27]將含有(Na2CO3) 2·1.5H2O2的自產氧溶液注入預先構建的肢體缺血大鼠模型的肌肉內，結果顯示，該類自產氧型材料能維持肌肉收縮力、降低低氧誘導因子1α的蓄積、減少氧化應激，有助于消除肌肉內因缺血低氧狀態而蓄積的糖原。以上研究成果也為恢復缺血狀態下肢體功能提供了新思路。在近期光合作用產氧材料研究中，出現了將胰島細胞和藻類細胞共混包被的液態自產氧型材料[20]。一旦通過光合作用，相關胰島細胞會出現相對更高的由于葡萄糖刺激而導致的胰島素反應。這也提供了一種構建仿真型胰島組織的新方法。
3.2 固態自產氧型材料相關研究
固態自產氧型材料在組織工程中的研究同樣廣泛，其一般用于較大面積組織缺損的修復重建。Harrison等[16]將PLGA-(Na2CO3) 2·1.5H2O2用于修復鼠皮膚缺損，在充分釋氧的3 d內修復處組織的成活情況明顯優于單純PLGA材料；但當氧氣釋放完成后，兩種材料修復組織在術后7 d時壞死程度無明顯差異。Pedraza等[5]將聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）與CaO2組合構建固態自產氧型材料，并用于胰島細胞的培養。研究顯示在低氧環境下，胰島細胞的增殖活力仍增強達3周，同時由于缺氧導致的胰島細胞功能減退在PDMS-CaO2材料中得到了明顯改善。Schenck等[23]將藻類細胞和纖維蛋白原制備的固態自產氧型材料回植入裸鼠皮下，回植后7 d觀察未發生感染現象，而且可以清晰看見毛細血管長入材料內部。
4 小結
自產氧型材料在組織工程研究領域是一門新興學科，現有研究成果表明了其在用于組織工程化臟器修復重建中的可行性及廣闊前景，但也存在許多問題有待解決，如材料的產氧量、產氧速率的控制、產氧時效的延長以及產氧過程中相關負面代謝產物的處理，這也是進一步探索的方向。
作為一項新興技術，組織工程學旨在將各種細胞及支架材料進行有效結合，以修復機體缺損，恢復相應生理功能[1]。近二十余年，該領域研究呈現飛速發展態勢。但要將這一技術應用于臨床，仍有許多關鍵問題有待解決，其中如何保證材料內部的氧供是重要環節。當材料厚度超過1 mm時，一般情況下氧氣無法在材料內部進行有效彌散，進而導致組織缺血壞死 [2]。針對這一問題，學者們提出了多種解決方案，例如在材料中添加VEGF促血管化、通過材料與富含血管的組織橋接進行回植前預血管化等。這些方法是通過在材料內部構建豐富的毛細血管網，以保證氧氣在材料內部的充分輸送[3-4]；但操作成本較高，而且對技術要求高，影響了技術的廣泛推廣。
“自產氧”概念的引入為解決這一問題提供了新思路。“自產氧”是指在材料制備過程中將產氧物質融合其中，得到的生物材料稱為“自產氧型材料”。 該類材料通過其自身理化屬性在體內外自行為材料本身及相關種子細胞提供氧分，從而保證組織工程修復重建過程的順利進行。其不僅具有良好生物相容性，而且能恒速、持久地釋放氧氣。同時，這種氧氣的釋放過程可在數日至數周時間內被精確調控，充分保障種子細胞在材料內部的活性、材料的快速血管化以及材料植入體內后的存活[5]。現就該技術的最新研究進展作一綜述。
1 自產氧物質的選擇
1.1 人工氧氣載體
人工氧氣載體是指通過體外制備技術，參照血紅蛋白結合和釋放氧氣的原理構建的一套仿真氧氣輸送運載體系，包括改良后的血紅蛋白體系或液態氟體系，其中液態氟是研究較早的產氧底物之一[6]。液態氟本身不具備釋氧能力，但能將各類重要氣體，如氧氣、二氧化碳等溶于其中[7-8]。當液態氟根據設定要求建立對應的液體體系后，氧氣可隨著液態氟到達材料任何部位[9-10]。但因液態氟會引起血管攣縮及細胞毒性反應，限制了該技術的臨床應用[11]。作為第1代產氧底物，目前已鮮有相關液態氟的研究報道。
1.2 無機固體過氧化物
無機固體過氧化物是目前制備自產氧型材料最常用的產氧底物，主要包括過碳酸鈉[(Na2CO3) 2·1.5H2O2]、過氧化鈣(CaO2) 及過氧化鎂(MgO2) 。上述物質與水相接觸后，均能產生過氧化氫（H2O2），在第2步反應中H2O2進一步分解出氧氣和水[12-14]。該原理是利用無機固體過氧化物作為產氧底物的基礎。
但進一步研究發現，不同的過氧化物具有不同的產氧屬性。在(Na2CO3) 2·1.5H2O2、CaO2以及MgO2中，MgO2的水溶解度最低，因而釋氧能力最弱[15]；同時由于制備過程中CaO2提純度顯著高于MgO2 [9]，所以CaO2作為產氧底物的價值高于MgO2。有關(Na2CO3) 2·1.5H2O2和CaO2作為產氧底物的比較研究顯示，(Na2CO3) 2·1.5H2O2體內釋氧時間為24～72 h，而CaO2經處理后釋氧時間長達10 d以上[16-17]。但該類物質作為產氧底物仍有一定缺陷，例如在第1步反應中所生成的H2O2中，往往還需添加催化劑，以調控第2步反應速率[18]。如果氧氣釋放速率控制不佳，過量超氧化物的產生反而會對材料上的種子細胞或機體周圍正常組織產生不良影響[19]。
1.3 生物產氧體系
生物產氧體系是自產氧型材料制備中的新概念。目前相關研究較多的是將生物藻類細胞作為產氧底物，如小球藻細胞等。當這些細胞接觸自然光源持續照射時，通過光合作用能產生并釋放氧氣，根據其工作原理，這一方法又稱為HULK法（Hyperoxie Unter Licht Konditionierung）[20-21]。此方法不僅對機體正常組織無明顯副作用，而且對相關的厭氧菌有一定程度抑菌作用。同時在體外實驗中能夠和成纖維細胞共存[22]，更重要的是該類產氧底物的產氧作用時間可進行調控，一旦生物材料血供得到良好構建后，可通過相對簡便方法將這些藻類細胞完全剔除，并且不會影響目標生物材料[23]。研究結果顯示，利用HULK法制備的自產氧型材料釋氧能力較細胞正常生長生理需要量高出近50倍，而其他方法制備的自產氧型材料產氧能力一般僅為正常生長生理需要量水平的1.2倍[10]。因此，該方法被研究者們認為是自產氧型材料的終極研發模式。
2 自產氧型材料的制備方法
2.1 自產氧型材料液態模式
將氧氣結合運氧物質制備成液態產氧材料，是早期研究的一種自產氧型材料構建模式。利用液態氟對氧氣的高溶解率，Chin等[24]將全氟溴辛烷與藻酸鹽共混乳化后，包裹于細胞表面，細胞的攝氧量較包裹前增加了8%～15%，初步表明該類液態產氧材料在細胞輸送氧氣方面起到一定作用。Li等[25]將H2O2與2-乙烯吡咯烷酮綁定后，采用殼芯結構將上述成分包裹于聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA]中制備成產氧微球，進一步和目標細胞進行共混。實驗結果顯示，這種液態的產氧合成材料能夠使細胞具有更好的生長活性，甚至維持細胞的分化進程，且材料釋氧能力能持續2 周。
2.2 含產氧底物的納米纖維
通過靜電紡絲技術，將產氧底物和靜電紡絲原料進行共混紡織或同軸共紡，制備自產氧型材料。此類研究報道較少，但可行性已獲得肯定。Schneider等[26]將不同濃度的CaO2混入聚己內酯（polycaprolactone，PCL）中進行靜電紡絲，制備CaO2-PCL納米纖維。釋氧能力檢測顯示，在釋氧第1天該材料的釋氧量呈爆發性增長，隨后趨于穩定；細胞毒性檢測顯示，釋氧第1天材料細胞毒性略大于后續數天，但仍在可接受范圍內。此外，他們還發現CaO2-PCL納米纖維可減少菌落在纖維上的聚集，降低感染發生率。上述研究結果證實了自產氧納米纖維的可行性，但材料的釋氧量、釋氧速率調控方面有待深入探究。
2.3 直接混合產氧底物的生物材料
在支架材料制備過程中直接混入各類產氧底物，是目前常用的自產氧型材料制備方法。Harrison等[16]將(Na2CO3) 2·1.5H2O2與PLGA混合后，采用溶劑澆筑法構建三維支架材料，材料釋氧時間達70 h。在后續研究中，他們將CaO2與PLGA共混構建三維支架材料，最終材料的釋氧時間提升至10 d[17]。而在目前最新的光合產氧材料研究中[21]，選擇將藻類細胞與纖維蛋白原混合構建產氧支架，該組合模式不僅可讓產氧細胞在固定部位發揮相應的釋氧作用，而且纖維蛋白原更適合藻類細胞的生長及其所產生的氧氣彌散。
3 自產氧型材料在組織工程領域的應用研究
3.1 液態自產氧型材料相關研究
早期組織工程領域相關研究主要選擇液相狀態的自產氧型材料，利用這種液態材料來提高體內目標細胞的活性狀態。研究結果顯示，采用液態氟產氧體系對肝臟細胞進行體外培養，能夠使肝細胞的攝氧量顯著增加，而且細胞活性即使在低氧環境下也能夠保持相對穩定[24]。隨后Li等[25]的心肌疾病相關研究中也顯示，將以產氧微球為主的混懸溶液注射入動物心肌梗死區域后，該產氧材料能保證心肌細胞的存活。此外，心肌球源性細胞在供氧充足的情況下，可高表達心肌細胞特征性mRNA，但在缺氧狀態下這種特征性表達開始減弱，而自產氧型材料介入后，這種高表達又會再次出現，提示心肌球源性細胞再次向心肌細胞開始分化。當自產氧型材料內的氧氣成分耗盡后，心肌球源性細胞的這種分化過程會立即停止，這一現象也提示自產氧型材料的時效與目標細胞的功能化表現密切相關。Ward等[27]將含有(Na2CO3) 2·1.5H2O2的自產氧溶液注入預先構建的肢體缺血大鼠模型的肌肉內，結果顯示，該類自產氧型材料能維持肌肉收縮力、降低低氧誘導因子1α的蓄積、減少氧化應激，有助于消除肌肉內因缺血低氧狀態而蓄積的糖原。以上研究成果也為恢復缺血狀態下肢體功能提供了新思路。在近期光合作用產氧材料研究中，出現了將胰島細胞和藻類細胞共混包被的液態自產氧型材料[20]。一旦通過光合作用，相關胰島細胞會出現相對更高的由于葡萄糖刺激而導致的胰島素反應。這也提供了一種構建仿真型胰島組織的新方法。
3.2 固態自產氧型材料相關研究
固態自產氧型材料在組織工程中的研究同樣廣泛，其一般用于較大面積組織缺損的修復重建。Harrison等[16]將PLGA-(Na2CO3) 2·1.5H2O2用于修復鼠皮膚缺損，在充分釋氧的3 d內修復處組織的成活情況明顯優于單純PLGA材料；但當氧氣釋放完成后，兩種材料修復組織在術后7 d時壞死程度無明顯差異。Pedraza等[5]將聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）與CaO2組合構建固態自產氧型材料，并用于胰島細胞的培養。研究顯示在低氧環境下，胰島細胞的增殖活力仍增強達3周，同時由于缺氧導致的胰島細胞功能減退在PDMS-CaO2材料中得到了明顯改善。Schenck等[23]將藻類細胞和纖維蛋白原制備的固態自產氧型材料回植入裸鼠皮下，回植后7 d觀察未發生感染現象，而且可以清晰看見毛細血管長入材料內部。
4 小結
自產氧型材料在組織工程研究領域是一門新興學科，現有研究成果表明了其在用于組織工程化臟器修復重建中的可行性及廣闊前景，但也存在許多問題有待解決，如材料的產氧量、產氧速率的控制、產氧時效的延長以及產氧過程中相關負面代謝產物的處理，這也是進一步探索的方向。