引用本文： 陸宵彤, 邢珍珍, 鄭濟林, 張杰, 田京. 組織工程三要素結合領域在軟骨修復的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(5): 632-635. doi: 10.7507/1002-1892.20150135 復制
軟骨細胞代謝不活躍、缺乏血液供應而修復能力低下，使關節軟骨損傷成為治療難題，未治療的關節軟骨損傷將導致持續的關節疼痛及骨關節炎[1]。目前針對軟骨損傷的治療可概括為3類：① 骨髓刺激技術：鉆孔術、微骨折術、自體基質誘導軟骨再生（autologous matrix induced chondrogenesis，AMIC）等；② 直接軟骨替代：骨軟骨移植、馬賽克移植等；③ 細胞療法：自體軟骨細胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI）、基質誘導自體軟骨細胞移植（matrix-induced autologous chondrocyte implantation，MACI）等。盡管微骨折術仍被公認為軟骨修復的黃金手段，但其對大面積損傷（＞2 cm2）修復效果有限，且為纖維軟骨修復，長期療效不佳[2]。近年來，組織工程正逐漸成為新一代軟骨修復技術。如ACI法，獲取自體低負重部位正常軟骨細胞，體外擴增后植入損傷處并覆蓋骨膜促進修復，其長期療效（＞10年）獲得了肯定[3]。然而，ACI存在操作復雜、價格昂貴、致骨膜過度增生等不足，因此又激勵了新技術的出現，如第2代細胞療法--膠原覆蓋自體軟骨細胞移植，用Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白膜取代自體骨膜覆蓋細胞，與ACI取得了相似臨床效果，且并發癥較少[4]。
近年來，研究熱點聚焦于組織工程三要素--細胞、支架、生長信息三者的結合領域，推動了3種新的軟骨修復技術：模擬自然軟骨組織結構的細胞-支架修復技術、通過誘導劑促進細胞聚集的無細胞-基于支架的修復技術以及可避免支架降解產物毒性作用的無支架-基于細胞技術[5]。現對近年來組織工程軟骨修復在這3個方面的最新進展綜述如下，為其進一步研究提供依據。
1 細胞-支架軟骨修復技術
由ACI發展而來的第3代組織工程細胞療法MACI自1998年首次提出，是應用最廣泛的細胞-支架軟骨修復技術。與ACI不同，MACI將體外擴增的自體軟骨細胞種植在可吸收的Ⅰ/Ⅲ型豬衍生膠原膜上，細胞面向下移植至缺損部位，增加了細胞存活率和表型穩定[6]。
1.1 MACI療效隨訪
多項臨床研究證實MACI是治療軟骨損傷的有效方法。Ebert等[7]對20例MACI關節鏡術后患者隨訪2年，其膝關節損傷與骨關節炎評分（KOOS）、簡明健康調查量表（SF-36量表）、疼痛視覺模擬評分（VAS）、6 min步行試驗及膝蓋活動度評估均有明顯提高，MRI顯示90%患者移植物填充良好。該研究團隊另一項5年隨訪結果顯示，術后1年所有患者KOOS評分明顯升高達90.5%，并持續至術后第5年；MRI軟骨修復組織觀察評分明顯提高，＞80%患者移植物完全填充損傷區域，厚度達正常軟骨50%以上，與周圍組織交聯良好[8]。最近一項長期隨訪研究顯示，16例MACI治療的膝關節軟骨損傷患者，術后10年國際膝關節文獻委員會（IKDC）膝關節評估、諾伊斯體育活動評級、KOOS評分均明顯提高，證實了MACI治療膝關節軟骨損傷效果的穩定性[9]。
1.2 MACI比較研究
Basad等[10]在60例創傷后大面積軟骨損傷（＞4 cm2）患者的隨機對照試驗中發現，MACI的術后2年效果明顯優于微骨折術。另一項研究對保守治療、成形術或微骨折術失敗的踝關節軟骨損傷患者進行MACI治療，隨訪2年，美國矯形足踝協會（AO FAS）后足評估、SF-36量表評估結果均提示患者在生理功能和軀體疼痛方面有明顯改善[11]。Beyzadeoglu等[12]使用MACI治療兩次微骨折術失敗的股骨外側髁9 cm2嚴重損傷足球運動員，術后1年Tegner-Lysholm評分、Brittberg-Peterson評分、MRI檢測及二次關節鏡檢查均提示軟骨修復良好，且運動水平已恢復至損傷前。以上研究提示MACI是治療成形術、微骨折術失敗患者的有效方法。
然而，部分研究認為MACI并未優于其他療法。Bartlett等[13]對膠原覆蓋自體軟骨細胞移植和MACI治療軟骨缺損效果進行比較研究，術后1年隨訪顯示兩者在臨床預后評分及關節鏡、組織學表現上相近。一項包含6 920例患者的大樣本量調查顯示，ACI、MACI、微骨折術、自體骨軟骨移植4種方法術后2年的療效接近[14]。另一項研究也表明ACI、MACI、馬賽克移植術具有相似的臨床效果，在Lysholm-Gillquist評分上ACI甚至優于MACI[15]。
以上不同的研究結果可能與評價指標差異有關。研究表明MACI術后新生軟骨的組織學、影像學結果與宏觀表現間無直接聯系，且關節鏡檢查結果常常高估了患者的軟骨修復情況[16]。此外，KOOS評分中的運動/娛樂、生活質量2項評分被認為是檢測MACI患者預后最敏感的指標，而SF-36量表的精神健康、Tegner評分是最不敏感的指標[17]。因此，MACI的優越性判斷仍需更具可比性的研究和進一步薈萃分析。
1.3 MACI技術改良
Moreira等[18]研究表明使用高通量軟骨細胞微聚體代替原有的單個軟骨細胞，可提高MACI術后新生軟骨的質量。在雄性裸鼠MACI實驗中，相比單細胞及50～200個細胞微聚體，含100個軟骨細胞的微聚體表現出最好的Ⅰ/Ⅱ型膠原蛋白基因表達平衡，軟骨相關基因表達量更高；其基質金屬蛋白酶1、9、13的mRNA水平明顯低于單個軟骨細胞，基質沉降更明顯。Centola等[19]選用貝伐珠單抗（抗血管生成藥）活化的纖維蛋白/透明質酸支架代替Ⅰ/Ⅲ型膠原膜進行MACI改良，動物實驗顯示貝伐珠單抗抑制內皮細胞增生及巨噬細胞的遷移，減少移植物內生血管的形成而提高其成熟度和生存率（移植6周后實驗組生存率75%，對照組18%）；提示了抗血管生成藥在MACI技術改良方面的可行性。
盡管MACI已在歐洲與澳洲廣泛應用，但仍處于美國食品藥品監督管理局（FDA）審核階段，其大樣本比較分析、長期（＞10年）治療效果、最適的治療部位、適應證、禁忌證等仍需要進一步研究。
2 無細胞-基于支架的軟骨修復技術
自體軟骨細胞和BMSCs依賴的組織工程技術為關節軟骨修復提供了更多選擇，但此類技術需要細胞分離、擴增及誘導分化，費時長、費用高，又因與細胞相關而在FDA審核上難度較高[5]。因此，無細胞-基于支架的軟骨修復技術引起了研究者的興趣。
AMIC是典型的無細胞-基于支架的軟骨修復技術，將微骨折術與Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基質結合，在微骨折術釋放血液及MSCs后，將Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基質縫合或黏合于軟骨創面。整個治療僅需一次手術，費用低、性價比高，成為第2代骨髓刺激技術[20]。Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基質的應用可保護微骨折術所形成的血栓，為軟骨組織修復提供良好的微環境，促進MSCs遷移至損傷部位并增殖、分化為軟骨組織，使AMIC的修復能力強于單純微骨折術，可用于中、小面積軟骨損傷治療[21]。
多項短期隨訪（1～2年）證明AMIC在治療膝踝關節軟骨損傷中安全有效[22-23]，可使足球運動員完全恢復損傷前的運動功能[24]。而在結構復雜、治療困難的髖關節，AMIC可減輕髖關節軟骨損傷患者疼痛，提高關節功能，其療效與MACI相當，因僅需一次手術且性價比高而比MACI更具吸引力[25]。組織學研究發現，5例AMIC術后1年患者關節鏡檢查呈現正常軟骨外觀，組織學提示1例為透明軟骨修復，1例為透明軟骨/纖維軟骨混合修復，另3例為纖維軟骨修復，說明AMIC具備透明軟骨修復的潛力[26]。Gille等[27]對27例平均損傷面積4.2 cm2患者進行了AMIC治療，隨訪5年，Meyer評分、Tegner評分、Lysholm評分、國際軟骨修復協會評分、辛辛那提評分及MRI檢查指標在術后2年持續明顯提高，并維持穩定至術后5年。更有趣的是，該研究發現AMIC療效與患者年齡、身體質量指數、既往骨科手術次數無關，極大地保證了AMIC預后的穩定性，提示其具有廣泛的應用前景。
Pascarella等[28]對AMIC技術進行了改良，采用Pridie鉆孔術代替微骨折術，促進了MSCs進入損傷區域并原位增殖。Dhollander等[29]在AMIC中加用富血小板血漿凝膠治療5例髕軟骨損傷患者，以提高血栓穩定性；術后2年隨訪顯示，MRI差異不明顯但患者臨床癥狀明顯改善。Siclari等[30]使用聚乙醇酸-透明質酸支架聯合富血小板血漿代替Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基質，對52例軟骨損傷患者進行治療，術后1年患者KOOS評分較術前明顯提高，組織學分析顯示損傷部位透明狀軟骨修復。
目前，無論是AMIC還是其改良技術，均缺少長期隨訪及比較研究，其應用價值仍需進一步驗證。
3 無支架-基于細胞的軟骨修復技術
既往由于技術限制，使最接近胚胎發育過程的組織工程軟骨制造難以實現，而需引入支架輔助軟骨細胞重構。然而，支架應用帶來的降解產物毒性、應力遮蔽等不足，也刺激了無支架-基于細胞的軟骨修復技術發展。無支架干擾細胞間信號傳遞、阻斷應力刺激，新生軟骨組織所處微環境將更接近自然狀態，可獲得更接近自然軟骨的組織工程軟骨[31]。
其中一項無支架-基于細胞的技術即軟骨球，為一種自體軟骨細胞移植方法。早期動物實驗顯示，軟骨球與周圍組織整合良好，可促進軟骨細胞再生并維持其表型，并產生大量Ⅱ型膠原蛋白、黏多糖等正常軟骨基質成分，修復效果良好[32-33]。近年來，少量臨床試驗證實，軟骨球治療人體軟骨損傷效果與微骨折術相近，而其早期治療（＜3年）效果明顯優于微骨折術[33-34]。此外，同種異體軟骨細胞移植也引起研究者的關注。體外研究發現[35]，青少年軟骨細胞增殖速度明顯快于成人，產生的黏多糖是成人軟骨細胞的100倍，Ⅱ、Ⅳ型膠原蛋白mRNA水平分別為成人的100倍和70倍；淋巴細胞增殖試驗陰性，提示不引發免疫排斥反應。目前，軟骨球及同種異體軟骨細胞移植正在Ⅲ期臨床試驗中[5]。
近年來，自我裝配途徑制備組織工程軟骨也取得一定進展。多項體外實驗表明，對MSCs或自體軟骨細胞施加化學刺激（如低氧、TGF-β、膠原蛋白交聯劑）或力學刺激（間歇性靜水壓）可促進軟骨細胞形成成熟的軟骨組織，其產物在細胞外基質成分與機械性能（抗拉、抗壓能力）方面均接近自然軟骨組織，且具有良好的周圍組織交聯能力及體內成熟速度[36-37]。與基于支架的軟骨修復技術比較，無支架技術在基質形成與生物力學性能方面具有優勢[38]。
4 展望
組織工程已成為新一代軟骨修復技術的核心，其最終目標是獲得在生物學、結構學及功能上與自然軟骨接近的仿生組織。目前，針對組織工程三要素結合領域的技術仍處在研究階段，即使是相對成熟的MACI與AMIC也缺乏大樣本、長期隨訪結果。但已有研究提示這些技術在形成透明狀軟骨、實現更接近原始狀態的軟骨修復中具有優勢，成為組織工程軟骨修復研究的新方向。
軟骨細胞代謝不活躍、缺乏血液供應而修復能力低下，使關節軟骨損傷成為治療難題，未治療的關節軟骨損傷將導致持續的關節疼痛及骨關節炎[1]。目前針對軟骨損傷的治療可概括為3類：① 骨髓刺激技術：鉆孔術、微骨折術、自體基質誘導軟骨再生（autologous matrix induced chondrogenesis，AMIC）等；② 直接軟骨替代：骨軟骨移植、馬賽克移植等；③ 細胞療法：自體軟骨細胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI）、基質誘導自體軟骨細胞移植（matrix-induced autologous chondrocyte implantation，MACI）等。盡管微骨折術仍被公認為軟骨修復的黃金手段，但其對大面積損傷（＞2 cm2）修復效果有限，且為纖維軟骨修復，長期療效不佳[2]。近年來，組織工程正逐漸成為新一代軟骨修復技術。如ACI法，獲取自體低負重部位正常軟骨細胞，體外擴增后植入損傷處并覆蓋骨膜促進修復，其長期療效（＞10年）獲得了肯定[3]。然而，ACI存在操作復雜、價格昂貴、致骨膜過度增生等不足，因此又激勵了新技術的出現，如第2代細胞療法--膠原覆蓋自體軟骨細胞移植，用Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白膜取代自體骨膜覆蓋細胞，與ACI取得了相似臨床效果，且并發癥較少[4]。
近年來，研究熱點聚焦于組織工程三要素--細胞、支架、生長信息三者的結合領域，推動了3種新的軟骨修復技術：模擬自然軟骨組織結構的細胞-支架修復技術、通過誘導劑促進細胞聚集的無細胞-基于支架的修復技術以及可避免支架降解產物毒性作用的無支架-基于細胞技術[5]。現對近年來組織工程軟骨修復在這3個方面的最新進展綜述如下，為其進一步研究提供依據。
1 細胞-支架軟骨修復技術
由ACI發展而來的第3代組織工程細胞療法MACI自1998年首次提出，是應用最廣泛的細胞-支架軟骨修復技術。與ACI不同，MACI將體外擴增的自體軟骨細胞種植在可吸收的Ⅰ/Ⅲ型豬衍生膠原膜上，細胞面向下移植至缺損部位，增加了細胞存活率和表型穩定[6]。
1.1 MACI療效隨訪
多項臨床研究證實MACI是治療軟骨損傷的有效方法。Ebert等[7]對20例MACI關節鏡術后患者隨訪2年，其膝關節損傷與骨關節炎評分（KOOS）、簡明健康調查量表（SF-36量表）、疼痛視覺模擬評分（VAS）、6 min步行試驗及膝蓋活動度評估均有明顯提高，MRI顯示90%患者移植物填充良好。該研究團隊另一項5年隨訪結果顯示，術后1年所有患者KOOS評分明顯升高達90.5%，并持續至術后第5年；MRI軟骨修復組織觀察評分明顯提高，＞80%患者移植物完全填充損傷區域，厚度達正常軟骨50%以上，與周圍組織交聯良好[8]。最近一項長期隨訪研究顯示，16例MACI治療的膝關節軟骨損傷患者，術后10年國際膝關節文獻委員會（IKDC）膝關節評估、諾伊斯體育活動評級、KOOS評分均明顯提高，證實了MACI治療膝關節軟骨損傷效果的穩定性[9]。
1.2 MACI比較研究
Basad等[10]在60例創傷后大面積軟骨損傷（＞4 cm2）患者的隨機對照試驗中發現，MACI的術后2年效果明顯優于微骨折術。另一項研究對保守治療、成形術或微骨折術失敗的踝關節軟骨損傷患者進行MACI治療，隨訪2年，美國矯形足踝協會（AO FAS）后足評估、SF-36量表評估結果均提示患者在生理功能和軀體疼痛方面有明顯改善[11]。Beyzadeoglu等[12]使用MACI治療兩次微骨折術失敗的股骨外側髁9 cm2嚴重損傷足球運動員，術后1年Tegner-Lysholm評分、Brittberg-Peterson評分、MRI檢測及二次關節鏡檢查均提示軟骨修復良好，且運動水平已恢復至損傷前。以上研究提示MACI是治療成形術、微骨折術失敗患者的有效方法。
然而，部分研究認為MACI并未優于其他療法。Bartlett等[13]對膠原覆蓋自體軟骨細胞移植和MACI治療軟骨缺損效果進行比較研究，術后1年隨訪顯示兩者在臨床預后評分及關節鏡、組織學表現上相近。一項包含6 920例患者的大樣本量調查顯示，ACI、MACI、微骨折術、自體骨軟骨移植4種方法術后2年的療效接近[14]。另一項研究也表明ACI、MACI、馬賽克移植術具有相似的臨床效果，在Lysholm-Gillquist評分上ACI甚至優于MACI[15]。
以上不同的研究結果可能與評價指標差異有關。研究表明MACI術后新生軟骨的組織學、影像學結果與宏觀表現間無直接聯系，且關節鏡檢查結果常常高估了患者的軟骨修復情況[16]。此外，KOOS評分中的運動/娛樂、生活質量2項評分被認為是檢測MACI患者預后最敏感的指標，而SF-36量表的精神健康、Tegner評分是最不敏感的指標[17]。因此，MACI的優越性判斷仍需更具可比性的研究和進一步薈萃分析。
1.3 MACI技術改良
Moreira等[18]研究表明使用高通量軟骨細胞微聚體代替原有的單個軟骨細胞，可提高MACI術后新生軟骨的質量。在雄性裸鼠MACI實驗中，相比單細胞及50～200個細胞微聚體，含100個軟骨細胞的微聚體表現出最好的Ⅰ/Ⅱ型膠原蛋白基因表達平衡，軟骨相關基因表達量更高；其基質金屬蛋白酶1、9、13的mRNA水平明顯低于單個軟骨細胞，基質沉降更明顯。Centola等[19]選用貝伐珠單抗（抗血管生成藥）活化的纖維蛋白/透明質酸支架代替Ⅰ/Ⅲ型膠原膜進行MACI改良，動物實驗顯示貝伐珠單抗抑制內皮細胞增生及巨噬細胞的遷移，減少移植物內生血管的形成而提高其成熟度和生存率（移植6周后實驗組生存率75%，對照組18%）；提示了抗血管生成藥在MACI技術改良方面的可行性。
盡管MACI已在歐洲與澳洲廣泛應用，但仍處于美國食品藥品監督管理局（FDA）審核階段，其大樣本比較分析、長期（＞10年）治療效果、最適的治療部位、適應證、禁忌證等仍需要進一步研究。
2 無細胞-基于支架的軟骨修復技術
自體軟骨細胞和BMSCs依賴的組織工程技術為關節軟骨修復提供了更多選擇，但此類技術需要細胞分離、擴增及誘導分化，費時長、費用高，又因與細胞相關而在FDA審核上難度較高[5]。因此，無細胞-基于支架的軟骨修復技術引起了研究者的興趣。
AMIC是典型的無細胞-基于支架的軟骨修復技術，將微骨折術與Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基質結合，在微骨折術釋放血液及MSCs后，將Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基質縫合或黏合于軟骨創面。整個治療僅需一次手術，費用低、性價比高，成為第2代骨髓刺激技術[20]。Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基質的應用可保護微骨折術所形成的血栓，為軟骨組織修復提供良好的微環境，促進MSCs遷移至損傷部位并增殖、分化為軟骨組織，使AMIC的修復能力強于單純微骨折術，可用于中、小面積軟骨損傷治療[21]。
多項短期隨訪（1～2年）證明AMIC在治療膝踝關節軟骨損傷中安全有效[22-23]，可使足球運動員完全恢復損傷前的運動功能[24]。而在結構復雜、治療困難的髖關節，AMIC可減輕髖關節軟骨損傷患者疼痛，提高關節功能，其療效與MACI相當，因僅需一次手術且性價比高而比MACI更具吸引力[25]。組織學研究發現，5例AMIC術后1年患者關節鏡檢查呈現正常軟骨外觀，組織學提示1例為透明軟骨修復，1例為透明軟骨/纖維軟骨混合修復，另3例為纖維軟骨修復，說明AMIC具備透明軟骨修復的潛力[26]。Gille等[27]對27例平均損傷面積4.2 cm2患者進行了AMIC治療，隨訪5年，Meyer評分、Tegner評分、Lysholm評分、國際軟骨修復協會評分、辛辛那提評分及MRI檢查指標在術后2年持續明顯提高，并維持穩定至術后5年。更有趣的是，該研究發現AMIC療效與患者年齡、身體質量指數、既往骨科手術次數無關，極大地保證了AMIC預后的穩定性，提示其具有廣泛的應用前景。
Pascarella等[28]對AMIC技術進行了改良，采用Pridie鉆孔術代替微骨折術，促進了MSCs進入損傷區域并原位增殖。Dhollander等[29]在AMIC中加用富血小板血漿凝膠治療5例髕軟骨損傷患者，以提高血栓穩定性；術后2年隨訪顯示，MRI差異不明顯但患者臨床癥狀明顯改善。Siclari等[30]使用聚乙醇酸-透明質酸支架聯合富血小板血漿代替Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基質，對52例軟骨損傷患者進行治療，術后1年患者KOOS評分較術前明顯提高，組織學分析顯示損傷部位透明狀軟骨修復。
目前，無論是AMIC還是其改良技術，均缺少長期隨訪及比較研究，其應用價值仍需進一步驗證。
3 無支架-基于細胞的軟骨修復技術
既往由于技術限制，使最接近胚胎發育過程的組織工程軟骨制造難以實現，而需引入支架輔助軟骨細胞重構。然而，支架應用帶來的降解產物毒性、應力遮蔽等不足，也刺激了無支架-基于細胞的軟骨修復技術發展。無支架干擾細胞間信號傳遞、阻斷應力刺激，新生軟骨組織所處微環境將更接近自然狀態，可獲得更接近自然軟骨的組織工程軟骨[31]。
其中一項無支架-基于細胞的技術即軟骨球，為一種自體軟骨細胞移植方法。早期動物實驗顯示，軟骨球與周圍組織整合良好，可促進軟骨細胞再生并維持其表型，并產生大量Ⅱ型膠原蛋白、黏多糖等正常軟骨基質成分，修復效果良好[32-33]。近年來，少量臨床試驗證實，軟骨球治療人體軟骨損傷效果與微骨折術相近，而其早期治療（＜3年）效果明顯優于微骨折術[33-34]。此外，同種異體軟骨細胞移植也引起研究者的關注。體外研究發現[35]，青少年軟骨細胞增殖速度明顯快于成人，產生的黏多糖是成人軟骨細胞的100倍，Ⅱ、Ⅳ型膠原蛋白mRNA水平分別為成人的100倍和70倍；淋巴細胞增殖試驗陰性，提示不引發免疫排斥反應。目前，軟骨球及同種異體軟骨細胞移植正在Ⅲ期臨床試驗中[5]。
近年來，自我裝配途徑制備組織工程軟骨也取得一定進展。多項體外實驗表明，對MSCs或自體軟骨細胞施加化學刺激（如低氧、TGF-β、膠原蛋白交聯劑）或力學刺激（間歇性靜水壓）可促進軟骨細胞形成成熟的軟骨組織，其產物在細胞外基質成分與機械性能（抗拉、抗壓能力）方面均接近自然軟骨組織，且具有良好的周圍組織交聯能力及體內成熟速度[36-37]。與基于支架的軟骨修復技術比較，無支架技術在基質形成與生物力學性能方面具有優勢[38]。
4 展望
組織工程已成為新一代軟骨修復技術的核心，其最終目標是獲得在生物學、結構學及功能上與自然軟骨接近的仿生組織。目前，針對組織工程三要素結合領域的技術仍處在研究階段，即使是相對成熟的MACI與AMIC也缺乏大樣本、長期隨訪結果。但已有研究提示這些技術在形成透明狀軟骨、實現更接近原始狀態的軟骨修復中具有優勢，成為組織工程軟骨修復研究的新方向。