引用本文： 魏長征, 呂黃紅, 張健, 朱彬, 蔣麗霞. 交聯透明質酸鈉凝膠中交聯劑殘留量的檢測方法研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(5): 615-619. doi: 10.7507/1002-1892.20150132 復制
透明質酸鈉是人和動物皮膚、玻璃體、關節潤滑液和軟骨組織的重要成分，它由(1-β-4) D-葡糖醛酸和(1-β-3) N-乙酰基-D-氨基葡糖雙糖單位重復連接而成，廣泛用于修復手術、眼部手術或作為美容產品填充皺紋[1-5]。透明質酸鈉具有良好的理化性能及生物相容性[6]。然而，它在體內因受到透明質酸酶的酶解作用而降解迅速，存留時間較短，需重復注射才能達到療效。交聯透明質酸鈉是透明質酸鈉經交聯劑交聯修飾得到的高分子凝膠，可彌補透明質酸鈉存留時間短等缺點，同時仍具有良好的生物相容性及效果[7-8]。
經過近幾年的快速發展及市場整合，交聯透明質酸鈉凝膠技術已趨于平穩和雷同，市場中的產品競爭也異常激烈，僅在中國市場就有4～5家產品并存。從交聯技術層面來講，該技術類型主要包括兩大類，即二乙烯基砜 [9-11]和1，4-丁二醇二縮水甘油醚（1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE）[12-13]作為交聯劑，其中BDDE作為交聯劑的產品占據絕大部分市場。眾所周知，BDDE具有生物毒性或潛在的致癌性[14]，交聯透明質酸鈉凝膠為長期植入體內的三類醫療器械，雖然各生產廠家采取了嚴格的控制措施確保產品安全性，但臨床尚缺乏大樣本、長期跟蹤數據來佐證該類產品的生物安全性；同時由于市場長效需求的趨勢，生產廠家都在追求更長的體內殘留時間，這勢必提高產品的交聯/修飾程度，加大交聯劑的引入量，更加劇了人們對該類產品安全性的擔憂。
在踐行轉化醫學中，對擬轉化產品的質量控制是保證臨床應用安全性的重要措施。鑒于上述現狀，有必要對BDDE交聯透明質酸鈉凝膠中的交聯劑殘留量進行嚴格監控。BDDE的檢測方法主要包括氣相色譜法和熒光檢測法[15-17]，因BDDE的熱不穩定性導致氣相色譜法檢測結果偏差大，所以熒光檢測法成為主要檢測法，但目前尚缺乏關于該方法的系統研究。本研究旨在探討一種新的BDDE熒光檢測方法，同時按照方法學驗證的相關標準評價該方法科學性，為企業和監管部門提供一種科學的監控手段，保障交聯透明質酸鈉凝膠臨床使用的安全性。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑及儀器
BDDE（含量95.0%）、苯乙酮（含量99.0%）、尼克酰胺（含量99.5%）、透明質酸酶（400～1 000 U/ mg）（Sigma公司，美國）；PBS緩沖液、氫氧化鉀（含量 ＞85%）、甲酸（含量98.0%）、無水乙醇（含量 ＞99.7%），均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；透明質酸鈉（山東華熙福瑞達生物醫藥有限公司）；注射用交聯透明質酸鈉凝膠（上海其勝生物制劑有限公司）。
CaryEclipse熒光分光光度計（VARIAN公司，美國）；Agilent 7890A氣相色譜儀、電子天平（Mettler-Toledo公司，瑞士）；恒溫水浴鍋、VXH漩渦混合器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。
1.2 傳統熒光檢測法測定BDDE殘留量
1.2.1 繪制BDDE標準曲線
稱取0.08 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS緩沖液混勻，配置成80 μg/g儲備液，然后梯度稀釋，配制濃度分別為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0 μg/g的BDDE標準溶液。取各濃度標準溶液0.2 mL，加入0.1 mL濃度為125 mmol/L的尼克酰胺溶液，混勻，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氫氧化鉀溶液各1 mL，混勻后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷卻；最后用熒光分光光度計測定其熒光值，激發和發射波長分別為380 nm和435 nm，繪制BDDE標準曲線。
1.2.2 樣品中BDDE殘留量的檢測
使用透明質酸酶降解交聯透明質酸鈉凝膠注射劑制備降解液。具體操作如下：取1 g交聯凝膠，加入1 mL 3 mg/ mL透明質酸酶PBS溶液，混勻，于37℃下酶降24 h即得降解液。后取降解液0.2 mL，加入0.1 mL 濃度為125 mmol/L的尼克酰胺溶液，混勻，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氫氧化鉀溶液各1 mL，混勻后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷卻，最后用熒光分光光度計測定其熒光值，激發和發射波長分別為380 nm和435 nm，所得熒光值代入1.2.1中標準曲線即得BDDE濃度。
1.3 BDDE熱穩定性研究
1.3.1 氣相色譜法
稱取0.02 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS緩沖液混勻，配置成濃度為20 μg/g的BDDE標準溶液。分別取2份樣品，一份不作任何處理，另一份以121℃滅菌15 min。將2 份樣品通過氣相色譜儀進行峰型測定比較。
1.3.2 熒光檢測法
分別稱取0.01、0.02、0.03 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS緩沖液混勻，配制成濃度為10、20、30 μg/g的BDDE儲備液。每個濃度分別取3份，其中一份不作處理，另兩份分別以90℃滅菌30 min、121℃滅菌20 min，按照1.2.2中方法檢測BDDE含量。
1.4 熒光法測定BDDE殘留量的影響因素分析
1.4.1 樣品制備過程中透明質酸酶的影響
分別配置濃度為1、3 mg/mL的透明質酸酶PBS溶液和凝膠濃度為2%（w/w）的交聯透明質酸鈉降解液（酶濃度為3 mg/mL），按照1.2.2中方法檢測BDDE含量。
1.4.2 BDDE儲備液穩定性的影響
稱取0.032 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS緩沖液混勻，配制濃度為32 μg/g的BDDE儲備液，4℃放置1、7、10 d后，分別取樣梯度稀釋至8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/g的BDDE標準溶液，按照1.2.1中方法比較1、7、10 d標準溶液的熒光值。
1.5 熒光法改良
參照1.2.1方法配制濃度分別為16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0 μg/g的BDDE標準溶液。取各濃度標準溶液0.1 mL，加入2%降解液（透明質酸酶濃度為3 mg/mL）0.1 mL，即對倍稀釋標準溶液，使其濃度達到8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/g；再加入0.1 mL 125 mmol/L尼克酰胺溶液，混勻，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氫氧化鉀溶液各1 mL，混勻后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷卻，最后用熒光分光光度計測定其熒光值，激發和發射波長分別為380 nm和435 nm。另參照1.2.2中方法檢測酶解后交聯透明質酸鈉凝膠樣品的BDDE殘留量。
1.6 統計學方法
實驗均重復3次。采用Origin 9統計軟件進行分析，同時對數據進行線性擬合并考察線性相關系數。數據以均數±標準差表示，組間比較使用Min it ab軟件進行方差分析，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 傳統熒光檢測法測定BDDE殘留量
BDDE標準溶液熒光值測定結果見圖 1。對其進行線性擬合可得方程式為y=14.102x+1.103，R2=0.999 8。相關分析顯示，BDDE殘留量與熒光值呈較好線性相關性。
圖1
傳統熒光檢測法得BDDE標準溶液濃度與熒光值的線性相關圖? ?圖 2 濃度為20 μg/g的BDDE標準液滅菌前后氣相色譜響應 ? 滅菌前 ? 滅菌后? ?圖 3 熒光法檢測1、7、10 d各BDDE儲備液熒光值與濃度的線性關系? ?圖 4 添加透明質酸酶液前后熒光值與BDDE濃度的線性關系
Figure1.
The linear relationship between the content of BDDE and fluorescence value by the traditional fluorescence spectrophotometry method? ? Fig. 2 The gas chromatographic response for BDDE before and after sterilization (20 μg/g) ? Before sterilization ? After sterilization? ? Fig. 3 The linear relationship between the fluorescence value and standard curve of BDDE at different time by fluorescence spectrophotometry? ? Fig. 4 The linear relationship between the content of BDDE and fluorescence value before and after the adding of hyaluronidase
2.2 BDDE熱穩定性研究
氣相色譜法測定顯示，濃度為20 μg/g的BDDE標準液在滅菌前后峰面積發生變化，即滅菌后含量急劇下降。表明BDDE具有弱熱穩定性，高溫下發生降解。見圖 2。
熒光法檢測示，未受高溫滅菌處理的樣品BDDE含量與起始定量配置的BDDE含量相似，表明該方法在檢測過程中不對BDDE造成分解破壞。經過不同高溫處理后，BDDE均發生不同程度分解，滅菌前后BDDE含量比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
熒光法檢測各濃度BDDE儲備液滅菌前后BDDE含量（n=3，2.3 熒光法測量影響因素分析
2.3.1 透明質酸酶的影響
濃度為1、3 mg/mL的透明質酸酶和2%降解液的熒光值分別為3.923±0.431、9.423±0.971、9.564±0.864，顯示透明質酸酶會產生相應熒光值。根據2.1中BDDE標準曲線，可得上述熒光值分別對應的BDDE濃度為（0.20±0.03）、（0.59±0.07）、（0.60±0.06）μg/g。
2.3.2 BDDE儲備液穩定性的影響
同一濃度儲備液放置不同時間后熒光值發生顯著變化，不同時間點間比較差異有統計學意義（P＜0.05）；其中濃度為8.0 μg/g時熒光值下降最顯著。對BDDE濃度與對應熒光值進行線性擬合可得方程式：1 d后BDDE儲備液的線性方程式為y=13.442x－0.298，3 d為y=9.646x+0.16，7 d為y=7.564x+0.071；可見其線性關系也發生變化，直線斜率從初始狀態下的14.102下降至7 d后的7.564。表明BDDE的不穩定性也是影響熒光法檢測結果的重要因素。見表 2、圖 3。
表2
熒光法檢測不同時間點各濃度BDDE標準溶液的熒光值比較（n=3，2.4 熒光法的改良
檢測顯示，添加酶液前后的標準曲線大體一致，均保持線性相關，說明添加與檢測樣品酶濃度相同的透明質酸酶液后，不影響BDDE含量與熒光值的線性關系。改良后的BDDE標準曲線擬合方程式為：y=14.027x+7.062，R2=0.999 9。此外，改良后（即在BDDE標準溶液中添加了樣品相應濃度的酶溶液后），檢測樣品的熒光值對應的BDDE含量更低，這是因為此時扣除了樣品中透明質酸酶對檢測結果的影響，得到的數據更真實。見圖 4。
3 討論
二乙烯基砜 [18-20]和BDDE[21]被廣泛應用于高分子的化學交聯反應中，特別是透明質酸鈉凝膠，它們利用分子中的雙官能團將透明質酸鈉分子相互連接形成立體的三維網狀結構，提高了透明質酸鈉凝膠的體內殘留時間。因分子結構的不同，采用兩種交聯劑制備的凝膠性質也發生較大變化以適應不同的臨床需求，其中BDDE交聯產品逐漸成為市場的主流。2003年瑞典Q-Med公司生產的瑞藍（Restylane）玻尿酸產品在國際上首次被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準，隨后2008年在中國獲得國家食品藥品監督管理局（SFDA）批準，進而大大帶動了我國交聯透明質酸鈉凝膠產品的開發，特別是BDDE交聯產品的開發。即將于2015年7月1日實施的YY/T0962-2014（整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠）是目前國內唯一專門針對交聯透明質酸鈉凝膠的行業標準，在這項標準中提供了兩種BDDE殘留量的檢測方法，即氣相色譜法和熒光分光光度法。本文通過系列研究發現這兩種方法在BDDE殘留量的檢測方面均存在一定局限性，為了科學監控BDDE交聯產品的安全性，急需對現有的檢測方法加以研究，為企業質量內控提供技術手段。
Q-Med公司注冊提供的檢測方法是采用氣相色譜法測定BDDE殘留量，即與2 μg/g的標準液進行氣相色譜比對，進而判定殘留量＜2 μg/g，因此該方法為半定量，存在較大誤差。本研究通過氣相色譜法檢測BDDE殘留量，檢測結果存在較大誤差，BDDE發生了分解，其主要原因是在檢測過程中有升溫程序，破壞了BDDE結構，進而對檢測結果造成影響。造成這種結果的分子結構基礎是BDDE結構中含有2個三元環，每個三元環剛性較大，極易發生開環，水、醇等物質發生加成反應，生成相應的醇或醚。熒光法檢測結果顯示，經過不同溫度處理的BDDE樣品含量發生明顯偏差，表明BDDE的熱穩定性較差，會對檢測造成極大誤差，這也驗證了上述論述。
相比氣相色譜法，熒光法則具有很強特異性，即尼克酰胺特異性地與環氧化合物中的三元環發生反應生成具有熒光吸收的有色物質，而該物質顏色的深淺與環氧化合物的含量呈線性關系，因此有效規避了檢測過程中高溫對殘留量檢測的影響，能更準確地測定成品中的殘留量，更好控制產品的生物安全性。
由于市售的BDDE交聯透明質酸鈉凝膠均為顆粒化，殘留的BDDE會相應地包裹在顆粒中，對殘留量的測定產生較大影響，因此在采用熒光法測定時首先需要對顆粒化產品進行酶解。而透明質酸酶是一種高分子蛋白質，不可避免地會引入一定環狀結構，對檢測造成潛在影響。透明質酸酶本身存在一定熒光值，由于現有的產品標準中BDDE的限定值多為2 μg/g，3 mg/mL的透明質酸酶折合BDDE的殘留量為0.6 μg/g，極大地影響BDDE殘留量的檢測，因此在檢驗方法的制定中必須考慮透明質酸酶的影響；同時BDDE本身又具有熱不穩定性，且儲備液放置時間過長其熒光值也會發生較大改變，因此我們對熒光法進行了改良，即將透明質酸酶添加到標準曲線中，進而排除了透明質酸酶對檢測的影響；同時還考察了儲備液不同放置時間其熒光值的變化，進而確定在測定BDDE殘留量時應用的儲備液采用臨用新配，排除了儲備液對檢測的影響。
如今市面上BDDE交聯透明質酸鈉凝膠均為無菌注射產品，滅菌方式均為高壓蒸汽滅菌，該制備工藝造成了成品中的BDDE殘留量下降，因此采用上述經改進的熒光分光光度法進行BDDE交聯劑殘留量檢測，其得到的結果只能表示高溫滅菌后產品的BDDE殘留量。這是因為BDDE具有熱不穩定性，故產品自生產制造完成后，凝膠殘留的BDDE就會發生一系列分解變化，其含量也會逐漸下降，分解后的產物毒性及其安全性還需作進一步研究，以確保產品在整個壽命周期內的安全性。對于生產企業也要提出新的命題，即產品滅菌前與滅菌后BDDE殘留量的變化及其分解產物，以新生產未滅菌產品中的殘留量作為參考值來進行系統性的安全性研究。
透明質酸鈉是人和動物皮膚、玻璃體、關節潤滑液和軟骨組織的重要成分，它由(1-β-4) D-葡糖醛酸和(1-β-3) N-乙酰基-D-氨基葡糖雙糖單位重復連接而成，廣泛用于修復手術、眼部手術或作為美容產品填充皺紋[1-5]。透明質酸鈉具有良好的理化性能及生物相容性[6]。然而，它在體內因受到透明質酸酶的酶解作用而降解迅速，存留時間較短，需重復注射才能達到療效。交聯透明質酸鈉是透明質酸鈉經交聯劑交聯修飾得到的高分子凝膠，可彌補透明質酸鈉存留時間短等缺點，同時仍具有良好的生物相容性及效果[7-8]。
經過近幾年的快速發展及市場整合，交聯透明質酸鈉凝膠技術已趨于平穩和雷同，市場中的產品競爭也異常激烈，僅在中國市場就有4～5家產品并存。從交聯技術層面來講，該技術類型主要包括兩大類，即二乙烯基砜 [9-11]和1，4-丁二醇二縮水甘油醚（1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE）[12-13]作為交聯劑，其中BDDE作為交聯劑的產品占據絕大部分市場。眾所周知，BDDE具有生物毒性或潛在的致癌性[14]，交聯透明質酸鈉凝膠為長期植入體內的三類醫療器械，雖然各生產廠家采取了嚴格的控制措施確保產品安全性，但臨床尚缺乏大樣本、長期跟蹤數據來佐證該類產品的生物安全性；同時由于市場長效需求的趨勢，生產廠家都在追求更長的體內殘留時間，這勢必提高產品的交聯/修飾程度，加大交聯劑的引入量，更加劇了人們對該類產品安全性的擔憂。
在踐行轉化醫學中，對擬轉化產品的質量控制是保證臨床應用安全性的重要措施。鑒于上述現狀，有必要對BDDE交聯透明質酸鈉凝膠中的交聯劑殘留量進行嚴格監控。BDDE的檢測方法主要包括氣相色譜法和熒光檢測法[15-17]，因BDDE的熱不穩定性導致氣相色譜法檢測結果偏差大，所以熒光檢測法成為主要檢測法，但目前尚缺乏關于該方法的系統研究。本研究旨在探討一種新的BDDE熒光檢測方法，同時按照方法學驗證的相關標準評價該方法科學性，為企業和監管部門提供一種科學的監控手段，保障交聯透明質酸鈉凝膠臨床使用的安全性。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑及儀器
BDDE（含量95.0%）、苯乙酮（含量99.0%）、尼克酰胺（含量99.5%）、透明質酸酶（400～1 000 U/ mg）（Sigma公司，美國）；PBS緩沖液、氫氧化鉀（含量 ＞85%）、甲酸（含量98.0%）、無水乙醇（含量 ＞99.7%），均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；透明質酸鈉（山東華熙福瑞達生物醫藥有限公司）；注射用交聯透明質酸鈉凝膠（上海其勝生物制劑有限公司）。
CaryEclipse熒光分光光度計（VARIAN公司，美國）；Agilent 7890A氣相色譜儀、電子天平（Mettler-Toledo公司，瑞士）；恒溫水浴鍋、VXH漩渦混合器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。
1.2 傳統熒光檢測法測定BDDE殘留量
1.2.1 繪制BDDE標準曲線
稱取0.08 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS緩沖液混勻，配置成80 μg/g儲備液，然后梯度稀釋，配制濃度分別為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0 μg/g的BDDE標準溶液。取各濃度標準溶液0.2 mL，加入0.1 mL濃度為125 mmol/L的尼克酰胺溶液，混勻，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氫氧化鉀溶液各1 mL，混勻后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷卻；最后用熒光分光光度計測定其熒光值，激發和發射波長分別為380 nm和435 nm，繪制BDDE標準曲線。
1.2.2 樣品中BDDE殘留量的檢測
使用透明質酸酶降解交聯透明質酸鈉凝膠注射劑制備降解液。具體操作如下：取1 g交聯凝膠，加入1 mL 3 mg/ mL透明質酸酶PBS溶液，混勻，于37℃下酶降24 h即得降解液。后取降解液0.2 mL，加入0.1 mL 濃度為125 mmol/L的尼克酰胺溶液，混勻，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氫氧化鉀溶液各1 mL，混勻后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷卻，最后用熒光分光光度計測定其熒光值，激發和發射波長分別為380 nm和435 nm，所得熒光值代入1.2.1中標準曲線即得BDDE濃度。
1.3 BDDE熱穩定性研究
1.3.1 氣相色譜法
稱取0.02 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS緩沖液混勻，配置成濃度為20 μg/g的BDDE標準溶液。分別取2份樣品，一份不作任何處理，另一份以121℃滅菌15 min。將2 份樣品通過氣相色譜儀進行峰型測定比較。
1.3.2 熒光檢測法
分別稱取0.01、0.02、0.03 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS緩沖液混勻，配制成濃度為10、20、30 μg/g的BDDE儲備液。每個濃度分別取3份，其中一份不作處理，另兩份分別以90℃滅菌30 min、121℃滅菌20 min，按照1.2.2中方法檢測BDDE含量。
1.4 熒光法測定BDDE殘留量的影響因素分析
1.4.1 樣品制備過程中透明質酸酶的影響
分別配置濃度為1、3 mg/mL的透明質酸酶PBS溶液和凝膠濃度為2%（w/w）的交聯透明質酸鈉降解液（酶濃度為3 mg/mL），按照1.2.2中方法檢測BDDE含量。
1.4.2 BDDE儲備液穩定性的影響
稱取0.032 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS緩沖液混勻，配制濃度為32 μg/g的BDDE儲備液，4℃放置1、7、10 d后，分別取樣梯度稀釋至8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/g的BDDE標準溶液，按照1.2.1中方法比較1、7、10 d標準溶液的熒光值。
1.5 熒光法改良
參照1.2.1方法配制濃度分別為16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0 μg/g的BDDE標準溶液。取各濃度標準溶液0.1 mL，加入2%降解液（透明質酸酶濃度為3 mg/mL）0.1 mL，即對倍稀釋標準溶液，使其濃度達到8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/g；再加入0.1 mL 125 mmol/L尼克酰胺溶液，混勻，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氫氧化鉀溶液各1 mL，混勻后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷卻，最后用熒光分光光度計測定其熒光值，激發和發射波長分別為380 nm和435 nm。另參照1.2.2中方法檢測酶解后交聯透明質酸鈉凝膠樣品的BDDE殘留量。
1.6 統計學方法
實驗均重復3次。采用Origin 9統計軟件進行分析，同時對數據進行線性擬合并考察線性相關系數。數據以均數±標準差表示，組間比較使用Min it ab軟件進行方差分析，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 傳統熒光檢測法測定BDDE殘留量
BDDE標準溶液熒光值測定結果見圖 1。對其進行線性擬合可得方程式為y=14.102x+1.103，R2=0.999 8。相關分析顯示，BDDE殘留量與熒光值呈較好線性相關性。
圖1
傳統熒光檢測法得BDDE標準溶液濃度與熒光值的線性相關圖? ?圖 2 濃度為20 μg/g的BDDE標準液滅菌前后氣相色譜響應 ? 滅菌前 ? 滅菌后? ?圖 3 熒光法檢測1、7、10 d各BDDE儲備液熒光值與濃度的線性關系? ?圖 4 添加透明質酸酶液前后熒光值與BDDE濃度的線性關系
Figure1.
The linear relationship between the content of BDDE and fluorescence value by the traditional fluorescence spectrophotometry method? ? Fig. 2 The gas chromatographic response for BDDE before and after sterilization (20 μg/g) ? Before sterilization ? After sterilization? ? Fig. 3 The linear relationship between the fluorescence value and standard curve of BDDE at different time by fluorescence spectrophotometry? ? Fig. 4 The linear relationship between the content of BDDE and fluorescence value before and after the adding of hyaluronidase
2.2 BDDE熱穩定性研究
氣相色譜法測定顯示，濃度為20 μg/g的BDDE標準液在滅菌前后峰面積發生變化，即滅菌后含量急劇下降。表明BDDE具有弱熱穩定性，高溫下發生降解。見圖 2。
熒光法檢測示，未受高溫滅菌處理的樣品BDDE含量與起始定量配置的BDDE含量相似，表明該方法在檢測過程中不對BDDE造成分解破壞。經過不同高溫處理后，BDDE均發生不同程度分解，滅菌前后BDDE含量比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
熒光法檢測各濃度BDDE儲備液滅菌前后BDDE含量（n=3，2.3 熒光法測量影響因素分析
2.3.1 透明質酸酶的影響
濃度為1、3 mg/mL的透明質酸酶和2%降解液的熒光值分別為3.923±0.431、9.423±0.971、9.564±0.864，顯示透明質酸酶會產生相應熒光值。根據2.1中BDDE標準曲線，可得上述熒光值分別對應的BDDE濃度為（0.20±0.03）、（0.59±0.07）、（0.60±0.06）μg/g。
2.3.2 BDDE儲備液穩定性的影響
同一濃度儲備液放置不同時間后熒光值發生顯著變化，不同時間點間比較差異有統計學意義（P＜0.05）；其中濃度為8.0 μg/g時熒光值下降最顯著。對BDDE濃度與對應熒光值進行線性擬合可得方程式：1 d后BDDE儲備液的線性方程式為y=13.442x－0.298，3 d為y=9.646x+0.16，7 d為y=7.564x+0.071；可見其線性關系也發生變化，直線斜率從初始狀態下的14.102下降至7 d后的7.564。表明BDDE的不穩定性也是影響熒光法檢測結果的重要因素。見表 2、圖 3。
表2
熒光法檢測不同時間點各濃度BDDE標準溶液的熒光值比較（n=3，2.4 熒光法的改良
檢測顯示，添加酶液前后的標準曲線大體一致，均保持線性相關，說明添加與檢測樣品酶濃度相同的透明質酸酶液后，不影響BDDE含量與熒光值的線性關系。改良后的BDDE標準曲線擬合方程式為：y=14.027x+7.062，R2=0.999 9。此外，改良后（即在BDDE標準溶液中添加了樣品相應濃度的酶溶液后），檢測樣品的熒光值對應的BDDE含量更低，這是因為此時扣除了樣品中透明質酸酶對檢測結果的影響，得到的數據更真實。見圖 4。
3 討論
二乙烯基砜 [18-20]和BDDE[21]被廣泛應用于高分子的化學交聯反應中，特別是透明質酸鈉凝膠，它們利用分子中的雙官能團將透明質酸鈉分子相互連接形成立體的三維網狀結構，提高了透明質酸鈉凝膠的體內殘留時間。因分子結構的不同，采用兩種交聯劑制備的凝膠性質也發生較大變化以適應不同的臨床需求，其中BDDE交聯產品逐漸成為市場的主流。2003年瑞典Q-Med公司生產的瑞藍（Restylane）玻尿酸產品在國際上首次被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準，隨后2008年在中國獲得國家食品藥品監督管理局（SFDA）批準，進而大大帶動了我國交聯透明質酸鈉凝膠產品的開發，特別是BDDE交聯產品的開發。即將于2015年7月1日實施的YY/T0962-2014（整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠）是目前國內唯一專門針對交聯透明質酸鈉凝膠的行業標準，在這項標準中提供了兩種BDDE殘留量的檢測方法，即氣相色譜法和熒光分光光度法。本文通過系列研究發現這兩種方法在BDDE殘留量的檢測方面均存在一定局限性，為了科學監控BDDE交聯產品的安全性，急需對現有的檢測方法加以研究，為企業質量內控提供技術手段。
Q-Med公司注冊提供的檢測方法是采用氣相色譜法測定BDDE殘留量，即與2 μg/g的標準液進行氣相色譜比對，進而判定殘留量＜2 μg/g，因此該方法為半定量，存在較大誤差。本研究通過氣相色譜法檢測BDDE殘留量，檢測結果存在較大誤差，BDDE發生了分解，其主要原因是在檢測過程中有升溫程序，破壞了BDDE結構，進而對檢測結果造成影響。造成這種結果的分子結構基礎是BDDE結構中含有2個三元環，每個三元環剛性較大，極易發生開環，水、醇等物質發生加成反應，生成相應的醇或醚。熒光法檢測結果顯示，經過不同溫度處理的BDDE樣品含量發生明顯偏差，表明BDDE的熱穩定性較差，會對檢測造成極大誤差，這也驗證了上述論述。
相比氣相色譜法，熒光法則具有很強特異性，即尼克酰胺特異性地與環氧化合物中的三元環發生反應生成具有熒光吸收的有色物質，而該物質顏色的深淺與環氧化合物的含量呈線性關系，因此有效規避了檢測過程中高溫對殘留量檢測的影響，能更準確地測定成品中的殘留量，更好控制產品的生物安全性。
由于市售的BDDE交聯透明質酸鈉凝膠均為顆粒化，殘留的BDDE會相應地包裹在顆粒中，對殘留量的測定產生較大影響，因此在采用熒光法測定時首先需要對顆粒化產品進行酶解。而透明質酸酶是一種高分子蛋白質，不可避免地會引入一定環狀結構，對檢測造成潛在影響。透明質酸酶本身存在一定熒光值，由于現有的產品標準中BDDE的限定值多為2 μg/g，3 mg/mL的透明質酸酶折合BDDE的殘留量為0.6 μg/g，極大地影響BDDE殘留量的檢測，因此在檢驗方法的制定中必須考慮透明質酸酶的影響；同時BDDE本身又具有熱不穩定性，且儲備液放置時間過長其熒光值也會發生較大改變，因此我們對熒光法進行了改良，即將透明質酸酶添加到標準曲線中，進而排除了透明質酸酶對檢測的影響；同時還考察了儲備液不同放置時間其熒光值的變化，進而確定在測定BDDE殘留量時應用的儲備液采用臨用新配，排除了儲備液對檢測的影響。
如今市面上BDDE交聯透明質酸鈉凝膠均為無菌注射產品，滅菌方式均為高壓蒸汽滅菌，該制備工藝造成了成品中的BDDE殘留量下降，因此采用上述經改進的熒光分光光度法進行BDDE交聯劑殘留量檢測，其得到的結果只能表示高溫滅菌后產品的BDDE殘留量。這是因為BDDE具有熱不穩定性，故產品自生產制造完成后，凝膠殘留的BDDE就會發生一系列分解變化，其含量也會逐漸下降，分解后的產物毒性及其安全性還需作進一步研究，以確保產品在整個壽命周期內的安全性。對于生產企業也要提出新的命題，即產品滅菌前與滅菌后BDDE殘留量的變化及其分解產物，以新生產未滅菌產品中的殘留量作為參考值來進行系統性的安全性研究。
