引用本文： 李衛華, 王曉, 張永樂, 郭建闊, 潘華剛. microRNA-199b-5p在尤文肉瘤細胞系中的功能研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(5): 595-599. doi: 10.7507/1002-1892.20150129 復制
尤文肉瘤是一種原始神經外胚層腫瘤家族中罕見的侵襲性腫瘤[1]，是臨床常見惡性骨腫瘤，好發于兒童及青少年 [2-3]。目前有關尤文肉瘤發生發展的機制尚未明確，這種惡性腫瘤發展快，早期即可發生廣泛轉移，累及全身骨骼。臨床治療以放、化療及手術為主，僅60%患者可局部治愈，且5年存活率低[4]。
microRNA（miRNA）是內源性非編碼分子，由約22個核苷酸組成。研究發現，miRNA幾乎控制著人體每一個生理活動，如細胞增殖、細胞分化發育等，說明miRNA涉及多種疾病的發生[5]。有研究表明，miRNA在尤文肉瘤的發生中具有重要作用[6-8]。目前miR-199b-5p在尤文肉瘤中的作用研究罕見報道，為此本研究采用尤文肉瘤的兩個細胞系A673和TC252研究miR-199b-5p在體外對尤文肉瘤的作用，進一步探討其在尤文肉瘤細胞系中的作用機制，以期為臨床生物學治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
人尤文肉瘤細胞系A673、TC252由河南大學分子醫學研究所惠贈，經免疫熒光染色觀察菌落特點符合其生物學特性。MSCs、293TN細胞均購自上海中國科學院細胞庫。RPMI1640、DMEM、IMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；miR-199b-5p寡核苷酸片段（mimic）及其陰性對照（mimic control）（上海吉瑪生物醫藥科技有限公司）；轉染試劑DharmaFECT 1（Dharmacon公司，美國）；Trizol 試劑、反轉錄試劑盒、胰蛋白酶（Invitrogen公司，美國）；SYBR熒光染料試劑盒（Takara公司，日本）；細胞計數試劑盒8（cell conting kit 8，CCK-8）試劑盒（Dojindo公司，日本）；PE-AnnexinⅤ細胞凋亡檢測試劑盒Ⅰ（BD公司，美國）；BCA試劑盒（北京維格拉斯生物技術有限公司）；細胞周期調節蛋白1（cyclin-L1，CCNL1）、c-Kit、GAPDH一抗（Promega公司，美國）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。ABI PRISM 7500 型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；酶標儀（Thermo公司，美國） 。
1.2 實驗分組及方法
實驗分為兩組。取人尤文肉瘤細胞系A673、TC252置于RPMI 1640培養基（含10%FBS、100 U/ mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），于37℃、5%CO2培養箱中培養。分別以終濃度60 nmol/L的miR-199b-5p mimic （實驗組）、miR-199b-5p mimic control （對照組）轉染A673、TC252細胞。轉染前1 d進行細胞傳代，使轉染當天細胞處于對數生長期。
1.3 觀測指標
1.3.1 實時熒光定量PCR檢測
轉染48 h 后收集兩組細胞，以及采用IMDM培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和10 ng/ mL PDGF-BB）培養48 h的MSCs。Trizol法提取細胞總RNA，取2 μg總RNA逆轉錄成cDNA；以cDNA為模板，熒光定量PCR儀進行檢測；采用SYBR熒光染料試劑盒，以U6作為內參基因。引物序列：miR-199b-5p上游5'-CAGCCCAGTGTTTAGACTATC-3'，下游5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'； U6上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，下游5'- ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'。 反應條件： 95?C、3 min； 95?C、5 s，60?C、30 s，72?C 30 s；最后72?C、10 min；共30個循環。PCR 擴增結束后繪制熔解曲線，以 2-ΔΔCt值表示miR-199b-5p的mRNA相對表達量。實驗重復 3 次。
1.3.2 細胞增殖實驗
兩組細胞轉染6 h后換液，換液后16 h以0.25% 胰蛋白酶消化并收集細胞，重新懸浮于完全培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基）后接種于24孔板，每孔約8×103個細胞。收集培養0、24、 48、72 h的細胞，采用CCK-8法進行細胞增殖檢測，于450 nm和630 nm處測定吸光度（A）值。
1.3.3 細胞周期檢測
采用流式細胞術（flow cytometry，FCM） 檢測細胞周期變化。兩組細胞轉染4 h后更換無血清培養基，饑餓培養24 h后加入完全培養基，48 h后收集細胞。用預冷PBS洗滌2次，70%預冷乙醇固定過夜，碘化丙啶和RNase A孵育，流式細胞儀檢測細胞周期。
1.3.4 細胞凋亡實驗
采用FCM 法檢測細胞凋亡情況。兩組細胞轉染后以低濃度（3%）血清培養48 h，收集細胞，顯微鏡下調整細胞密度為5×105 個 / mL，預冷PBS洗滌2次，然后分別與PE-AnnexinⅤ和 7-AAD孵育。其中AnnexinⅤ（+）/7-AAD（-）表示 早期 凋亡 細胞，AnnexinⅤ（+） /7-AAD（+）表示晚期凋亡細胞，AnnexinⅤ（-）/7-AAD（-）表示非凋亡細胞。本研究以早期凋亡細胞為研究對象，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
1.3.5 雙熒光報告基因實驗
通過在線預測軟件Targetscan、MIRanda分析miR-199b-5p可能作用的靶基因為CCNL1和c-Kit。根據CCNL1和c-Kit與miR-199b-5p之間的結合位點構建這兩個靶基因的野生型（WT）報告質粒，同時根據結合位點的序列進行突變，構建成突變型（MT）報告質粒。將miR-199b-5p mimic、mimic control分別與CCNL1和c-Kit的野生型、突變型報告質粒共轉染293TN細胞（細胞置于完全培養基培養）；轉染48 h后收集細胞，PBS漂洗1次，每孔加入100 μL細胞裂解液，室溫混勻15 min；每個樣品取10 μL裂解液于96孔板中，利用酶標儀分別檢測細胞中CCNL1和c-Kit野生型及突變型報告質粒的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶熒光值，其中以海腎熒光素酶的熒光值作為內參，以螢火蟲熒光素酶的相對表達量代表CCNL1和c-Kit野生型及突變型報告質粒的表達。
1.3.6 Western
blot檢測采用Western blot 檢測CCNL1和c-Kit蛋白表達水平。轉染48 h后收集兩組細胞提取總蛋白質，PBS 洗滌1～2次，加入適量裂解緩沖液，置冰上反應30 min，BCA蛋白濃度法測定蛋白樣品的濃度。于蛋白樣品中加入5×loading Buffer混和均勻，沸水煮10 min，使蛋白質充分變性，在合適濃度的SDS-PAGE膠上電泳。電泳結束后蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，5%牛奶封閉2 h后孵育抗體，TBST洗膜后雜交顯影，ECL于暗室顯影。采用灰度掃描軟件進行蛋白條帶的灰度值分析，以目的蛋白條帶的灰度值與內參GAPDH 蛋白條帶的灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用Prism5.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實時熒光定量PCR檢測
實時熒光定量PCR檢測示，對照組A673細胞及TC252細胞中的miR-199b-5p mRNA相對表達量分別為0.396±0.024、0.490±0.027，與MSCs（1.000±0.205）相比均顯著下降，并且與實驗組對應細胞（1.875±0.580、3.492±0.650）比較亦顯著下降，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。
2.2 細胞增殖實驗
與對照組對應細胞相比，實驗組A673細胞和TC252細胞培養0、24 h時增殖能力無顯著差異（P＞0.05）；但48 h后細胞增殖能力明顯下降，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1。
圖1
CCK-8法檢測兩組細胞增殖情況 ?A673細胞 ? TC252細胞? ?圖 2 FCM 法檢測兩組細胞周期變化 ? A673細胞 ? TC252細胞? ?圖 3 雙熒光報告實驗檢測CCNL1和c-Kit野生型和突變型的表達 ? CCNL1 ? c-Kit? ?圖 4 Western blot檢測兩組細胞CCNL1及 c-Kit蛋白表達 1：對照組 2：實驗組 ? A673細胞 ? TC252細胞? ?圖 5 Western blot檢測兩組細胞CCNL1和c-Kit蛋白相對表達量 ? CCNL1 ? c-Kit
Figure1.
The proliferation of A673 cells and TC252 cells in 2 groups by cell counting kit 8 assay ?A673 cells ? TC252 cells? ? Fig. 2 The cell cycle changes of A673 cells and TC252 cells in 2 groups by flow cytometry ? A673 cells ? TC252 cells? ? Fig. 3 The wild type and mutant type of CCNL1 and c-Kit by luciferase activity ? CCNL1 ? c-Kit? ? Fig. 4 The expression levels of CCNL1 and c-Kit in A673 cells and TC252 cells in 2 groups by Western blot 1: Control group 2: Experimental group ? A673 cells ? TC252 cells? ? Fig. 5 The relative expression levels of CCNL1 and c-Kit in A673 cells and TC252 cells by Western blot ? CCNL1 ? c-Kit
2.3 細胞周期檢測
與對照組對應細胞相比，實驗組G1期細胞明顯增多，S期細胞明顯減少，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；而兩組G2/M期細胞比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2。
2.4 細胞凋亡實驗
實驗組A673細胞和TC252細胞凋亡率分別為22.50%±4.51%和23.50%±2.01%，較對照組對應細胞11.00%±2.7%和15.00%±3.85%顯著增高，比較差異有統計學意義（t=3.899，P=0.018；t=3.771，P=0.020）。
2.5 miR-199b-5p靶基因確定
與轉染mimic control比較，過表達miR-199b-5p mimic后野生型CCNL1和c-Kit的熒火蟲熒光素酶活性明顯受抑制，比較差異有統計學意義（t=7.212，P=0.002；t=2.933，P=0.043）。而突變型CCNL1和c-Kit的熒火蟲熒光素酶活性無顯著差異（t=2.304，P=0.0775；t=1.102，P=0.337）。見圖 3。
2.6 Western blot檢測
與對照組對應細胞相比，實驗組A673細胞和TC252細胞中CCNL1和c-Kit蛋白相對表達量明顯下調，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4、5。
3 討論
miRNAs是一類非編碼的調節性RNA分子，通過與靶基因的非翻譯區結合從而降解靶mRNA或抑制蛋白質翻譯，主要在轉錄后水平調控基因的表達[9]。有文獻報道miRNA在多種腫瘤的發生發展中具有重要調節作用[10]。miR-199b-5p是miRNA家族中的一員，在多種腫瘤（如卵巢癌[11]、乳腺癌[12]、甲狀腺癌[13]、骨肉瘤[14]等）中其表達下調，提示miR-199b-5p可能在腫瘤中起抑癌基因作用。此外，miR-199b-5p在骨肉瘤中還參與信號通路的轉導，Won等[14]發現在骨肉瘤中miR-199b-5p參與Notch信號通路，提出miR-199b-5p的抑制劑有望作為防止骨肉瘤轉移的治療策略。本研究發現，過表達miR-199b-5p后兩種尤文肉瘤細胞系A673和TC252惡性增殖行為被抑制，主要表現為細胞增殖能力減弱，細胞周期發生改變，從G1期到S期的轉換受阻，同時細胞凋亡率明顯上升。
為進一步探討miR-199b-5p在尤文肉瘤中促進凋亡的分子機制，本研究預測了miR-199b-5p在尤文肉瘤中的靶點基因，并通過雙熒光報告基因實驗和Western blot檢測確定了CCNL1和c-Kit是miR-199b-5p的直接靶基因。CCNL1與多種癌癥相關，在人頭頸鱗狀細胞癌中呈高表達并大量擴增 [15-16]。最近有研究表明，在紅系分化中CCNL1是miR-199b-5p的靶基因之一，過表達miR-199b-5p促進紅系分化是通過靶向CCNL1來實現的[17]。本研究中過表達miR-199b-5p后CCNL1蛋白水平顯著下降，miR-199b-5p抑制了CCNL1的蛋白質翻譯，說明miR-199b-5p在尤文肉瘤中抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用可能依賴調節CCNL1實現。c-Kit又稱干細胞因子受體，是Ⅲ型絡氨酸蛋白激酶受體家族的一員。研究發現c-Kit蛋白的表達與小細胞肺癌的發生發展密切相關，與c-Kit原癌基因9號和11號外顯子發生突變相關[18-19]。Garzia等[20]研究發現c-Kit與卵巢上皮性癌的發生、增殖、浸潤、轉移相關，和血小板衍生生長因子受體α共同參與了卵巢上皮性癌的發生。Ikeda等[21]研究發現c-Kit信號通路參與了尤文肉瘤的增殖。本研究僅觀察了過表達miR-199b-5p后對c-Kit蛋白水平的影響，結果顯示其蛋白水平明顯下降，但是對c-Kit在尤文肉瘤細胞的功能及下游信號通路尚待進一步研究。
綜上述，miR-199b-5p在尤文肉瘤中發揮抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用是通過靶向CCNL1和c-Kit實現，這些研究可能為人類尤文肉瘤提供新的診斷和治療方案。
尤文肉瘤是一種原始神經外胚層腫瘤家族中罕見的侵襲性腫瘤[1]，是臨床常見惡性骨腫瘤，好發于兒童及青少年 [2-3]。目前有關尤文肉瘤發生發展的機制尚未明確，這種惡性腫瘤發展快，早期即可發生廣泛轉移，累及全身骨骼。臨床治療以放、化療及手術為主，僅60%患者可局部治愈，且5年存活率低[4]。
microRNA（miRNA）是內源性非編碼分子，由約22個核苷酸組成。研究發現，miRNA幾乎控制著人體每一個生理活動，如細胞增殖、細胞分化發育等，說明miRNA涉及多種疾病的發生[5]。有研究表明，miRNA在尤文肉瘤的發生中具有重要作用[6-8]。目前miR-199b-5p在尤文肉瘤中的作用研究罕見報道，為此本研究采用尤文肉瘤的兩個細胞系A673和TC252研究miR-199b-5p在體外對尤文肉瘤的作用，進一步探討其在尤文肉瘤細胞系中的作用機制，以期為臨床生物學治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
人尤文肉瘤細胞系A673、TC252由河南大學分子醫學研究所惠贈，經免疫熒光染色觀察菌落特點符合其生物學特性。MSCs、293TN細胞均購自上海中國科學院細胞庫。RPMI1640、DMEM、IMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；miR-199b-5p寡核苷酸片段（mimic）及其陰性對照（mimic control）（上海吉瑪生物醫藥科技有限公司）；轉染試劑DharmaFECT 1（Dharmacon公司，美國）；Trizol 試劑、反轉錄試劑盒、胰蛋白酶（Invitrogen公司，美國）；SYBR熒光染料試劑盒（Takara公司，日本）；細胞計數試劑盒8（cell conting kit 8，CCK-8）試劑盒（Dojindo公司，日本）；PE-AnnexinⅤ細胞凋亡檢測試劑盒Ⅰ（BD公司，美國）；BCA試劑盒（北京維格拉斯生物技術有限公司）；細胞周期調節蛋白1（cyclin-L1，CCNL1）、c-Kit、GAPDH一抗（Promega公司，美國）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。ABI PRISM 7500 型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；酶標儀（Thermo公司，美國） 。
1.2 實驗分組及方法
實驗分為兩組。取人尤文肉瘤細胞系A673、TC252置于RPMI 1640培養基（含10%FBS、100 U/ mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），于37℃、5%CO2培養箱中培養。分別以終濃度60 nmol/L的miR-199b-5p mimic （實驗組）、miR-199b-5p mimic control （對照組）轉染A673、TC252細胞。轉染前1 d進行細胞傳代，使轉染當天細胞處于對數生長期。
1.3 觀測指標
1.3.1 實時熒光定量PCR檢測
轉染48 h 后收集兩組細胞，以及采用IMDM培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和10 ng/ mL PDGF-BB）培養48 h的MSCs。Trizol法提取細胞總RNA，取2 μg總RNA逆轉錄成cDNA；以cDNA為模板，熒光定量PCR儀進行檢測；采用SYBR熒光染料試劑盒，以U6作為內參基因。引物序列：miR-199b-5p上游5'-CAGCCCAGTGTTTAGACTATC-3'，下游5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'； U6上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，下游5'- ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'。 反應條件： 95?C、3 min； 95?C、5 s，60?C、30 s，72?C 30 s；最后72?C、10 min；共30個循環。PCR 擴增結束后繪制熔解曲線，以 2-ΔΔCt值表示miR-199b-5p的mRNA相對表達量。實驗重復 3 次。
1.3.2 細胞增殖實驗
兩組細胞轉染6 h后換液，換液后16 h以0.25% 胰蛋白酶消化并收集細胞，重新懸浮于完全培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基）后接種于24孔板，每孔約8×103個細胞。收集培養0、24、 48、72 h的細胞，采用CCK-8法進行細胞增殖檢測，于450 nm和630 nm處測定吸光度（A）值。
1.3.3 細胞周期檢測
采用流式細胞術（flow cytometry，FCM） 檢測細胞周期變化。兩組細胞轉染4 h后更換無血清培養基，饑餓培養24 h后加入完全培養基，48 h后收集細胞。用預冷PBS洗滌2次，70%預冷乙醇固定過夜，碘化丙啶和RNase A孵育，流式細胞儀檢測細胞周期。
1.3.4 細胞凋亡實驗
采用FCM 法檢測細胞凋亡情況。兩組細胞轉染后以低濃度（3%）血清培養48 h，收集細胞，顯微鏡下調整細胞密度為5×105 個 / mL，預冷PBS洗滌2次，然后分別與PE-AnnexinⅤ和 7-AAD孵育。其中AnnexinⅤ（+）/7-AAD（-）表示 早期 凋亡 細胞，AnnexinⅤ（+） /7-AAD（+）表示晚期凋亡細胞，AnnexinⅤ（-）/7-AAD（-）表示非凋亡細胞。本研究以早期凋亡細胞為研究對象，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
1.3.5 雙熒光報告基因實驗
通過在線預測軟件Targetscan、MIRanda分析miR-199b-5p可能作用的靶基因為CCNL1和c-Kit。根據CCNL1和c-Kit與miR-199b-5p之間的結合位點構建這兩個靶基因的野生型（WT）報告質粒，同時根據結合位點的序列進行突變，構建成突變型（MT）報告質粒。將miR-199b-5p mimic、mimic control分別與CCNL1和c-Kit的野生型、突變型報告質粒共轉染293TN細胞（細胞置于完全培養基培養）；轉染48 h后收集細胞，PBS漂洗1次，每孔加入100 μL細胞裂解液，室溫混勻15 min；每個樣品取10 μL裂解液于96孔板中，利用酶標儀分別檢測細胞中CCNL1和c-Kit野生型及突變型報告質粒的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶熒光值，其中以海腎熒光素酶的熒光值作為內參，以螢火蟲熒光素酶的相對表達量代表CCNL1和c-Kit野生型及突變型報告質粒的表達。
1.3.6 Western
blot檢測采用Western blot 檢測CCNL1和c-Kit蛋白表達水平。轉染48 h后收集兩組細胞提取總蛋白質，PBS 洗滌1～2次，加入適量裂解緩沖液，置冰上反應30 min，BCA蛋白濃度法測定蛋白樣品的濃度。于蛋白樣品中加入5×loading Buffer混和均勻，沸水煮10 min，使蛋白質充分變性，在合適濃度的SDS-PAGE膠上電泳。電泳結束后蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，5%牛奶封閉2 h后孵育抗體，TBST洗膜后雜交顯影，ECL于暗室顯影。采用灰度掃描軟件進行蛋白條帶的灰度值分析，以目的蛋白條帶的灰度值與內參GAPDH 蛋白條帶的灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用Prism5.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實時熒光定量PCR檢測
實時熒光定量PCR檢測示，對照組A673細胞及TC252細胞中的miR-199b-5p mRNA相對表達量分別為0.396±0.024、0.490±0.027，與MSCs（1.000±0.205）相比均顯著下降，并且與實驗組對應細胞（1.875±0.580、3.492±0.650）比較亦顯著下降，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。
2.2 細胞增殖實驗
與對照組對應細胞相比，實驗組A673細胞和TC252細胞培養0、24 h時增殖能力無顯著差異（P＞0.05）；但48 h后細胞增殖能力明顯下降，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1。
圖1
CCK-8法檢測兩組細胞增殖情況 ?A673細胞 ? TC252細胞? ?圖 2 FCM 法檢測兩組細胞周期變化 ? A673細胞 ? TC252細胞? ?圖 3 雙熒光報告實驗檢測CCNL1和c-Kit野生型和突變型的表達 ? CCNL1 ? c-Kit? ?圖 4 Western blot檢測兩組細胞CCNL1及 c-Kit蛋白表達 1：對照組 2：實驗組 ? A673細胞 ? TC252細胞? ?圖 5 Western blot檢測兩組細胞CCNL1和c-Kit蛋白相對表達量 ? CCNL1 ? c-Kit
Figure1.
The proliferation of A673 cells and TC252 cells in 2 groups by cell counting kit 8 assay ?A673 cells ? TC252 cells? ? Fig. 2 The cell cycle changes of A673 cells and TC252 cells in 2 groups by flow cytometry ? A673 cells ? TC252 cells? ? Fig. 3 The wild type and mutant type of CCNL1 and c-Kit by luciferase activity ? CCNL1 ? c-Kit? ? Fig. 4 The expression levels of CCNL1 and c-Kit in A673 cells and TC252 cells in 2 groups by Western blot 1: Control group 2: Experimental group ? A673 cells ? TC252 cells? ? Fig. 5 The relative expression levels of CCNL1 and c-Kit in A673 cells and TC252 cells by Western blot ? CCNL1 ? c-Kit
2.3 細胞周期檢測
與對照組對應細胞相比，實驗組G1期細胞明顯增多，S期細胞明顯減少，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；而兩組G2/M期細胞比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2。
2.4 細胞凋亡實驗
實驗組A673細胞和TC252細胞凋亡率分別為22.50%±4.51%和23.50%±2.01%，較對照組對應細胞11.00%±2.7%和15.00%±3.85%顯著增高，比較差異有統計學意義（t=3.899，P=0.018；t=3.771，P=0.020）。
2.5 miR-199b-5p靶基因確定
與轉染mimic control比較，過表達miR-199b-5p mimic后野生型CCNL1和c-Kit的熒火蟲熒光素酶活性明顯受抑制，比較差異有統計學意義（t=7.212，P=0.002；t=2.933，P=0.043）。而突變型CCNL1和c-Kit的熒火蟲熒光素酶活性無顯著差異（t=2.304，P=0.0775；t=1.102，P=0.337）。見圖 3。
2.6 Western blot檢測
與對照組對應細胞相比，實驗組A673細胞和TC252細胞中CCNL1和c-Kit蛋白相對表達量明顯下調，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4、5。
3 討論
miRNAs是一類非編碼的調節性RNA分子，通過與靶基因的非翻譯區結合從而降解靶mRNA或抑制蛋白質翻譯，主要在轉錄后水平調控基因的表達[9]。有文獻報道miRNA在多種腫瘤的發生發展中具有重要調節作用[10]。miR-199b-5p是miRNA家族中的一員，在多種腫瘤（如卵巢癌[11]、乳腺癌[12]、甲狀腺癌[13]、骨肉瘤[14]等）中其表達下調，提示miR-199b-5p可能在腫瘤中起抑癌基因作用。此外，miR-199b-5p在骨肉瘤中還參與信號通路的轉導，Won等[14]發現在骨肉瘤中miR-199b-5p參與Notch信號通路，提出miR-199b-5p的抑制劑有望作為防止骨肉瘤轉移的治療策略。本研究發現，過表達miR-199b-5p后兩種尤文肉瘤細胞系A673和TC252惡性增殖行為被抑制，主要表現為細胞增殖能力減弱，細胞周期發生改變，從G1期到S期的轉換受阻，同時細胞凋亡率明顯上升。
為進一步探討miR-199b-5p在尤文肉瘤中促進凋亡的分子機制，本研究預測了miR-199b-5p在尤文肉瘤中的靶點基因，并通過雙熒光報告基因實驗和Western blot檢測確定了CCNL1和c-Kit是miR-199b-5p的直接靶基因。CCNL1與多種癌癥相關，在人頭頸鱗狀細胞癌中呈高表達并大量擴增 [15-16]。最近有研究表明，在紅系分化中CCNL1是miR-199b-5p的靶基因之一，過表達miR-199b-5p促進紅系分化是通過靶向CCNL1來實現的[17]。本研究中過表達miR-199b-5p后CCNL1蛋白水平顯著下降，miR-199b-5p抑制了CCNL1的蛋白質翻譯，說明miR-199b-5p在尤文肉瘤中抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用可能依賴調節CCNL1實現。c-Kit又稱干細胞因子受體，是Ⅲ型絡氨酸蛋白激酶受體家族的一員。研究發現c-Kit蛋白的表達與小細胞肺癌的發生發展密切相關，與c-Kit原癌基因9號和11號外顯子發生突變相關[18-19]。Garzia等[20]研究發現c-Kit與卵巢上皮性癌的發生、增殖、浸潤、轉移相關，和血小板衍生生長因子受體α共同參與了卵巢上皮性癌的發生。Ikeda等[21]研究發現c-Kit信號通路參與了尤文肉瘤的增殖。本研究僅觀察了過表達miR-199b-5p后對c-Kit蛋白水平的影響，結果顯示其蛋白水平明顯下降，但是對c-Kit在尤文肉瘤細胞的功能及下游信號通路尚待進一步研究。
綜上述，miR-199b-5p在尤文肉瘤中發揮抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用是通過靶向CCNL1和c-Kit實現，這些研究可能為人類尤文肉瘤提供新的診斷和治療方案。
