引用本文： 劉雨微, 成亮, 朱劍熹, 楊程, 肖凱, 羅偉, 高曙光, 李康華. ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表達及臨床病理意義. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(5): 590-594. doi: 10.7507/1002-1892.20150128 復制
ErbB3屬于Ⅰ型受體酪氨酸激酶的ErbB受體家族，是在腫瘤發生發展中最重要的受體家族之一[1]。研究已證實ErbB2與腫瘤患者不良預后有關，而ErbB2過表達的細胞中ErbB3表達升高[2]。此外，在乳腺癌的研究中亦發現Flotillin與ErbB2成正相關 [3]。Flotillin包括Flotillin-1和Flotillin-2[4]，其不僅參與各種細胞進程[5]，也與一些腫瘤的形成過程密切相關[6]。Asp等[7]研究發現在乳腺癌細胞系中，Flotillin消耗會引起ErbB3蛋白水平下調。而且，Flotillin缺失會導致ErbB2-ErbB3信號復合物減少，這在人類癌細胞信號通路中具有關鍵作用。
Jullien等[8]報道在體外骨肉瘤細胞系中ErbB3表達缺失可以降低骨肉瘤細胞增殖和腫瘤生長，但該研究未進一步探究其與臨床指標的相關性。在骨肉瘤組織中Flotillin-2是否異常表達，以及ErbB3和Flotillin-2間有無關聯，尚缺少相關研究。因此，本研究通過觀測骨肉瘤與骨軟骨瘤患者病理組織中ErbB3和Flotillin-2的表達差異，分析二者在骨肉瘤中的標志性意義及相關性，同時明確其與骨肉瘤臨床病理特征的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗標本
將2009年9月－2014年3月中南大學湘雅醫院收治的38例骨肉瘤患者納入研究。男24例，女14例；年齡9～60歲，中位年齡17歲。根據腫瘤侵襲的侵向性，以14歲為界[9]，＞14歲27例、≤14歲11例。腫瘤部位：股骨24例，脛腓骨9例，其他5例。腫瘤大小以8 cm為界[9]，＞8 cm 17例、≤8 cm 21例。根據美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）指南骨肉瘤外科分期標準，Ⅰ/ⅡA期18例，ⅡB/Ⅲ期20例。伴肺轉移18例。患者獲隨訪6～60個月，中位時間34個月。隨訪期間22例患者因骨肉瘤死亡。全組患者總生存期（overall survival，OS）6～40個月，平均14.26個月。取樣本組織切片（中南大學湘雅醫院病理科）用于ErbB3和Flotillin-2的染色。以同時間段收治的13例骨軟骨瘤患者作為對照。本研究通過中南大學湘雅醫院倫理委員會審查批準。
1.2 實驗方法
取腫瘤細胞特征明顯且包埋較好的蠟塊行2.5 μm厚連續切片。使用SABC法進行免疫組織化學染色。病理切片經脫蠟復水，在檸檬酸鈉水浴（95℃）中抗原修復20 min，冷卻至室溫后H2O2孵育10 min，用10%山羊血清（武漢博士德生物工程有限公司）封閉30 min。骨肉瘤組織滴加兔抗人單克隆抗ErbB3抗體（1∶100；CST公司，美國）或兔抗人多克隆抗Flotillin-2抗體（1∶100；Abcam公司，英國），37℃恒溫箱孵育80 min；骨軟骨瘤組織滴加PBS代替一抗，PBS漂洗后加二抗孵育。經化學染色后，脫水封片。所有標本由2位病理醫生獨立診斷染色在細胞核或細胞質/細胞膜。每張切片上隨機觀察5個高倍視野（×400），根據以下標準評分[10]：① 陽性腫瘤細胞百分比：1分，1%～25%；2 分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%。② 細胞質染色強度：0分，無色；1分，淡黃色；2分，棕色；3 分，褐色。③ 細胞膜染色存在或缺失：0分，缺失；1分，存在。3項總分≥5分為免疫染色陽性。
1.3 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的表達比較采用Fisher確切概率法。分類變量（性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、臨床分期、肺轉移）與ErbB3和Flotillin-2表達的相關性分析采用成組χ2檢驗，ErbB3和Flotillin-2之間的關聯性采用配對χ2檢驗，生存分析使用log-rank檢驗和Cox回歸分析法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的表達
鏡下觀察示，ErbB3、Flotillin-2蛋白均在骨肉瘤組織細胞質中高表達，在骨軟骨瘤組織中低表達（圖 1）。骨肉瘤中ErbB3和Flotillin-2陽性率分別為68.4%（26/38）和73.7%（28/38），均顯著高于骨軟骨瘤中[分別為15.4%（2/13）和23.1%（3/13）]，比較差異均有統計學意義（P=0.001；P=0.002）。
圖1
ErbB3和Flotillin-2免疫組織化學染色觀察（SABC×400） ? 骨肉瘤中ErbB3過表達（箭頭） ? 骨軟骨瘤中ErbB3陰性表達 ? 骨肉瘤中Flotillin-2過表達（箭頭） ? 骨軟骨瘤中Flotillin-2陰性表達
Figure1.
The immunohistochemical staining of ErbB3 and Flotillin-2 (SABC×400) ? High expression of ErbB3 in osteosarcoma (arrow) ? No expression of ErbB3 in osteochondroma ? High expression of Flotillin-2 in osteosarcoma (arrow) ? No expression of Flotillin-2 in osteochondroma
2.2 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中表達的相關性
χ2檢驗顯示，ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表達具有較好的一致性（Kappa值=0.434），有統計學意義（P=0.000）。見表 1。
表1
ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中表達的關系
Table1.
The correlation between ErbB3 and Flotillin-2 expression in osteosarcoma
2.3 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表達影響因素分析
ErbB3在骨肉瘤中的表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小無相關（P＞0.05），與臨床分期及肺轉移相關（P＜0.05）。而Flotillin-2在骨肉瘤中的表達與以上因素均無相關（P＞0.05）。見表 2。
表2
ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表達與臨床病理因素的關系
Table2.
The expressions of ErbB3 and Flotillin-2 in osteosarcoma and its relationship with clinical pathological characteristics
2.4 骨肉瘤患者OS影響因素分析
影響骨肉瘤患者OS的因素包括骨肉瘤臨床分期、肺轉移、ErbB3表達陽性及腫瘤大小（P＜0.05），其他臨床特征對骨肉瘤患者OS的影響均無統計學意義（P＞0.05）。見表 3。將單因素分析中對骨肉瘤患者OS的影響有統計學意義的因素納入多因素Cox回歸分析，結果表明OS的獨立影響因素是肺轉移和ErbB3表達陽性（P＜0.05）。見表 4。
表3
OS的單因素回歸分析
Table3.
Single factor regression analysis of overall survival
表4
OS的多因素回歸分析
Table4.
Cox regression analysis of overall survival
3 討論
本研究結果顯示，骨肉瘤組織中ErbB3蛋白表達陽性率顯著高于骨軟骨瘤中，骨肉瘤組織中ErbB3在ⅡB/Ⅲ期患者中表達較高；ErbB3的過表達伴隨骨肉瘤肺轉移升高；ErbB3過表達的患者OS較低。這些數據進一步證實ErbB3在骨肉瘤患者中過表達，同時提示ErbB3過表達與患者、腫瘤惡性程度、侵襲及患者預后有關。
文獻報道，骨肉瘤細胞的產生是機體對細胞生長和分化調節失控的結果[11]。骨肉瘤細胞侵襲力會導致預后不良和患者生存率降低[12-13]。因此，減少骨肉瘤細胞對正常組織的侵襲力對降低腫瘤侵擾尤為重要。明確骨肉瘤細胞生長調節異常的分子機制能為研究靶向治療方法奠定基礎。關于ErbB2在骨肉瘤的表達已有報道[11]，但關于ErbB3表達的報道較少。研究表明ErbB3能夠通過激活PI3K/Akt信號通路促進細胞運動和侵襲[14-15]。另一細胞通路機制可能涉及分泌ErbB3亞型，增強癌細胞對軟組織的侵襲力[16-17]。值得注意的是，ErbB3的活性和功能依賴于其與ErbB2的相互作用[18]。ErbB3與ErbB2結合后，激活PI3K/Akt信號通路和腫瘤形成[19]。
ErbB3除了與ErbB2相互作用外，還可被其他信號分子激活。研究表明，Flotillins缺失干擾表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）聚集[20]和EGFR磷酸化[21]，從而影響下游信號級聯反應。Zhu等[22]報道在胃癌組織中Flotillin-2與ErbB2表達成正相關性。Asp等[7]在一系列乳腺癌細胞中發現Flotillin缺失會引發ErbB2和ErbB3受體的降解。本研究結果與該發現一致，提示Flotillins可能是ErbB在多種癌癥類型中表達水平的關鍵調節閥。ErbB2-ErbB3受體復合物的激活導致了多種效應器的磷酸化，主要激活MAPK和Akt通路[23-24]。Flotillin-2的缺失導致了Akt和MAPK磷酸化水平顯著降低，而Flotillin-1缺失則無此效果[7]。因此，Flotillin-2對Akt和MAPK信號通路是否具有附加調節作用，仍需進一步實驗證實。
綜上述，本研究初步證明了Flotillin-2在骨肉瘤組織中過表達，且與ErbB3的表達成正相關，其具體作用機制需進一步實驗。提示Flotillins可能作為降低ErbB3的靶向蛋白，為治療腫瘤生長和轉移提供新的治療策略。
ErbB3屬于Ⅰ型受體酪氨酸激酶的ErbB受體家族，是在腫瘤發生發展中最重要的受體家族之一[1]。研究已證實ErbB2與腫瘤患者不良預后有關，而ErbB2過表達的細胞中ErbB3表達升高[2]。此外，在乳腺癌的研究中亦發現Flotillin與ErbB2成正相關 [3]。Flotillin包括Flotillin-1和Flotillin-2[4]，其不僅參與各種細胞進程[5]，也與一些腫瘤的形成過程密切相關[6]。Asp等[7]研究發現在乳腺癌細胞系中，Flotillin消耗會引起ErbB3蛋白水平下調。而且，Flotillin缺失會導致ErbB2-ErbB3信號復合物減少，這在人類癌細胞信號通路中具有關鍵作用。
Jullien等[8]報道在體外骨肉瘤細胞系中ErbB3表達缺失可以降低骨肉瘤細胞增殖和腫瘤生長，但該研究未進一步探究其與臨床指標的相關性。在骨肉瘤組織中Flotillin-2是否異常表達，以及ErbB3和Flotillin-2間有無關聯，尚缺少相關研究。因此，本研究通過觀測骨肉瘤與骨軟骨瘤患者病理組織中ErbB3和Flotillin-2的表達差異，分析二者在骨肉瘤中的標志性意義及相關性，同時明確其與骨肉瘤臨床病理特征的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗標本
將2009年9月－2014年3月中南大學湘雅醫院收治的38例骨肉瘤患者納入研究。男24例，女14例；年齡9～60歲，中位年齡17歲。根據腫瘤侵襲的侵向性，以14歲為界[9]，＞14歲27例、≤14歲11例。腫瘤部位：股骨24例，脛腓骨9例，其他5例。腫瘤大小以8 cm為界[9]，＞8 cm 17例、≤8 cm 21例。根據美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）指南骨肉瘤外科分期標準，Ⅰ/ⅡA期18例，ⅡB/Ⅲ期20例。伴肺轉移18例。患者獲隨訪6～60個月，中位時間34個月。隨訪期間22例患者因骨肉瘤死亡。全組患者總生存期（overall survival，OS）6～40個月，平均14.26個月。取樣本組織切片（中南大學湘雅醫院病理科）用于ErbB3和Flotillin-2的染色。以同時間段收治的13例骨軟骨瘤患者作為對照。本研究通過中南大學湘雅醫院倫理委員會審查批準。
1.2 實驗方法
取腫瘤細胞特征明顯且包埋較好的蠟塊行2.5 μm厚連續切片。使用SABC法進行免疫組織化學染色。病理切片經脫蠟復水，在檸檬酸鈉水浴（95℃）中抗原修復20 min，冷卻至室溫后H2O2孵育10 min，用10%山羊血清（武漢博士德生物工程有限公司）封閉30 min。骨肉瘤組織滴加兔抗人單克隆抗ErbB3抗體（1∶100；CST公司，美國）或兔抗人多克隆抗Flotillin-2抗體（1∶100；Abcam公司，英國），37℃恒溫箱孵育80 min；骨軟骨瘤組織滴加PBS代替一抗，PBS漂洗后加二抗孵育。經化學染色后，脫水封片。所有標本由2位病理醫生獨立診斷染色在細胞核或細胞質/細胞膜。每張切片上隨機觀察5個高倍視野（×400），根據以下標準評分[10]：① 陽性腫瘤細胞百分比：1分，1%～25%；2 分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%。② 細胞質染色強度：0分，無色；1分，淡黃色；2分，棕色；3 分，褐色。③ 細胞膜染色存在或缺失：0分，缺失；1分，存在。3項總分≥5分為免疫染色陽性。
1.3 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的表達比較采用Fisher確切概率法。分類變量（性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、臨床分期、肺轉移）與ErbB3和Flotillin-2表達的相關性分析采用成組χ2檢驗，ErbB3和Flotillin-2之間的關聯性采用配對χ2檢驗，生存分析使用log-rank檢驗和Cox回歸分析法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的表達
鏡下觀察示，ErbB3、Flotillin-2蛋白均在骨肉瘤組織細胞質中高表達，在骨軟骨瘤組織中低表達（圖 1）。骨肉瘤中ErbB3和Flotillin-2陽性率分別為68.4%（26/38）和73.7%（28/38），均顯著高于骨軟骨瘤中[分別為15.4%（2/13）和23.1%（3/13）]，比較差異均有統計學意義（P=0.001；P=0.002）。
圖1
ErbB3和Flotillin-2免疫組織化學染色觀察（SABC×400） ? 骨肉瘤中ErbB3過表達（箭頭） ? 骨軟骨瘤中ErbB3陰性表達 ? 骨肉瘤中Flotillin-2過表達（箭頭） ? 骨軟骨瘤中Flotillin-2陰性表達
Figure1.
The immunohistochemical staining of ErbB3 and Flotillin-2 (SABC×400) ? High expression of ErbB3 in osteosarcoma (arrow) ? No expression of ErbB3 in osteochondroma ? High expression of Flotillin-2 in osteosarcoma (arrow) ? No expression of Flotillin-2 in osteochondroma
2.2 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中表達的相關性
χ2檢驗顯示，ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表達具有較好的一致性（Kappa值=0.434），有統計學意義（P=0.000）。見表 1。
表1
ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中表達的關系
Table1.
The correlation between ErbB3 and Flotillin-2 expression in osteosarcoma
2.3 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表達影響因素分析
ErbB3在骨肉瘤中的表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小無相關（P＞0.05），與臨床分期及肺轉移相關（P＜0.05）。而Flotillin-2在骨肉瘤中的表達與以上因素均無相關（P＞0.05）。見表 2。
表2
ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表達與臨床病理因素的關系
Table2.
The expressions of ErbB3 and Flotillin-2 in osteosarcoma and its relationship with clinical pathological characteristics
2.4 骨肉瘤患者OS影響因素分析
影響骨肉瘤患者OS的因素包括骨肉瘤臨床分期、肺轉移、ErbB3表達陽性及腫瘤大小（P＜0.05），其他臨床特征對骨肉瘤患者OS的影響均無統計學意義（P＞0.05）。見表 3。將單因素分析中對骨肉瘤患者OS的影響有統計學意義的因素納入多因素Cox回歸分析，結果表明OS的獨立影響因素是肺轉移和ErbB3表達陽性（P＜0.05）。見表 4。
表3
OS的單因素回歸分析
Table3.
Single factor regression analysis of overall survival
表4
OS的多因素回歸分析
Table4.
Cox regression analysis of overall survival
3 討論
本研究結果顯示，骨肉瘤組織中ErbB3蛋白表達陽性率顯著高于骨軟骨瘤中，骨肉瘤組織中ErbB3在ⅡB/Ⅲ期患者中表達較高；ErbB3的過表達伴隨骨肉瘤肺轉移升高；ErbB3過表達的患者OS較低。這些數據進一步證實ErbB3在骨肉瘤患者中過表達，同時提示ErbB3過表達與患者、腫瘤惡性程度、侵襲及患者預后有關。
文獻報道，骨肉瘤細胞的產生是機體對細胞生長和分化調節失控的結果[11]。骨肉瘤細胞侵襲力會導致預后不良和患者生存率降低[12-13]。因此，減少骨肉瘤細胞對正常組織的侵襲力對降低腫瘤侵擾尤為重要。明確骨肉瘤細胞生長調節異常的分子機制能為研究靶向治療方法奠定基礎。關于ErbB2在骨肉瘤的表達已有報道[11]，但關于ErbB3表達的報道較少。研究表明ErbB3能夠通過激活PI3K/Akt信號通路促進細胞運動和侵襲[14-15]。另一細胞通路機制可能涉及分泌ErbB3亞型，增強癌細胞對軟組織的侵襲力[16-17]。值得注意的是，ErbB3的活性和功能依賴于其與ErbB2的相互作用[18]。ErbB3與ErbB2結合后，激活PI3K/Akt信號通路和腫瘤形成[19]。
ErbB3除了與ErbB2相互作用外，還可被其他信號分子激活。研究表明，Flotillins缺失干擾表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）聚集[20]和EGFR磷酸化[21]，從而影響下游信號級聯反應。Zhu等[22]報道在胃癌組織中Flotillin-2與ErbB2表達成正相關性。Asp等[7]在一系列乳腺癌細胞中發現Flotillin缺失會引發ErbB2和ErbB3受體的降解。本研究結果與該發現一致，提示Flotillins可能是ErbB在多種癌癥類型中表達水平的關鍵調節閥。ErbB2-ErbB3受體復合物的激活導致了多種效應器的磷酸化，主要激活MAPK和Akt通路[23-24]。Flotillin-2的缺失導致了Akt和MAPK磷酸化水平顯著降低，而Flotillin-1缺失則無此效果[7]。因此，Flotillin-2對Akt和MAPK信號通路是否具有附加調節作用，仍需進一步實驗證實。
綜上述，本研究初步證明了Flotillin-2在骨肉瘤組織中過表達，且與ErbB3的表達成正相關，其具體作用機制需進一步實驗。提示Flotillins可能作為降低ErbB3的靶向蛋白，為治療腫瘤生長和轉移提供新的治療策略。
