引用本文： 笪琳萃, 王旻, 龔梅, 張利, 解慧琪. 軟組織填充材料聚氨酯微球的制備及體外生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(5): 626-631. doi: 10.7507/1002-1892.20150134 復制
將可注射、可載藥的生物醫用材料應用于微創手術中，不僅可最大限度減輕患者痛苦與瘢痕形成，還能顯著降低手術費用、縮短治療時間[1-4]。微球因具有緩釋、控釋藥物、維持較高血藥濃度或靶器官濃度、療效持久、安全等優點，常作為藥物的緩釋載體應用于醫學領域[5-10]。近年來，由于微球可攜載生長因子或藥物進行組織修復或治療，且可運用于微創手術領域，逐漸成為組織工程領域的研究熱點[9, 11-13]。
聚氨酯微球的分子設計自由度大，其力學性能、降解性能、孔結構及其所帶電荷均可通過反應條件控制，且具有良好的吸附、離子交換、螯合能力、高彈性和高強度等特點，因此有望作為一種新的醫用填充材料[5, 14-19]。目前聚氨酯微球材料在軟組織填充方面的研究罕有報道，本研究采用自乳化法制備了具有不同形貌結構的聚氨酯微球，通過體外與人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothe lial cells，HUVECs）聯合培養的方法，初步評價了聚氨酯微球對細胞存活、增殖的影響。此外，我們還對材料的浸提液做了溶血實驗，初步觀察了聚氨酯微球的血液相容性，為進一步體內實驗及臨床應用提供 參考依據，探討其用于軟組織填充材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡新西蘭大白兔1只，雌雄不限，體重2.5 kg，由四川大學動物實驗中心提供。HUVECs引自中科院上海細胞庫。
異佛爾酮二異氰酸酯、聚四氫呋喃醚1000、2，2-二羥甲基丙酸、辛酸亞錫（上海晶純生化科技股份有限公司）；三乙胺（成都市科龍化工試劑廠）；H-DMEM培養基、FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；鈣黃綠素（calcein-acetoxymethylester，Calcein-AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Sigma公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；株式會社同仁化學研究所，日本）。
170SX型傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet公司，美國）；Model X-630型掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；CO2細胞培養箱（SANYO公司，日本）；超凈工作臺（Thermo公司，美國）；E600型熒光顯微鏡、TE2000-U型光學顯微鏡（Nikon公司，日本）；連續光譜微孔板測讀儀（Molecular Devices公司，美國）。
1.2 聚氨酯微球的制備及理化性能檢測
1.2.1 聚氨酯微球制備
將0.144 mol異佛爾酮二異氰酸酯、0.054 mol聚四氫呋喃醚1000加入三頸瓶中，75℃反應3 h；然后降溫至50℃，加入0.054 mol 2，2-二羥甲基丙酸和一定量催化劑辛酸亞錫，55℃反應3～4 h；最后在室溫下將聚氨酯預聚物加入200 mL 0.54 mol/L三乙胺水溶液中，分別以乳化速率1 000、2 000、3 000、4 000 r/min乳化約2 h，得到各微球乳液樣品。以離心半徑5.7 cm、1 500 r/min離心10 min，所得樣品用去離子水洗滌2次，-50℃真空冷凍干燥備用。
1.2.2 理化性能檢測
① 傅里葉變換紅外光譜分析：用傅里葉變換紅外光譜儀測試乳化速率為2 000 r/min、乳化時間為2 h的干燥聚氨酯微球分子結構，掃描波數范圍為400～4 000 cm-1。
1.2.3 微球形態學觀察
取各乳化速率乳化2 h的微球樣品，依次進行冷凍干燥、噴金，掃描電鏡觀察微球表面形貌。再將乳化速率為2 000 r/min，乳化時間為30、60、90、120 min制得的聚氨酯乳液分別滴于載玻片上，光鏡觀察微球形貌；將乳液涂膜后，室溫下揮發成膜，掃描電鏡觀察其表面與橫截面。根據掃描電鏡結果，選擇球形度較好的乳化速率制備的聚氨酯微球用于后續體外生物相容性實驗研究。
1.3 聚氨酯微球浸提液制備及細胞培養
根據GB/T 16886.12標準[20]92-94規定的浸提比例（試樣表面積/浸提液體積=6∶1），將材料分別浸泡于含10%FBS的H-DMEM培養基（用于HUVECs增殖活力檢測）和生理鹽水（用于溶血實驗檢測），于37℃、5%CO2隔水式恒溫培養箱中浸提24 h，制得浸提原液。
取HUVECs置于含10%FBS的H-DMEM培養基中，于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中培養，每隔1 d換液1次；取對數生長期細胞，胰蛋白酶消化后以1 000 r/min離心3 min備用。
1.4 觀測指標
1.4.1 Calcein-AM/PI雙染觀察
將聚氨酯微球制成的薄膜制成直徑大小為16 mm的圓片并黏在蓋玻片上，環氧乙烷滅菌。將材料置于6孔板中，每組設3個復孔，于無血清的H-DMEM培養基中浸泡24 h。同1.3方法培養細胞，以1×105個/孔密度將細胞分別接種于聚氨酯材料上（材料組）和蓋玻片上（對照組）。在3 mL含10%FBS的H-DMEM培養基中培養3 d后吸出培養基，PBS洗滌2遍，加入2 mL Calcein-AM/PI溶液，室溫下避光染色30 min，PBS洗滌2遍，熒光顯微鏡下觀察細胞形態及生長黏附情況，細胞質綠染為活細胞，紅染為死細胞。
1.4.2 CCK-8法檢測細胞增殖活力
同1.3方法制備浸提液及培養HUVECs，取對數生長期的HU VECs細胞懸液以2×103個/孔密度接種于96孔板中，于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中培養24 h使細胞充分貼壁，棄原液。實驗分為3 組：陽性對照組（A組）、聚氨酯微球組（B組）及空白對照組（C組），每組設4個復孔。A組每孔加入100 μL含1%苯酚、10%FBS的H-DMEM培養基培養，B組每孔加入100 μL聚氨酯微球浸提原液培養，C組每孔加入100 μL含10%FBS的H-DMEM培養基培養，隔天換液。分別于培養1、3、5 d后每孔加入110 μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中孵育3 h，采用酶標儀于450 nm波長下測量吸光度（A）值，計算各組均值，并繪制細胞生長曲線。
1.4.3 溶血實驗測定血液相容性
根據GB/T 16886.4標準[20]234-235，取兔耳緣靜脈抗凝血，按新鮮抗凝血∶生理鹽水= 4∶5 的比例稀釋。同1.3方法制備浸提液作為實驗組，生理鹽水作為陰性對照組，蒸餾水作為陽性對照組。每組各加稀釋兔血0.2 mL，于37℃水浴中保溫60 min后，以5.7 cm、1 500 r/ min離心5 min。觀察各組溶血情況，并測定上清在545 nm波長處的A值。按以下公式計算溶血率（hemolysis rate，HR）： （實驗組A值－陰性對照組A值）/（陽性對照組A值－陰性對照組A值）×100%。根據GB/T 16886.4標準，陽性對照A值為0.8±0.3，陰性對照A值應≤0.03，當待測樣本HR≥5%認為實驗材料有溶血作用。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 聚氨酯微球理化性能檢測
2.1.1 傅里葉變換紅外光譜分析
聚氨酯微球的紅外吸收光譜圖顯示，3 500 cm-1的寬峰為氨基甲酸酯結構中N-H的伸縮振動吸收峰，1 054 cm-1附近是典型的醚鍵特征峰。1 740 cm-1附近處的吸收峰為氨酯基中C=O的伸縮振動峰，1 385 cm-1處出現了較為明顯的氨基甲酸酯的微區結晶峰。而且2 240～2 270 cm-1區域內異氰酸根基團特征吸收峰基本消失，說明聚氨酯體系中的異氰酸根已完全參與了反應。這些特征峰的出現或消失表明實驗成功合成了聚氨酯。見圖 1。
圖1
聚氨酯微球的紅外吸收光譜圖
Figure1.
Fourier transform infrared spectrometer of polyurethane microsphere
2.1.2 微球形態學觀察
不同乳化速率下所得微球的掃描電鏡觀察示，乳化速率為1 000 r/min時微球粒徑較大，球形度不佳且團聚成塊（圖 2 a）；乳化速率為2 000 r/min時微球分散為球形度佳且粒徑分布及大小均較理想的顆粒，僅有少量微球發生了團聚（圖 2 b）；乳化速率為3 000 r/min時，聚氨酯乳液形成蛛網狀和塊狀的不規則聚集體（圖 2 c）；乳化速率為4 000 r/min時，乳液中的聚氨酯微球徹底變形，形成多孔疏松的絲狀物（圖 2 d）。光鏡觀察示，乳化速率為2 000 r/min乳化30 min時，聚氨酯預聚物聚集為粒徑很小的微球（圖 3 a）；小微球相互碰撞聚集形成粒徑較大的微球，在乳化60 min時可見明顯的大粒徑微球包裹小粒徑微球的結構（圖 3 b）；乳化90 min時微球粒徑變小（圖 3 c）；乳化120 min時微球的大小和結構趨于穩定（圖 3 d）。將乳液涂膜后，室溫下揮發成膜的表面與橫截面掃描電鏡觀察示，薄膜表面為粗糙的致密結構（圖 4 a）；截面的孔徑分布范圍較寬，呈現不均勻的多孔結構（圖 4 b）。綜上，選擇乳化速率為2 000 r/min制備的聚氨酯微球用于后續研究。
圖2
不同乳化速率時微球形貌掃描電鏡觀察 ? 1 000 r/min（×500） ? 2 000 r/min （×2 000） ? 3 000 r/ min（×1 000） ? 4 000 r/ min（×200）? ?圖 3 乳化速率2 000 r/min下不同乳化時間時微球形貌光鏡觀察 ? 30 min（×400） ? 60 min（×200） ? 90 min（×200） ? 120 min（×100）? ?圖 4 微球成膜的掃描電鏡觀察 ? 膜表面（×70） ? 膜橫截面（×60）? ?圖 5 培養3 d Calcein-AM/PI雙染觀察（熒光顯微鏡×200） ? 材料組 ? 對照組? ?圖 6 CCK-8法檢測各組培養各時間點細胞增殖活力? ?圖 7 各組溶血實驗觀察 ? 實驗組 ? 陰性對照組 ? 陽性對照組
Figure2.
SEM observation of microspheres at different emulsification rates ? 1 000 r/min (×500) ? 2 000 r/min (×2 000) ? 3 000 r/ min (×1 000) ? 4 000 r/min (×200)? ? Fig. 3 Light microscope observation of microspheres at different emulsification periods at 2 000 r/min ? Thirty minutes (×400) ? Sixty minutes (×200) ? Ninety minutes (×200) ? One hundred and twenty minutes (×100)? ? Fig. 4 SEM observation of membranes consisting of microspheres ? Surface (×70) ? Section (×60)? ? Fig. 5 Calcein-AM/PI staining of HUVECs on the surface of materials and cover slip (Fluorescence microscopy×200) ? Material group ? Control group? ? Fig. 6 Cell viability of each group by CCK-8 assay at 1,3,and 5 days? ? Fig. 7 Hemolysis observation of micropheres and controls ? Polyurethane microspheres extracts group ? Negative control group ? Positive control group
2.2 聚氨酯微球生物相容性檢測
2.2.1 Calcein-AM/PI雙染觀察
熒光顯微鏡觀察示，培養3 d后材料組與對照組表面均以綠染的活細胞為主，細胞形態良好，輪廓清晰。其中材料組只有零星死細胞，表面細胞形態以鋪路石狀為主，細胞更為飽滿，伸展性更好，細胞間通過偽足相互緊密連接（圖 5 a）。對照組雖然死細胞較少，細胞形態也較為理想，但其表面細胞黏附較少，細胞間連接較為疏松（圖 5 b）。
2.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活力
細胞生長曲線示，A組A值較低，細胞幾乎不生長；B、C組A值呈時間依賴性，隨培養時間延長而升高。各時間點B、C組A值均高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中培養1 d時，B、C組A值比較差異無統計學意義（P＞0.05）；3、5 d時B組A值高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6。
2.2.3 溶血實驗測定血液相容性
陰性對照組及實驗組的上清液澄清透明，紅細胞均完好沉淀于玻璃試管底部，無溶血發生；而陽性對照組紅細胞全部破裂，溶液呈紅色，底部未見紅細胞沉淀；見圖 7。陽性對照組A值為0.864±0.002，陰性對照組A值為0.015±0.001，實驗組HR值為0.39%±0.07%（＜5%），表明材料無溶血作用。
3 討論
自乳化法是將帶有親水性基團的小分子接到聚合物鏈上，使之可在剪切力作用下分散于水溶液中[21]。本研究先將親水基接入聚氨酯鏈段，然后加入醋酸進行中和，得到了穩定的聚氨酯鏈段微球。乳化步驟中成鹽劑、乳化方式、乳化溫度、攪拌速度等一系列條件的選擇對聚氨酯微球的粒徑、形狀有重要影響，甚至直接關系到制備實驗的成敗[22]。本研究通過一系列實驗摸索，選擇醋酸為成鹽劑，自乳化法為乳化方式，室溫為乳化溫度，乳化速率分別為1 000、2 000、3 000和4 000 r/min，制備了一系列微球乳液樣品，離心后得到聚氨酯微球。
材料表面的理化特性，如表面粗糙度、孔徑、孔隙度、親疏水性等，對細胞的行為尤其是細胞黏附影響較大[23-24]。而材料表面形態又與其制備條件密切相關，本研究對不同乳化速率下所得微球進行了表征。掃描電鏡觀察示，微球形貌因其在制備過程中的乳化速率而異，其中乳化速率為2 000 r/min時制得的微球球形度、粒徑分布及大小均較為理想。光鏡觀察示，聚氨酯預聚物在水中分散成小的微球顆粒，其中親水基團分布在微球的表面形成殼，疏水的鏈段向內卷曲形成核。隨著乳化時間延長，微球相互碰撞長大，小粒徑微球被包裹于大粒徑微球內部。聚氨酯乳液經室溫揮發后可得到聚氨酯薄膜，掃描電鏡觀察示其表面具有一定粗糙度，利于細胞黏附。
聚氨酯微球為合成高分子材料，合成過程中使用了有機溶劑丙酮、催化劑辛酸亞錫，這些因素可能會對其生物相容性造成一定影響。本研究中我們采用材料體外生物相容性評價常用的HUVECs，用CCK-8法研究制備的聚氨酯微球細胞毒性。結果顯示，各組A值隨培養時間延長而升高，B、C組各時間點細胞增殖活力均高于C組，且3、5 d時B組細胞增殖活力高于C組，提示聚氨酯微球對細胞的毒性較小。此外，活死細胞染色結果也顯示材料組HUVECs的形態較為理想，而且材料的粗糙表面對細胞黏附具有促進作用。上述研究結果表明材料無明顯細胞毒性。
直接或間接接觸血液的材料，可能與血液成分發生作用導致血栓形成、溶血、血液中有形成分改變等發生，血液相容性是材料生物學評價的重要組成部分。本研究采用評價血液相容性的經典方法--溶血實驗，對聚氨酯微球進行生物學評價。結果顯示，實驗組的HR為0.39%±0.07%，表明溶血實驗結果可靠，材料無溶血作用。
綜上述，我們通過自乳化法制備了球形度較好的聚氨酯微球，其化學結構及相對分子質量可通過調節反應原料的投料比等方法進行控制，具有高度的可設計性。同時聚氨酯微球的細胞毒性低，細胞能夠較好黏附于材料表面，細胞狀態佳，且具備良好血液相容性，有望用作軟組織缺損的填充材料。在后續研究中，我們將通過動物實驗對聚氨酯微球的體內生物相容性進行評價，并根據組織缺損部位的類型復合功能性生物活性材料，拓寬其可能的應用范圍。
將可注射、可載藥的生物醫用材料應用于微創手術中，不僅可最大限度減輕患者痛苦與瘢痕形成，還能顯著降低手術費用、縮短治療時間[1-4]。微球因具有緩釋、控釋藥物、維持較高血藥濃度或靶器官濃度、療效持久、安全等優點，常作為藥物的緩釋載體應用于醫學領域[5-10]。近年來，由于微球可攜載生長因子或藥物進行組織修復或治療，且可運用于微創手術領域，逐漸成為組織工程領域的研究熱點[9, 11-13]。
聚氨酯微球的分子設計自由度大，其力學性能、降解性能、孔結構及其所帶電荷均可通過反應條件控制，且具有良好的吸附、離子交換、螯合能力、高彈性和高強度等特點，因此有望作為一種新的醫用填充材料[5, 14-19]。目前聚氨酯微球材料在軟組織填充方面的研究罕有報道，本研究采用自乳化法制備了具有不同形貌結構的聚氨酯微球，通過體外與人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothe lial cells，HUVECs）聯合培養的方法，初步評價了聚氨酯微球對細胞存活、增殖的影響。此外，我們還對材料的浸提液做了溶血實驗，初步觀察了聚氨酯微球的血液相容性，為進一步體內實驗及臨床應用提供 參考依據，探討其用于軟組織填充材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡新西蘭大白兔1只，雌雄不限，體重2.5 kg，由四川大學動物實驗中心提供。HUVECs引自中科院上海細胞庫。
異佛爾酮二異氰酸酯、聚四氫呋喃醚1000、2，2-二羥甲基丙酸、辛酸亞錫（上海晶純生化科技股份有限公司）；三乙胺（成都市科龍化工試劑廠）；H-DMEM培養基、FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；鈣黃綠素（calcein-acetoxymethylester，Calcein-AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Sigma公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；株式會社同仁化學研究所，日本）。
170SX型傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet公司，美國）；Model X-630型掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；CO2細胞培養箱（SANYO公司，日本）；超凈工作臺（Thermo公司，美國）；E600型熒光顯微鏡、TE2000-U型光學顯微鏡（Nikon公司，日本）；連續光譜微孔板測讀儀（Molecular Devices公司，美國）。
1.2 聚氨酯微球的制備及理化性能檢測
1.2.1 聚氨酯微球制備
將0.144 mol異佛爾酮二異氰酸酯、0.054 mol聚四氫呋喃醚1000加入三頸瓶中，75℃反應3 h；然后降溫至50℃，加入0.054 mol 2，2-二羥甲基丙酸和一定量催化劑辛酸亞錫，55℃反應3～4 h；最后在室溫下將聚氨酯預聚物加入200 mL 0.54 mol/L三乙胺水溶液中，分別以乳化速率1 000、2 000、3 000、4 000 r/min乳化約2 h，得到各微球乳液樣品。以離心半徑5.7 cm、1 500 r/min離心10 min，所得樣品用去離子水洗滌2次，-50℃真空冷凍干燥備用。
1.2.2 理化性能檢測
① 傅里葉變換紅外光譜分析：用傅里葉變換紅外光譜儀測試乳化速率為2 000 r/min、乳化時間為2 h的干燥聚氨酯微球分子結構，掃描波數范圍為400～4 000 cm-1。
1.2.3 微球形態學觀察
取各乳化速率乳化2 h的微球樣品，依次進行冷凍干燥、噴金，掃描電鏡觀察微球表面形貌。再將乳化速率為2 000 r/min，乳化時間為30、60、90、120 min制得的聚氨酯乳液分別滴于載玻片上，光鏡觀察微球形貌；將乳液涂膜后，室溫下揮發成膜，掃描電鏡觀察其表面與橫截面。根據掃描電鏡結果，選擇球形度較好的乳化速率制備的聚氨酯微球用于后續體外生物相容性實驗研究。
1.3 聚氨酯微球浸提液制備及細胞培養
根據GB/T 16886.12標準[20]92-94規定的浸提比例（試樣表面積/浸提液體積=6∶1），將材料分別浸泡于含10%FBS的H-DMEM培養基（用于HUVECs增殖活力檢測）和生理鹽水（用于溶血實驗檢測），于37℃、5%CO2隔水式恒溫培養箱中浸提24 h，制得浸提原液。
取HUVECs置于含10%FBS的H-DMEM培養基中，于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中培養，每隔1 d換液1次；取對數生長期細胞，胰蛋白酶消化后以1 000 r/min離心3 min備用。
1.4 觀測指標
1.4.1 Calcein-AM/PI雙染觀察
將聚氨酯微球制成的薄膜制成直徑大小為16 mm的圓片并黏在蓋玻片上，環氧乙烷滅菌。將材料置于6孔板中，每組設3個復孔，于無血清的H-DMEM培養基中浸泡24 h。同1.3方法培養細胞，以1×105個/孔密度將細胞分別接種于聚氨酯材料上（材料組）和蓋玻片上（對照組）。在3 mL含10%FBS的H-DMEM培養基中培養3 d后吸出培養基，PBS洗滌2遍，加入2 mL Calcein-AM/PI溶液，室溫下避光染色30 min，PBS洗滌2遍，熒光顯微鏡下觀察細胞形態及生長黏附情況，細胞質綠染為活細胞，紅染為死細胞。
1.4.2 CCK-8法檢測細胞增殖活力
同1.3方法制備浸提液及培養HUVECs，取對數生長期的HU VECs細胞懸液以2×103個/孔密度接種于96孔板中，于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中培養24 h使細胞充分貼壁，棄原液。實驗分為3 組：陽性對照組（A組）、聚氨酯微球組（B組）及空白對照組（C組），每組設4個復孔。A組每孔加入100 μL含1%苯酚、10%FBS的H-DMEM培養基培養，B組每孔加入100 μL聚氨酯微球浸提原液培養，C組每孔加入100 μL含10%FBS的H-DMEM培養基培養，隔天換液。分別于培養1、3、5 d后每孔加入110 μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中孵育3 h，采用酶標儀于450 nm波長下測量吸光度（A）值，計算各組均值，并繪制細胞生長曲線。
1.4.3 溶血實驗測定血液相容性
根據GB/T 16886.4標準[20]234-235，取兔耳緣靜脈抗凝血，按新鮮抗凝血∶生理鹽水= 4∶5 的比例稀釋。同1.3方法制備浸提液作為實驗組，生理鹽水作為陰性對照組，蒸餾水作為陽性對照組。每組各加稀釋兔血0.2 mL，于37℃水浴中保溫60 min后，以5.7 cm、1 500 r/ min離心5 min。觀察各組溶血情況，并測定上清在545 nm波長處的A值。按以下公式計算溶血率（hemolysis rate，HR）： （實驗組A值－陰性對照組A值）/（陽性對照組A值－陰性對照組A值）×100%。根據GB/T 16886.4標準，陽性對照A值為0.8±0.3，陰性對照A值應≤0.03，當待測樣本HR≥5%認為實驗材料有溶血作用。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 聚氨酯微球理化性能檢測
2.1.1 傅里葉變換紅外光譜分析
聚氨酯微球的紅外吸收光譜圖顯示，3 500 cm-1的寬峰為氨基甲酸酯結構中N-H的伸縮振動吸收峰，1 054 cm-1附近是典型的醚鍵特征峰。1 740 cm-1附近處的吸收峰為氨酯基中C=O的伸縮振動峰，1 385 cm-1處出現了較為明顯的氨基甲酸酯的微區結晶峰。而且2 240～2 270 cm-1區域內異氰酸根基團特征吸收峰基本消失，說明聚氨酯體系中的異氰酸根已完全參與了反應。這些特征峰的出現或消失表明實驗成功合成了聚氨酯。見圖 1。
圖1
聚氨酯微球的紅外吸收光譜圖
Figure1.
Fourier transform infrared spectrometer of polyurethane microsphere
2.1.2 微球形態學觀察
不同乳化速率下所得微球的掃描電鏡觀察示，乳化速率為1 000 r/min時微球粒徑較大，球形度不佳且團聚成塊（圖 2 a）；乳化速率為2 000 r/min時微球分散為球形度佳且粒徑分布及大小均較理想的顆粒，僅有少量微球發生了團聚（圖 2 b）；乳化速率為3 000 r/min時，聚氨酯乳液形成蛛網狀和塊狀的不規則聚集體（圖 2 c）；乳化速率為4 000 r/min時，乳液中的聚氨酯微球徹底變形，形成多孔疏松的絲狀物（圖 2 d）。光鏡觀察示，乳化速率為2 000 r/min乳化30 min時，聚氨酯預聚物聚集為粒徑很小的微球（圖 3 a）；小微球相互碰撞聚集形成粒徑較大的微球，在乳化60 min時可見明顯的大粒徑微球包裹小粒徑微球的結構（圖 3 b）；乳化90 min時微球粒徑變小（圖 3 c）；乳化120 min時微球的大小和結構趨于穩定（圖 3 d）。將乳液涂膜后，室溫下揮發成膜的表面與橫截面掃描電鏡觀察示，薄膜表面為粗糙的致密結構（圖 4 a）；截面的孔徑分布范圍較寬，呈現不均勻的多孔結構（圖 4 b）。綜上，選擇乳化速率為2 000 r/min制備的聚氨酯微球用于后續研究。
圖2
不同乳化速率時微球形貌掃描電鏡觀察 ? 1 000 r/min（×500） ? 2 000 r/min （×2 000） ? 3 000 r/ min（×1 000） ? 4 000 r/ min（×200）? ?圖 3 乳化速率2 000 r/min下不同乳化時間時微球形貌光鏡觀察 ? 30 min（×400） ? 60 min（×200） ? 90 min（×200） ? 120 min（×100）? ?圖 4 微球成膜的掃描電鏡觀察 ? 膜表面（×70） ? 膜橫截面（×60）? ?圖 5 培養3 d Calcein-AM/PI雙染觀察（熒光顯微鏡×200） ? 材料組 ? 對照組? ?圖 6 CCK-8法檢測各組培養各時間點細胞增殖活力? ?圖 7 各組溶血實驗觀察 ? 實驗組 ? 陰性對照組 ? 陽性對照組
Figure2.
SEM observation of microspheres at different emulsification rates ? 1 000 r/min (×500) ? 2 000 r/min (×2 000) ? 3 000 r/ min (×1 000) ? 4 000 r/min (×200)? ? Fig. 3 Light microscope observation of microspheres at different emulsification periods at 2 000 r/min ? Thirty minutes (×400) ? Sixty minutes (×200) ? Ninety minutes (×200) ? One hundred and twenty minutes (×100)? ? Fig. 4 SEM observation of membranes consisting of microspheres ? Surface (×70) ? Section (×60)? ? Fig. 5 Calcein-AM/PI staining of HUVECs on the surface of materials and cover slip (Fluorescence microscopy×200) ? Material group ? Control group? ? Fig. 6 Cell viability of each group by CCK-8 assay at 1,3,and 5 days? ? Fig. 7 Hemolysis observation of micropheres and controls ? Polyurethane microspheres extracts group ? Negative control group ? Positive control group
2.2 聚氨酯微球生物相容性檢測
2.2.1 Calcein-AM/PI雙染觀察
熒光顯微鏡觀察示，培養3 d后材料組與對照組表面均以綠染的活細胞為主，細胞形態良好，輪廓清晰。其中材料組只有零星死細胞，表面細胞形態以鋪路石狀為主，細胞更為飽滿，伸展性更好，細胞間通過偽足相互緊密連接（圖 5 a）。對照組雖然死細胞較少，細胞形態也較為理想，但其表面細胞黏附較少，細胞間連接較為疏松（圖 5 b）。
2.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活力
細胞生長曲線示，A組A值較低，細胞幾乎不生長；B、C組A值呈時間依賴性，隨培養時間延長而升高。各時間點B、C組A值均高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中培養1 d時，B、C組A值比較差異無統計學意義（P＞0.05）；3、5 d時B組A值高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6。
2.2.3 溶血實驗測定血液相容性
陰性對照組及實驗組的上清液澄清透明，紅細胞均完好沉淀于玻璃試管底部，無溶血發生；而陽性對照組紅細胞全部破裂，溶液呈紅色，底部未見紅細胞沉淀；見圖 7。陽性對照組A值為0.864±0.002，陰性對照組A值為0.015±0.001，實驗組HR值為0.39%±0.07%（＜5%），表明材料無溶血作用。
3 討論
自乳化法是將帶有親水性基團的小分子接到聚合物鏈上，使之可在剪切力作用下分散于水溶液中[21]。本研究先將親水基接入聚氨酯鏈段，然后加入醋酸進行中和，得到了穩定的聚氨酯鏈段微球。乳化步驟中成鹽劑、乳化方式、乳化溫度、攪拌速度等一系列條件的選擇對聚氨酯微球的粒徑、形狀有重要影響，甚至直接關系到制備實驗的成敗[22]。本研究通過一系列實驗摸索，選擇醋酸為成鹽劑，自乳化法為乳化方式，室溫為乳化溫度，乳化速率分別為1 000、2 000、3 000和4 000 r/min，制備了一系列微球乳液樣品，離心后得到聚氨酯微球。
材料表面的理化特性，如表面粗糙度、孔徑、孔隙度、親疏水性等，對細胞的行為尤其是細胞黏附影響較大[23-24]。而材料表面形態又與其制備條件密切相關，本研究對不同乳化速率下所得微球進行了表征。掃描電鏡觀察示，微球形貌因其在制備過程中的乳化速率而異，其中乳化速率為2 000 r/min時制得的微球球形度、粒徑分布及大小均較為理想。光鏡觀察示，聚氨酯預聚物在水中分散成小的微球顆粒，其中親水基團分布在微球的表面形成殼，疏水的鏈段向內卷曲形成核。隨著乳化時間延長，微球相互碰撞長大，小粒徑微球被包裹于大粒徑微球內部。聚氨酯乳液經室溫揮發后可得到聚氨酯薄膜，掃描電鏡觀察示其表面具有一定粗糙度，利于細胞黏附。
聚氨酯微球為合成高分子材料，合成過程中使用了有機溶劑丙酮、催化劑辛酸亞錫，這些因素可能會對其生物相容性造成一定影響。本研究中我們采用材料體外生物相容性評價常用的HUVECs，用CCK-8法研究制備的聚氨酯微球細胞毒性。結果顯示，各組A值隨培養時間延長而升高，B、C組各時間點細胞增殖活力均高于C組，且3、5 d時B組細胞增殖活力高于C組，提示聚氨酯微球對細胞的毒性較小。此外，活死細胞染色結果也顯示材料組HUVECs的形態較為理想，而且材料的粗糙表面對細胞黏附具有促進作用。上述研究結果表明材料無明顯細胞毒性。
直接或間接接觸血液的材料，可能與血液成分發生作用導致血栓形成、溶血、血液中有形成分改變等發生，血液相容性是材料生物學評價的重要組成部分。本研究采用評價血液相容性的經典方法--溶血實驗，對聚氨酯微球進行生物學評價。結果顯示，實驗組的HR為0.39%±0.07%，表明溶血實驗結果可靠，材料無溶血作用。
綜上述，我們通過自乳化法制備了球形度較好的聚氨酯微球，其化學結構及相對分子質量可通過調節反應原料的投料比等方法進行控制，具有高度的可設計性。同時聚氨酯微球的細胞毒性低，細胞能夠較好黏附于材料表面，細胞狀態佳，且具備良好血液相容性，有望用作軟組織缺損的填充材料。在后續研究中，我們將通過動物實驗對聚氨酯微球的體內生物相容性進行評價，并根據組織缺損部位的類型復合功能性生物活性材料，拓寬其可能的應用范圍。
