引用本文： 郭宇鵬, 唐康來, 張吉強, 陳波, 施又興. 不同濃度TGF-β3對體外肌腱干細胞分化的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(5): 620-625. doi: 10.7507/1002-1892.20150133 復制
肌腱病是常見的運動損傷性疾病，主要臨床表現為疼痛和功能障礙，主要病理表現為肌腱細胞壞死、炎癥、骨化、脂肪化等[1]。肌腱病發病機制不清，目前研究認為可能與反復機械負荷導致肌腱反復出現微小損傷有關[2]。自2007年Bi等[3]首次從肌腱中分離出肌腱干細胞（tendon stem cells，TSCs），并證實其具有多向分化潛能以來，已有大量研究證實TSCs是肌腱細胞的前體細胞，也是肌腱細胞的唯一來源，自身分化能力強。之后學者從人和動物的肌腱組織中成功分離TSCs，進一步明確其具有多向分化潛能 [4-7]，為明確肌腱病中出現骨化和脂肪化的發生機制提供了實驗依據。
TGF-β超家族能使正常成纖維細胞的表型發生轉化。機體多種細胞均可分泌非活性狀態的TGF-β，其中間充質起源的細胞主要產生TGF-β3。非活性狀態的TGF-β3可被正在愈合或新生的組織周圍酸性環境活化，進而行使功能。既往研究表明，TGF-β3可對MSCs、胚胎干細胞等細胞分化有不同作用[8-11]；同時，TGF-β的表達量可因機械刺激而變化[12-13]。那么在肌腱微損傷及修復過程中，其對TSCs不同方向的分化是否發揮作用以及發揮什么樣的作用，目前尚未明確。本研究利用體外培養的大鼠跟腱來源TSCs，予以不同濃度TGF-β3處理，檢測不同時間點TSCs分化情況，為明確TGF-β3在肌腱病發生過程中的角色提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM培養基、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶、重組人TGF-β3（R&D Systems公司，美國）；RNAiso Plus、PrimeScript逆轉錄試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（Takara公司，日本）。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；iCycler 熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 TSCs分離及培養
TSCs的分離培養和鑒定參照本課題組既往方法[6-7]。取3周齡SD雄性大鼠2只，體重約50 g（第三軍醫大學實驗動物中心）。CO2處死后無菌條件下取雙側跟腱，剔除腱鞘及腱周結締組織，PBS清洗3次；將肌腱均勻剪碎成1 mm×1 mm大小，加入2 mL消化液（含3 mg/mLⅠ型膠原酶和4 mg/ mL中性蛋白酶），37℃孵箱消化1.5 h，收集細胞懸液，加入含15%FBS的L-DMEM培養基2 mL中止消化，以170×g離心5 min，棄上清。加入含15%FBS的L-DMEM培養基4 mL重懸細胞，按50個/cm2密度接種于25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育，每3天換液1次。原代細胞為P0代，當細胞融合達90%時進行傳代，取P3代用于實驗。經檢測干細胞表面標志物CD90、CD44、Oct-4和誘導成骨、成軟骨、成脂肪分化，鑒定培養細胞為TSCs。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為4組，取P3代TSCs以2×103個/cm2密度接種于12個細胞培養皿中，每組3個培養皿，培養24 h觀察細胞完全貼壁后，分別采用5.0、2.5、1.0、0 ng/mL TGF-β3培養，于1、3、5 d收集細胞進行實時熒光定量PCR檢測。
1.4 實時熒光定量PCR檢測
檢測TSCs成肌腱分化標志性基因Ⅰ型膠原、肌腱蛋白C（tenascin C，TNC）、腱調蛋白（tenomodulin，TNMD）和Scx（scleraxis），成骨分化標志性基因Runt相關轉錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）、ALP，成軟骨分化標志性基因Sox9、Ⅱ型膠原，成脂肪分化標志性基因AP2、過氧化物酶增殖物活化受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）；以GAPDH作為內參。參照PrimeScript逆轉錄試劑盒產品說明書提取細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA。PCR反應條件：95℃預變性8 min；95℃變性10 s、60℃退火20 s，72℃延伸25 s，40個循環。采用2-ΔΔCt分析目的基因相對表達量，所有實驗均重復3次。引物自行設計，由上海英駿生物公司合成，序列見表 1。
表1
實時熒光定量PCR引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time quantitative PCR
1.5 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用多因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 不同濃度TGF-β3對TSCs成肌腱分化的影響
成肌腱分化4個標志基因表達與TGF-β3濃度、處理時間及二者交互作用均有相關性（P＜0.05）。見圖 1。
圖1
實時熒光定量PCR檢測成肌腱分化標志性基因表達 ? Ⅰ型膠原 ? TNC ? TNMD ? Scx? ?圖 2 實時熒光定量PCR檢測成骨分化標志性基因表達 ? Runx2 ? ALP? ?圖 3 實時熒光定量PCR檢測成軟骨分化標志性基因表達 ? Sox9 ? Ⅱ型膠原? ?圖 4 實時熒光定量PCR檢測成脂肪分化標志性基因表達 ? AP2 ?PPARγ
Figure1.
The mRNA expressions of tendogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ? Collagen type Ⅰ ? TNC ? TNMD ? Scx? ? Fig. 2 The mRNA expressions of osteogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ? Runx2 ? ALP? ? Fig. 3 The mRNA expressions of chondrogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ? Sox9 ? Collagen type ⅠI? ? Fig. 4 The mRNA expressions of adipogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ? AP2 ? PPARγ
2.1.1 Ⅰ型膠原
Ⅰ型膠原中TGF-β3濃度與時間存在交互作用（t=12.818，P=0.000）。
培養1 d時，5.0 ng/mL組與0、1.0 ng/mL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。培養3 d 時，0、2.5、5.0 ng/mL組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，1.0、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、2.5 ng/mL組與5.0 ng/mL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）； 2.5 ng/mL組中1、3 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；以上實驗組其余各時間點間比較以及0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.1.2 TNC
TNC中TGF-β3濃度與時間存在交互作用（t=9.154，P=0.000）。
培養1 d時，1.0、2.5 ng/mL組與 5.0 ng/mL組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。培養3 d時，2.5、5.0 ng/mL組與0、1.0 ng/mL組比較以及2.5、5.0 ng/ mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，1.0、2.5、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及2.5、5.0 ng/mL組與1.0 ng/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；2.5、5.0 ng/mL組中各時間點間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；以上實驗組其余各時間點間比較以及0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.1.3 TNMD
TNMD中TGF-β3濃度與時間存在交互作用（t=5.880，P=0.001）。
培養1 d時，0、1.0、2.5 ng/mL組與5.0 ng/ mL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。培養3 d時，2.5、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、2.5 ng/ mL與5.0 ng/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，2.5、5.0 ng/mL組與0、1.0 ng/ mL組比較，以及2.5、5.0 ng/mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中1 d與3、5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；2.5、5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；以上實驗組其余各時間點間比較以及0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.1.4 Scx
Scx中TGF-β3濃度與時間存在交互作用（t=3.817，P=0.008）。
培養1 d時，各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；培養3 d時，2.5、5.0 ng/mL組與0、1.0 ng/ mL組比較，以及2.5、5.0 ng/mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；培養5 d時，0、1.0、5.0 ng/ mL組與2.5 ng/mL組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；2.5 ng/mL組中1、5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；5.0 ng/mL組中1、5 d與3 d比較，差異有統計學意義（P＞0.05）；其余各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.2 不同濃度TGF-β3對TSCs成骨分化的影響
2.2.1 Runx2
TGF-β3低濃度、短時間處理對Runx2表達有抑制作用，其表達量與TGF-β3濃度、時間均相關（P＜0.05），且濃度與時間存在交互作用（t=4.680，P=0.003）。見圖 2 a。
培養1 d時，1.0、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養3 d時，0、1.0 ng/mL組間比較，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，0、1.0、2.5 ng/ mL組與5.0 ng/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）； 2.5 ng/mL組中3、5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其余各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.2.2 ALP
ALP表達量與TGF-β3處理時間相關（P=0.000），與TGF-β3濃度無相關（P=0.176）。TGF-β3濃度與時間存在交互作用（t=5.117，P=0.002）。見圖 2 b。
培養1、3 d時，各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；培養5 d時，2.5、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、5.0 ng/mL組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；1、3 d比較差異無統計學意義（P＞0.05）。0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.3 不同濃度TGF-β3對TSCs成軟骨分化的影響
2.3.1 Sox9
TGF-β3低濃度、短時間處理對Sox9表達有抑制作用，其表達量與TGF-β3濃度、時間均相關（P＜0.05），且濃度與時間存在交互作用（t=3.482，P=0.013）。見圖 3 a。
培養1 d時，1.0、2.5 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及2.5、5.0 ng/mL組與1.0 ng/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養3 d時，1.0、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，0、1.0、2.5 ng/mL組與5.0 ng/ mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL組中1 d與3、5 d比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；3、5 d比較差異無統計學意義（P＞0.05）。0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.3.2 Ⅱ型膠原
Ⅱ型膠原表達量僅與TGF-β3濃度相關（P=0.008），與TGF-β3處理時間或兩者共同作用無相關（P＞0.05）。見圖 3 b。
培養1、3 d時，各組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；培養5 d時，0、5.0 ng/ mL組間以及1.0、2.5 ng/mL組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其余組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 不同濃度TGF-β3對TSCs成脂肪分化的影響
2.4.1 AP2
經TGF-β3高濃度、長時間刺激對AP2表達具有促進作用，其表達量與處理時間相關（P=0.000），未見與濃度顯著相關（P=0.153）；濃度與時間存在交互作用（t=6.857，P=0.000）。見圖 4 a。
培養1、3 d時，各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。培養5 d時，1.0、2.5、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、5.0 ng/mL組與2.5 ng/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其余組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；1、3 d比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.4.2 PPARγ
經TGF-β3低濃度、長時間刺激對PPARγ表達具有抑制作用，其表達量與TGF-β3濃度、處理時間均相關（P＜0.05）。濃度與時間存在交互作用（t=3.036，P=0.024）。見圖 4 b。
培養1、3 d時，1.0、2.5 ng/mL組與0、5.0 ng/mL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，1.0、2.5、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；2.5 ng/mL組中3、5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其余各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
TGF-β超家族是一類結構相關性的生長因子，包括TGF-β、激活素、BMP等。這一家族在胚胎發生和組織自穩態中起著相當廣泛的作用[14-15]，其能調控細胞的生長、黏附、遷移、分化、凋亡等。TGF-β超家族的經典信號轉導途徑為配體與跨膜受體結合，激活下游的SMAD蛋白，直接調控基因轉錄[16]。TGF-β作用的特異性不僅取決于配體與受體的特異性結合，也取決于不同種類受體的特異性結合[17]，從而下游形成不同種類的SMAD復合物，通過各自對DNA不同序列的選擇性結合來調控基因轉錄，最終調節細胞的生理功能[18-20]。除此之外，TGF-β還可激活包括ERK、p38和JNK的分裂素，來激活蛋白激酶MAPKs、PI3K/Akt和小GTP酶信號通路[21-22]。
本研究探討了不同濃度TGF-β3對TSCs分化的影響。結果表明，外源性TGF-β3對細胞分化的影響與刺激濃度、時間均有關，且單純濃度或時間的改變即可導致細胞向不同方向分化：在低濃度、短時間刺激下，TSCs更傾向于向成肌腱方向分化，高濃度、長時間刺激在促進成肌腱分化的同時，啟動了成軟骨、成骨等異常分化途徑。既往研究發現了TGF-β的成肌腱[23]、成軟骨[24]及促進骨基質生長[25]等作用，Maeda 等[13]研究發現TGF-β可激活Scx促進成肌腱分化，但過量TGF-β釋放則會導致肌腱細胞死亡。在胚胎形成期，組織中TGF-β的濃度梯度差決定了細胞分化方向[26]。TGF-β信號的復雜性可能原因在于其信號傳導是一復雜的網絡，研究發現TGF-β的受體與配體結合并非嚴格專一，受體表達不同可導致下游不同的事件[9]，每種TGF-β配體下游所產生的SMAD是特異的，但其DNA結合位點同為富含GTCT的SMAD結合位點[20]，使得TGF-β信號通路可有多種不同功能。TGF-β除了通過SMAD通路傳導以外，另一條常見途徑是ERK通路，這一途徑不但有明顯的信號放大作用[27]，其動力學也與SMAD通路不同，ERK通路啟動更迅速，消退也更快，這一動力學特性可能導致了TGF-β3效應的時間相關性。除此之外，有研究表明TGF-β可通過調控microRNA的合成而調控細胞分化方向[28]。本研究僅觀察了TGF-β3對TSCs分化影響的結果，其分子機制有待于從受體結合層面、細胞內信號轉導層面及轉錄激活層面進一步研究，尋找TGF-β超家族信號網絡中的關鍵性節點。
TGF-β信號的作用十分精密，在胚胎期的輕微改變即可導致嚴重后果[29]。本研究結果也證實了該結論，TGF-β3低濃度、短時間處理可誘導TSCs向成肌腱方向分化，這在體內可以促進肌腱損傷的修復，但高濃度、長時間刺激則在促進TSCs正常分化的同時啟動了異常分化機制。這一現象與肌腱病組織中的細胞增多、鈣化及脂肪化一致，可能是導致肌腱病的原因之一。由于TGF-β信號的多效性和精密性，其可能在肌腱微損傷修復的分化過程中起著“開關”作用，決定細胞的分化命運。TGF-β在肌腱病發生中所扮演的角色，有待進一步動物實驗證實。
肌腱病是常見的運動損傷性疾病，主要臨床表現為疼痛和功能障礙，主要病理表現為肌腱細胞壞死、炎癥、骨化、脂肪化等[1]。肌腱病發病機制不清，目前研究認為可能與反復機械負荷導致肌腱反復出現微小損傷有關[2]。自2007年Bi等[3]首次從肌腱中分離出肌腱干細胞（tendon stem cells，TSCs），并證實其具有多向分化潛能以來，已有大量研究證實TSCs是肌腱細胞的前體細胞，也是肌腱細胞的唯一來源，自身分化能力強。之后學者從人和動物的肌腱組織中成功分離TSCs，進一步明確其具有多向分化潛能 [4-7]，為明確肌腱病中出現骨化和脂肪化的發生機制提供了實驗依據。
TGF-β超家族能使正常成纖維細胞的表型發生轉化。機體多種細胞均可分泌非活性狀態的TGF-β，其中間充質起源的細胞主要產生TGF-β3。非活性狀態的TGF-β3可被正在愈合或新生的組織周圍酸性環境活化，進而行使功能。既往研究表明，TGF-β3可對MSCs、胚胎干細胞等細胞分化有不同作用[8-11]；同時，TGF-β的表達量可因機械刺激而變化[12-13]。那么在肌腱微損傷及修復過程中，其對TSCs不同方向的分化是否發揮作用以及發揮什么樣的作用，目前尚未明確。本研究利用體外培養的大鼠跟腱來源TSCs，予以不同濃度TGF-β3處理，檢測不同時間點TSCs分化情況，為明確TGF-β3在肌腱病發生過程中的角色提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM培養基、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶、重組人TGF-β3（R&D Systems公司，美國）；RNAiso Plus、PrimeScript逆轉錄試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（Takara公司，日本）。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；iCycler 熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 TSCs分離及培養
TSCs的分離培養和鑒定參照本課題組既往方法[6-7]。取3周齡SD雄性大鼠2只，體重約50 g（第三軍醫大學實驗動物中心）。CO2處死后無菌條件下取雙側跟腱，剔除腱鞘及腱周結締組織，PBS清洗3次；將肌腱均勻剪碎成1 mm×1 mm大小，加入2 mL消化液（含3 mg/mLⅠ型膠原酶和4 mg/ mL中性蛋白酶），37℃孵箱消化1.5 h，收集細胞懸液，加入含15%FBS的L-DMEM培養基2 mL中止消化，以170×g離心5 min，棄上清。加入含15%FBS的L-DMEM培養基4 mL重懸細胞，按50個/cm2密度接種于25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育，每3天換液1次。原代細胞為P0代，當細胞融合達90%時進行傳代，取P3代用于實驗。經檢測干細胞表面標志物CD90、CD44、Oct-4和誘導成骨、成軟骨、成脂肪分化，鑒定培養細胞為TSCs。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為4組，取P3代TSCs以2×103個/cm2密度接種于12個細胞培養皿中，每組3個培養皿，培養24 h觀察細胞完全貼壁后，分別采用5.0、2.5、1.0、0 ng/mL TGF-β3培養，于1、3、5 d收集細胞進行實時熒光定量PCR檢測。
1.4 實時熒光定量PCR檢測
檢測TSCs成肌腱分化標志性基因Ⅰ型膠原、肌腱蛋白C（tenascin C，TNC）、腱調蛋白（tenomodulin，TNMD）和Scx（scleraxis），成骨分化標志性基因Runt相關轉錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）、ALP，成軟骨分化標志性基因Sox9、Ⅱ型膠原，成脂肪分化標志性基因AP2、過氧化物酶增殖物活化受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）；以GAPDH作為內參。參照PrimeScript逆轉錄試劑盒產品說明書提取細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA。PCR反應條件：95℃預變性8 min；95℃變性10 s、60℃退火20 s，72℃延伸25 s，40個循環。采用2-ΔΔCt分析目的基因相對表達量，所有實驗均重復3次。引物自行設計，由上海英駿生物公司合成，序列見表 1。
表1
實時熒光定量PCR引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time quantitative PCR
1.5 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用多因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 不同濃度TGF-β3對TSCs成肌腱分化的影響
成肌腱分化4個標志基因表達與TGF-β3濃度、處理時間及二者交互作用均有相關性（P＜0.05）。見圖 1。
圖1
實時熒光定量PCR檢測成肌腱分化標志性基因表達 ? Ⅰ型膠原 ? TNC ? TNMD ? Scx? ?圖 2 實時熒光定量PCR檢測成骨分化標志性基因表達 ? Runx2 ? ALP? ?圖 3 實時熒光定量PCR檢測成軟骨分化標志性基因表達 ? Sox9 ? Ⅱ型膠原? ?圖 4 實時熒光定量PCR檢測成脂肪分化標志性基因表達 ? AP2 ?PPARγ
Figure1.
The mRNA expressions of tendogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ? Collagen type Ⅰ ? TNC ? TNMD ? Scx? ? Fig. 2 The mRNA expressions of osteogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ? Runx2 ? ALP? ? Fig. 3 The mRNA expressions of chondrogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ? Sox9 ? Collagen type ⅠI? ? Fig. 4 The mRNA expressions of adipogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ? AP2 ? PPARγ
2.1.1 Ⅰ型膠原
Ⅰ型膠原中TGF-β3濃度與時間存在交互作用（t=12.818，P=0.000）。
培養1 d時，5.0 ng/mL組與0、1.0 ng/mL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。培養3 d 時，0、2.5、5.0 ng/mL組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，1.0、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、2.5 ng/mL組與5.0 ng/mL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）； 2.5 ng/mL組中1、3 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；以上實驗組其余各時間點間比較以及0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.1.2 TNC
TNC中TGF-β3濃度與時間存在交互作用（t=9.154，P=0.000）。
培養1 d時，1.0、2.5 ng/mL組與 5.0 ng/mL組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。培養3 d時，2.5、5.0 ng/mL組與0、1.0 ng/mL組比較以及2.5、5.0 ng/ mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，1.0、2.5、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及2.5、5.0 ng/mL組與1.0 ng/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；2.5、5.0 ng/mL組中各時間點間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；以上實驗組其余各時間點間比較以及0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.1.3 TNMD
TNMD中TGF-β3濃度與時間存在交互作用（t=5.880，P=0.001）。
培養1 d時，0、1.0、2.5 ng/mL組與5.0 ng/ mL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。培養3 d時，2.5、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、2.5 ng/ mL與5.0 ng/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，2.5、5.0 ng/mL組與0、1.0 ng/ mL組比較，以及2.5、5.0 ng/mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中1 d與3、5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；2.5、5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；以上實驗組其余各時間點間比較以及0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.1.4 Scx
Scx中TGF-β3濃度與時間存在交互作用（t=3.817，P=0.008）。
培養1 d時，各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；培養3 d時，2.5、5.0 ng/mL組與0、1.0 ng/ mL組比較，以及2.5、5.0 ng/mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；培養5 d時，0、1.0、5.0 ng/ mL組與2.5 ng/mL組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；2.5 ng/mL組中1、5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；5.0 ng/mL組中1、5 d與3 d比較，差異有統計學意義（P＞0.05）；其余各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.2 不同濃度TGF-β3對TSCs成骨分化的影響
2.2.1 Runx2
TGF-β3低濃度、短時間處理對Runx2表達有抑制作用，其表達量與TGF-β3濃度、時間均相關（P＜0.05），且濃度與時間存在交互作用（t=4.680，P=0.003）。見圖 2 a。
培養1 d時，1.0、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養3 d時，0、1.0 ng/mL組間比較，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，0、1.0、2.5 ng/ mL組與5.0 ng/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）； 2.5 ng/mL組中3、5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其余各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.2.2 ALP
ALP表達量與TGF-β3處理時間相關（P=0.000），與TGF-β3濃度無相關（P=0.176）。TGF-β3濃度與時間存在交互作用（t=5.117，P=0.002）。見圖 2 b。
培養1、3 d時，各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；培養5 d時，2.5、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、5.0 ng/mL組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；1、3 d比較差異無統計學意義（P＞0.05）。0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.3 不同濃度TGF-β3對TSCs成軟骨分化的影響
2.3.1 Sox9
TGF-β3低濃度、短時間處理對Sox9表達有抑制作用，其表達量與TGF-β3濃度、時間均相關（P＜0.05），且濃度與時間存在交互作用（t=3.482，P=0.013）。見圖 3 a。
培養1 d時，1.0、2.5 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及2.5、5.0 ng/mL組與1.0 ng/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養3 d時，1.0、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，0、1.0、2.5 ng/mL組與5.0 ng/ mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL組中1 d與3、5 d比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；3、5 d比較差異無統計學意義（P＞0.05）。0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.3.2 Ⅱ型膠原
Ⅱ型膠原表達量僅與TGF-β3濃度相關（P=0.008），與TGF-β3處理時間或兩者共同作用無相關（P＞0.05）。見圖 3 b。
培養1、3 d時，各組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；培養5 d時，0、5.0 ng/ mL組間以及1.0、2.5 ng/mL組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其余組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 不同濃度TGF-β3對TSCs成脂肪分化的影響
2.4.1 AP2
經TGF-β3高濃度、長時間刺激對AP2表達具有促進作用，其表達量與處理時間相關（P=0.000），未見與濃度顯著相關（P=0.153）；濃度與時間存在交互作用（t=6.857，P=0.000）。見圖 4 a。
培養1、3 d時，各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。培養5 d時，1.0、2.5、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，以及1.0、5.0 ng/mL組與2.5 ng/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其余組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；1、3 d比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。0 ng/mL組各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.4.2 PPARγ
經TGF-β3低濃度、長時間刺激對PPARγ表達具有抑制作用，其表達量與TGF-β3濃度、處理時間均相關（P＜0.05）。濃度與時間存在交互作用（t=3.036，P=0.024）。見圖 4 b。
培養1、3 d時，1.0、2.5 ng/mL組與0、5.0 ng/mL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。培養5 d時，1.0、2.5、5.0 ng/mL組與0 ng/mL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。各時間點其余組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL組中各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；2.5 ng/mL組中3、5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；5.0 ng/mL組中1、3 d與5 d比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其余各時間點間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
TGF-β超家族是一類結構相關性的生長因子，包括TGF-β、激活素、BMP等。這一家族在胚胎發生和組織自穩態中起著相當廣泛的作用[14-15]，其能調控細胞的生長、黏附、遷移、分化、凋亡等。TGF-β超家族的經典信號轉導途徑為配體與跨膜受體結合，激活下游的SMAD蛋白，直接調控基因轉錄[16]。TGF-β作用的特異性不僅取決于配體與受體的特異性結合，也取決于不同種類受體的特異性結合[17]，從而下游形成不同種類的SMAD復合物，通過各自對DNA不同序列的選擇性結合來調控基因轉錄，最終調節細胞的生理功能[18-20]。除此之外，TGF-β還可激活包括ERK、p38和JNK的分裂素，來激活蛋白激酶MAPKs、PI3K/Akt和小GTP酶信號通路[21-22]。
本研究探討了不同濃度TGF-β3對TSCs分化的影響。結果表明，外源性TGF-β3對細胞分化的影響與刺激濃度、時間均有關，且單純濃度或時間的改變即可導致細胞向不同方向分化：在低濃度、短時間刺激下，TSCs更傾向于向成肌腱方向分化，高濃度、長時間刺激在促進成肌腱分化的同時，啟動了成軟骨、成骨等異常分化途徑。既往研究發現了TGF-β的成肌腱[23]、成軟骨[24]及促進骨基質生長[25]等作用，Maeda 等[13]研究發現TGF-β可激活Scx促進成肌腱分化，但過量TGF-β釋放則會導致肌腱細胞死亡。在胚胎形成期，組織中TGF-β的濃度梯度差決定了細胞分化方向[26]。TGF-β信號的復雜性可能原因在于其信號傳導是一復雜的網絡，研究發現TGF-β的受體與配體結合并非嚴格專一，受體表達不同可導致下游不同的事件[9]，每種TGF-β配體下游所產生的SMAD是特異的，但其DNA結合位點同為富含GTCT的SMAD結合位點[20]，使得TGF-β信號通路可有多種不同功能。TGF-β除了通過SMAD通路傳導以外，另一條常見途徑是ERK通路，這一途徑不但有明顯的信號放大作用[27]，其動力學也與SMAD通路不同，ERK通路啟動更迅速，消退也更快，這一動力學特性可能導致了TGF-β3效應的時間相關性。除此之外，有研究表明TGF-β可通過調控microRNA的合成而調控細胞分化方向[28]。本研究僅觀察了TGF-β3對TSCs分化影響的結果，其分子機制有待于從受體結合層面、細胞內信號轉導層面及轉錄激活層面進一步研究，尋找TGF-β超家族信號網絡中的關鍵性節點。
TGF-β信號的作用十分精密，在胚胎期的輕微改變即可導致嚴重后果[29]。本研究結果也證實了該結論，TGF-β3低濃度、短時間處理可誘導TSCs向成肌腱方向分化，這在體內可以促進肌腱損傷的修復，但高濃度、長時間刺激則在促進TSCs正常分化的同時啟動了異常分化機制。這一現象與肌腱病組織中的細胞增多、鈣化及脂肪化一致，可能是導致肌腱病的原因之一。由于TGF-β信號的多效性和精密性，其可能在肌腱微損傷修復的分化過程中起著“開關”作用，決定細胞的分化命運。TGF-β在肌腱病發生中所扮演的角色，有待進一步動物實驗證實。
