引用本文： 劉彥冬, 竇源東, 侯春林, 林浩東. 電紡絲殼聚糖/聚乳酸神經導管修復大鼠周圍神經缺損的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(5): 600-608. doi: 10.7507/1002-1892.20150130 復制
隨著交通與工業的發展，周圍神經損傷患者急劇增加，但其治療一直是醫學界難題。周圍神經損傷不僅可能導致患者生活及工作能力喪失，還會為家庭和社會帶來沉重負擔[1-2]。目前治療神經缺損的常用方法是直接端端吻合和自體神經移植，但功能恢復往往不太滿意，且自體神經移植存在神經來源有限、供區創傷等缺點[3-4]。神經導管是目前周圍神經修復研究的熱點領域，多年來許多研究人員一直致力于探索先進的材料和制備技術，改善神經恢復。早在1944年，Weiss就首先提出了用無縫線導管化方法修復周圍神經損傷；之后于20世紀70年代后期逐漸發展出了人工神經移植技術，即采用生物材料制備神經導管引導并促使神經再生。常用的神經導管材料包括聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙烯醇、聚羥基乙酸等。殼聚糖（chitosan）作為一種較新型導管材料，具有防粘連性、生物可降解性，近年越來越受到關注。既往實驗研究多采用傳統溶劑澆鑄法，顯示了chitosan神經導管良好的生物相容性，并對神經缺損有一定修復作用[5]。為進一步改善神經缺損修復效果，我們首次采用電紡絲與化學交聯方法制作電紡絲chitosan/PLA（ch/PLA）神經導管，并用其修復大鼠坐骨神經缺損，術后通過多種觀測指標與自體神經移植和切除曠置比較，評價其修復效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雌性SD大鼠54只，體重200～250 g，由復旦大學動物實驗中心提供。第2代大鼠雪旺細胞由中國科學院上海細胞庫提供。
Chitosan（上海其勝生物制劑有限公司）；PLA（上海國藥集團化學試劑有限公司）；細胞培養液（中國科學院上海硅酸鹽研究所）。雙通道肌電圖儀（Medtronic KeyPoint公司，丹麥）；R200D電子分析天平（賽多利斯集團，德國）；萬能力學測試機（島津公司，日本）；接觸角測定儀（Krüss Optronic GmbH公司，德國）；LKBNOVA超薄切片機（Bromma公司，瑞典）；JSM-6700F掃描電鏡（JEOL公司，日本）；CM12透射電鏡（Philips公司，荷蘭）。
1.2 ch/PLA神經導管的制作及生物學、理化性能檢測
1.2.1 神經導管制作
將0.8 g PLA溶解于10 mL六氟異丙醇中，室溫下攪拌12 h形成均一穩定的溶液。將PLA溶液放入注射器中，注射器針頭處連接高壓電源。溶液供給流量通過微流泵控制在5 mL/ h，施加電壓為15 kV，高壓端與接地端的距離為15 cm，所使用滾筒直徑為8 cm，旋轉速度為3 000 r/min。通過此過程可收集到直徑約630 nm、厚度約0.2 mm的PLA納米纖維膜。將PLA納米纖維膜浸入濃度為0.6%的chitosan稀醋酸溶液（chitosan數均分子量為5×106，脫乙酰度90%，溶液中醋酸含量為1%）中，取出后自然干燥可得到ch/PLA復合纖維膜，其中chitosan復合量約為26.2%。將得到的ch/PLA復合纖維膜沿垂直于纖維取向方向卷曲成直徑為2 mm的神經導管，并利用二氯甲烷對結合處進行黏結。將上述方法制得的ch/PLA復合神經導管先于室溫下放置12 h，并繼續放入37℃真空烘箱中放置12 h以上以除去殘余溶劑。
1.2.2 神經導管生物學、理化性能檢測
① 掃描電鏡觀察：ch/PLA神經導管制備成功后，采用掃描電鏡對其表面和斷面形貌進行分析。② 生物力學測定：通過萬能力學測試機，對ch/PLA神經導管進行拉伸力學和抗壓力學性能測定[6]，測試其變形量與拉力強度和壓力強度的關系。③ 表面潤濕性測定：采用滴液法，使用接觸角測定儀測定ch/PLA神經導管表面靜態水接觸角，并持續觀察40 s。④ 體外生物相容性檢測：將ch/PLA復合纖維膜剪為直徑1 cm的圓片，用75%乙醇浸泡消毒15 min，再用無菌PBS液沖洗材料并用細胞培養液預濕。隨后將復合纖維膜置于48孔培養板，將第2代大鼠雪旺細胞按1.5×104 個 / 孔密度種植于復合纖維膜上。培養過程中每2天換1 次細胞培養液，培養1、3、7 d后，采用MTT法測試材料表面細胞吸光度（A）值，評價其體外生物相容性。以上檢測均設純PLA纖維為對照。
1.3 實驗分組及方法
取SD大鼠，采用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，于右股后外側行縱切口，自肌間隙進入顯露坐骨神經約2 cm。將大鼠隨機分成3組，每組18只。A組：于坐骨神經中段切取7 mm，任其回縮至10 mm，采用長13 mm、內徑1.5 mm、壁厚0.1 mm的電紡絲ch/PLA神經導管橋接神經缺損，兩端分別套入1.5 mm，以10-0顯微外科縫線3針固定；B組：于坐骨神經中段切取10 mm，即行原位逆行神經移植；C組：于坐骨神經中段切取7 mm，任其回縮至10 mm，神經缺損處曠置處理。所有手術均在顯微鏡下完成，并分別于術后4、8、12周取材檢測。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
術后觀察記錄大鼠足趾潰瘍出現的時間及數量，并觀察大鼠切口愈合情況、精神狀態、營養狀況，有無傷口感染、壓迫性潰瘍和自噬現象等，觀察雙下肢肌肉萎縮程度、行走步態等。
1.4.2 坐骨神經功能指數（sciatic
functional index，SFI）檢測術后4、8、12周每組各取6只大鼠，分別將大鼠后爪浸沾黑色顏料，使大鼠在墊有白紙的狹窄直道內前行，取雙側各3個足印跡，以均數計算SFI[7]。
1.4.3 神經電生理檢測
術后4、8、12周每組各取6只大鼠，按原手術入路暴露。以0.5 mA、0.2 ms、1 Hz的電刺激分別于神經吻合口的近、遠端3 mm處進行刺激，測量動作電位波幅及神經傳導速度。
1.4.4 小腿三頭肌濕重測定
神經電生理檢測完成后頸椎脫臼處死大鼠，取出兩側小腿三頭肌，濾紙吸干表面血液后在電子分析天平上稱重，計算肌肉濕重恢復率[8]。
1.4.5 移植體大體觀察
對于有神經移植體和再生神經的A、B組，觀察吻合口有無神經瘤形成，移植體粗細、顏色、表面血管形成、粘連及導管降解情況。
1.4.6 組織學及免疫組織化學染色觀察
取右小腿三頭肌中部肌肉標本，置入10%甲醛固定48 h，脫水、固定，水平橫向切片（片厚5 μm）、HE染色，觀察神經發育情況。每個標本取5張切片，光鏡下隨機取5 個視野，測量視野中所有肌細胞的截面積，取均值。對于有神經移植體和再生神經的A、B組，取再生神經中段組織同法行HE染色，觀察神經發育情況。之后再取切片（片厚5 μm），分別進行生長相關蛋白43（growth associated protein 43，GAP-43）、神經纖維絲蛋白160亞單位（neurofilaments 160，NF-160）、S-100蛋白免疫組織化學染色，光鏡下觀察陽性表達，并測量各自的A值。
1.4.7 透射電鏡觀察
術后12周，對于有神經移植體和再生神經的A、B組，分別取再生神經中段組織，以4%戊二醛固定24 h以上，再以1%鋨酸固定2 h，環氧樹脂定向包埋，作超薄切片（片厚50 nm）。經醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色后，透射電鏡觀察再生神經纖維和髓鞘發育情況，計算再生神經髓鞘厚度和神經纖維直徑。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差等齊用LSD檢驗，方差不等齊用Dunnett T3檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 神經導管生物學性能及理化性能檢測
2.1.1 掃描電鏡觀察
縱切面觀察示，純PLA纖維表面未見chitosan包裹，孔徑尺寸大，孔隙率高；復合chitosan的ch/PLA神經導管復合纖維較純PLA呈高度取向排列，可明顯觀察到chitosan包裹在PLA纖維表面和纖維之間的空隙內，孔隙率下降。從斷面形貌可以看出，純PLA纖維呈單根有序排列；而ch/PLA復合纖維則呈纖維束形貌，chitosan將幾根PLA纖維包裹成束。見圖 1、2。
圖1
純PLA與的ch/PLA神經導管掃描電鏡縱切面觀察（×20 k） ? 純PLA ? ch/PLA神經導管? ?圖 2 純PLA與ch/PLA神經導管掃描電鏡斷面觀察（×20 k） ? 純PLA ? ch/PLA神經導管? ?圖 3 純PLA與ch/PLA神經導管生物力學測定 ? 抗拉伸力學 ? 抗壓力學? ?圖 4 純PLA與ch/PLA神經導管表面潤濕性檢測? ?圖 5 純PLA與ch/PLA神經導管表面細胞增殖曲線
Figure1.
Ultrastructure on longitudinal section of pure PLA nerve conduits and ch/PLA conduits under scanning electron microscopy (×20 k) ? Pure PLA ? ch/PLA? ? Fig. 2 Ultrastructure on cross section of pure PLA nerve conduits and ch/PLA conduits under scanning electron microscopy (×20 k) ? Pure PLA ? ch/PLA? ? Fig. 3 Biomechanical tests of pure PLA nerve conduits and ch/PLA conduits ? Tensile force ? Compressive stress? ? Fig. 4 Hydrophilisy of pure PLA nerve conduits and ch/PLA conduits? ? Fig. 5 Curve of cell proliferation on the surface of pure PLA nerve conduits and ch/PLA conduits
2.1.2 生物力學檢測
ch/PLA神經導管的拉伸力學強度明顯高于純PLA纖維，其最大拉伸強度為23 MPa，比純PLA纖維的最大拉伸強度11 MPa提高了1倍以上。純PLA纖維幾乎不耐受外部抗壓載荷，當應變為50%時，外部抗壓應力仍為0。而ch/ PLA神經導管在達到50%的應變后，其外部抗壓應力可提高至5 N，表明其抗塌縮能力有很大提高。見圖 3。
2.1.3 表面潤濕性檢測
結果顯示，純PLA纖維的水接觸角為128°，且不隨時間延長而變化。而復合chitosan后，復合纖維膜的水接觸角隨時間延長逐漸降低，其水接觸角在2.5 s內迅速降為0，表現出優異的親水性。見圖 4。
2.1.4 體外生物相容性
培養1 d時，ch/PLA復合纖維膜和純PLA纖維膜表面細胞A值相當，差異無統計學意義（P＞0.05）。培養3、7 d時，ch/PLA復合纖維膜表面細胞A值明顯高于純PLA（P＜0.05）。隨培養時間延長，復合纖維膜表面細胞A值不斷增加，培養7 d的細胞A值明顯高于培養1、3 d時（P＜0.05）。見圖 5。
2.2 神經修復動物實驗
2.2.1 大體觀察
術后各組大鼠精神良好，均成活，進食及飲水正常，營養狀況良好，切口愈合良好、無感染。術后3周，A組4只、B組3只、C組7只大鼠開始出現術側足趾潰瘍、脫趾現象。術后4周，3 組大鼠步態明顯跛行；術后8周，A、B組大鼠跛行步態減輕，C組大鼠跛行步態依然明顯；術后12周，A、B組大鼠跛行步態明顯減輕，C組大鼠跛行步態無明顯改善。術后4周開始，各組大鼠術側小腿三頭肌有不同程度萎縮，其中A、B組較輕，C組最重。
2.2.2 SFI檢測
術后4周，3組大鼠SFI比較差異無統計學意義（P＞0.05）。術后8、12周，A、B組SFI優于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A、B組間差異無統計學意義（P＞0.05）。隨著時間延長，A、B組SFI均在不斷恢復，組內各時間點間差異均有統計學意義（P＜0.05）；但C組SFI無明顯改善，組內各時間點間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組大鼠SFI比較（n=6，2.2.3 神經電生理檢測
術后各時間點C組及術后4周A、B組均未檢測出肌電圖表現。術后8 周，A、B組神經傳導速度相似，差異無統計學意義（P＞0.05）；而B組動作電位波幅大于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）。術后12周，A、B組神經傳導速度及動作電位波幅均較8周時明顯提高，差異有統計學意義（P＜0.05）。A組神經傳導速度略高于B組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；但A組動作電位波幅大于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
術后各時間點各組神經電生理檢測（n=6，2.2.4 小腿三頭肌濕重測定
術后4周，3組大鼠術側小腿三頭肌均較健側明顯萎縮，以C組最為明顯。隨時間延長，A、B組大鼠小腿三頭肌逐漸恢復，體積不斷增大，呈鮮紅色；而C組逐漸萎縮，顏色暗紅。術后4、8、12周，A、B組肌肉濕重恢復率均優于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A、B組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。隨時間延長，A、B組的肌肉濕重恢復率均逐漸升高，而C組不斷降低，各組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
術后各時間點各組肌肉濕重恢復率及肌細胞截面積比較（n=6，2.2.5 移植體大體觀察
術后4周，A組新生神經已完全長過神經缺損段，至術后12周導管仍未出現塌陷、變扁等情況。但術后4周A組再生神經較細；術后8周再生神經較前變粗，且在12周時神經直徑進一步增加，再生神經粘連較輕，表面可見豐富的再生血管網。B組移植神經吻合口輕度膨大，并與周圍組織粘連明顯，神經隨時間延長不斷增粗，而粘連程度不斷加重。見圖 6。
圖6
術后各時間點各組移植體大體觀察 ? A組4周 ? A組8周 ? A組12周 ? B組4周 ? B組8周 ? B組12周? ?圖 7 術后12周A、B組肌細胞HE染色觀察（×100） ? A組 ? B組 ? C組
Figure6.
General observation of grafted nerve at 4,8 and 12 weeks postoperatively ? At 4 weeks of group A ? At 8 weeks of group A ? At 12 weeks of group A ? At 4 weeks of group B ? At 8 weeks of group B ? At 12 weeks of group B? ? Fig. 7 Histological observation of myocyte at 12 weeks after operation (HE×100) ? Group A ? Group B ? Group C
2.2.6 組織學觀察
術后4、8周，3組肌細胞截面積比較差異無統計學意義（P＞0.05）。術后12周，A、B組肌細胞截面積均大于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A、B組間差異無統計學意義（P＞0.05）。隨時間延長，A、B組肌細胞截面積均逐漸恢復，C組卻不斷減小，但各組內各時間點間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 3。同時在術后12周可見，A、B組肌細胞形態飽滿，肌纖維豐富，周圍增生組織少；而C組肌細胞萎縮明顯，周圍組織明顯增生。見圖 7。
術后4周，A、B組橫切面均可見新生神經纖維，A組新生神經纖維數量較少，且排列紊亂、發育幼稚；而B組神經纖維排列更為致密、規律。術后8周，A組再生神經纖維內可見形成了大小不等的若干束，神經纖維髓鞘化明顯；B組再生神經纖維較A組排列緊密、整齊。術后12周，A、B組均可見再生神經纖維進一步增多，神經增粗，神經發育形態較前進一步成熟。見圖 8。
圖8
術后各時間點A、B組再生神經HE染色觀察（×200） ? A組4周 ? A組8周 ? A組12周 ? B組4周 ? B組8周 ? B組12周? ?圖 9 術后12周A、B組免疫組織化學染色觀察（DAB×100） ? A組GAP-43 ? B組GAP-43 ? A組NF-160 ? B組NF-160 ? A組S-100 ? B組S-100? ?圖 10 術后12周A、B組透射電鏡觀察（×5 000） ? A組 ? B組
Figure8.
HE-staining observation of regenerating nerve at 4,8 and 12 weeks postoperatively. (×200) ? At 4 weeks of group A ? At 8 weeks of group A ? At 12 weeks of group A ? At 4 weeks of group B ? At 8 weeks of group B ? At 12 weeks of group B? ? Fig. 9 Immunohistological observation at 12 weeks after operation (DAB×100) ? GAP-43 in group A ? GAP-43 in group B ? NF-160 in group A ? NF-160 in group B ? S-100 in group A ? S-100 in group B? ? Fig. 10 TEM observation of group A and group B at 12 weeks after operation (×5 000) ? Group A ? Group B
2.2.7 免疫組織化學染色觀察
① GAP-43：術后4、12周，A組A值略高于B組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；術后8周，A組A值高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。② NF-160：術后4周，A組A值略高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；術后8、12周，A、B組間A值比較差異無統計學意義（P＞0.05）。③ S-100：術后各時間點A、B組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；但A、B兩組隨時間延長，A值均在不斷增加，各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 4～6，圖 9。
表4
術后各時間點各組GAP-43 A值比較（n=6，
表5
術后各時間點各組NF-160 A值比較（n=6，
表6
術后各時間點各組S-100 A值比較（n=6，2.2.8 透射電鏡觀察
術后12周，A、B組均可見大量再生有髓神經纖維和無髓纖維混合，雪旺細胞形態正常，包繞再生軸突形成有髓纖維，大多數髓鞘結構發育良好，呈同心圓板層樣結構，少數為未完全閉合的不成熟髓鞘。見圖 10。
A、B組再生神經纖維直徑分別為（5.67±1.21）、（5.36±1.36）μm，比較差異無統計學意義（t=0.417，P=0.685）；髓鞘厚度分別為（0.95±0.23）、（0.62± 0.19） μm，比較差異有統計學意義（t=2.710，P=0.022）。
3 討論
周圍神經損傷是臨床常見疾患，治療棘手[9]；而自體神經移植的局限性[10-11]使得近年來對神經導管的研究逐漸引人關注[12]。以神經導管修復周圍神經缺損的主要問題是尋求生物學及力學性能均理想的導管材料和完善的制備方法。Chitosan是一種天然多糖類物質，具有良好的生物相容性、生物降解性，并具有抗炎、止血、抗腫瘤和防粘連功能，已被廣泛用于臨床[13-14]。但單純chitosan材料制成的神經導管過于堅硬，不利于手術操作及局部恢復。PLA是一種臨床上常用的人工合成材料，具有良好的生物可降解性和生物相容性，在臨床上也已得到廣泛應用。而純PLA機械強度不足，易于塌陷致使管腔閉鎖、阻礙神經生長，而且其代謝產物呈弱酸性，對周圍組織可能會造成一定刺激[15]。將chitosan與PLA交聯制成復合材料用于制備神經導管，使其兼具良好的機械強度與彈性，在確保手術操作的同時又可起到足夠支撐作用；而且在具有良好生物可降解性和生物相容性同時，不僅弱化了PLA代謝產物的刺激性，還具有一定防粘連、抗炎、抑菌、止血的作用。
靜電紡絲技術是近年來發展起來的一種制備聚合物納米纖維的紡絲工藝，其最大特點是所得到的支架材料具有孔隙率高、纖維直徑小、比表面積大、均一性好等優點，更重要的是所制得的納米纖維能夠從微觀尺度上模仿天然細胞外基質，這使得靜電紡絲在神經導管制備方面有著得天獨厚的優勢。已有研究證實，與溶劑澆鑄法得到的膜材料相比，電紡絲制備的纖維材料能更好地促進雪旺細胞貼附和增殖[16]。同時，通過特定收集裝置可很容易得到取向排列的電紡絲纖維，這種各向異性的物理信號已被證實可有效引導和促進軸突再生[17]。
本課題組首次采用電紡絲與化學交聯方法制作了電紡絲ch/PLA神經導管，制作方法簡便。導管管壁具有有序排列的納米纖維結構，孔隙率高，管腔內為中空結構，可為神經纖維再生起到支撐作用。體外實驗表明導管具有良好的物理性能與生物相容性。術后A、B組大鼠患肢功能均恢復良好，且在SFI、肌肉濕重恢復率、肌細胞截面積與神經傳導速度上，兩組結果相似，均充分說明了導管內神經功能良好；尤其A組動作電位波幅與再生神經髓鞘厚度甚至顯著高于B組，表明A組髓鞘再生良好，這可能與導管的機械支撐和抗炎、防粘連作用有關。術后導管均未出現塌陷、變扁等現象，與周圍組織無明顯粘連，且隨時間延長逐漸吸收，充分說明了神經導管的生物相容性、生物可降解性和防粘連作用，且具有理想的機械強度；鏡下觀察也進一步說明了導管內神經發育良好。S-100免疫組織化學染色示，A組A值雖略低于B組，但差異無統計學意義；GAP-43與NF-160免疫組織化學染色示，A、B組A值相似，透射電鏡也表明A、B組在神經纖維直徑上無明顯差異，說明神經纖維生長良好，這與神經功能恢復有密切聯系。
神經導管修復周圍神經缺損近年來受到研究者廣泛關注。神經導管有足夠的機械強度，可對神經再生起到支撐作用，防止周圍軟組織壓迫阻礙神經再生，這是神經導管修復周圍神經損傷的先決條件。神經近側斷端在順向軸突運輸和周圍組織液的營養作用下，可以以1 mm/d的速度向遠端生長，并最終對患肢的感覺和運動功能起到一定再支配作用。而取向排列的電紡絲纖維、仿生納米微結構以及chitosan的止血、防粘連、抗感染等生物學特性，均可對神經再生起到一定促進作用。神經導管可以橋接修復大鼠坐骨神經8～10 mm缺損[18-19]，并已有病例報道以chitosan/聚乙醇酸神經導管修復患者30 mm長正中神經缺損[20]。
綜上述，通過電紡絲與交聯方法制得的電紡絲ch/PLA神經導管具有良好的生物相容性、生物可降解性與防粘連作用，并可支撐神經生長。該導管可有效修復大鼠坐骨神經缺損，其修復效果與自體神經移植組大體一致。參考自體神經本身擁有的雪旺細胞、神經基底膜、毛細血管和NGF，未來在電紡絲ch/PLA神經導管中，可通過加入細胞組織、神經營養因子等進行深入研究；同時還可以結合臨床，并在將來有可能成為一種治療周圍神經缺損的新方法。
隨著交通與工業的發展，周圍神經損傷患者急劇增加，但其治療一直是醫學界難題。周圍神經損傷不僅可能導致患者生活及工作能力喪失，還會為家庭和社會帶來沉重負擔[1-2]。目前治療神經缺損的常用方法是直接端端吻合和自體神經移植，但功能恢復往往不太滿意，且自體神經移植存在神經來源有限、供區創傷等缺點[3-4]。神經導管是目前周圍神經修復研究的熱點領域，多年來許多研究人員一直致力于探索先進的材料和制備技術，改善神經恢復。早在1944年，Weiss就首先提出了用無縫線導管化方法修復周圍神經損傷；之后于20世紀70年代后期逐漸發展出了人工神經移植技術，即采用生物材料制備神經導管引導并促使神經再生。常用的神經導管材料包括聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙烯醇、聚羥基乙酸等。殼聚糖（chitosan）作為一種較新型導管材料，具有防粘連性、生物可降解性，近年越來越受到關注。既往實驗研究多采用傳統溶劑澆鑄法，顯示了chitosan神經導管良好的生物相容性，并對神經缺損有一定修復作用[5]。為進一步改善神經缺損修復效果，我們首次采用電紡絲與化學交聯方法制作電紡絲chitosan/PLA（ch/PLA）神經導管，并用其修復大鼠坐骨神經缺損，術后通過多種觀測指標與自體神經移植和切除曠置比較，評價其修復效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雌性SD大鼠54只，體重200～250 g，由復旦大學動物實驗中心提供。第2代大鼠雪旺細胞由中國科學院上海細胞庫提供。
Chitosan（上海其勝生物制劑有限公司）；PLA（上海國藥集團化學試劑有限公司）；細胞培養液（中國科學院上海硅酸鹽研究所）。雙通道肌電圖儀（Medtronic KeyPoint公司，丹麥）；R200D電子分析天平（賽多利斯集團，德國）；萬能力學測試機（島津公司，日本）；接觸角測定儀（Krüss Optronic GmbH公司，德國）；LKBNOVA超薄切片機（Bromma公司，瑞典）；JSM-6700F掃描電鏡（JEOL公司，日本）；CM12透射電鏡（Philips公司，荷蘭）。
1.2 ch/PLA神經導管的制作及生物學、理化性能檢測
1.2.1 神經導管制作
將0.8 g PLA溶解于10 mL六氟異丙醇中，室溫下攪拌12 h形成均一穩定的溶液。將PLA溶液放入注射器中，注射器針頭處連接高壓電源。溶液供給流量通過微流泵控制在5 mL/ h，施加電壓為15 kV，高壓端與接地端的距離為15 cm，所使用滾筒直徑為8 cm，旋轉速度為3 000 r/min。通過此過程可收集到直徑約630 nm、厚度約0.2 mm的PLA納米纖維膜。將PLA納米纖維膜浸入濃度為0.6%的chitosan稀醋酸溶液（chitosan數均分子量為5×106，脫乙酰度90%，溶液中醋酸含量為1%）中，取出后自然干燥可得到ch/PLA復合纖維膜，其中chitosan復合量約為26.2%。將得到的ch/PLA復合纖維膜沿垂直于纖維取向方向卷曲成直徑為2 mm的神經導管，并利用二氯甲烷對結合處進行黏結。將上述方法制得的ch/PLA復合神經導管先于室溫下放置12 h，并繼續放入37℃真空烘箱中放置12 h以上以除去殘余溶劑。
1.2.2 神經導管生物學、理化性能檢測
① 掃描電鏡觀察：ch/PLA神經導管制備成功后，采用掃描電鏡對其表面和斷面形貌進行分析。② 生物力學測定：通過萬能力學測試機，對ch/PLA神經導管進行拉伸力學和抗壓力學性能測定[6]，測試其變形量與拉力強度和壓力強度的關系。③ 表面潤濕性測定：采用滴液法，使用接觸角測定儀測定ch/PLA神經導管表面靜態水接觸角，并持續觀察40 s。④ 體外生物相容性檢測：將ch/PLA復合纖維膜剪為直徑1 cm的圓片，用75%乙醇浸泡消毒15 min，再用無菌PBS液沖洗材料并用細胞培養液預濕。隨后將復合纖維膜置于48孔培養板，將第2代大鼠雪旺細胞按1.5×104 個 / 孔密度種植于復合纖維膜上。培養過程中每2天換1 次細胞培養液，培養1、3、7 d后，采用MTT法測試材料表面細胞吸光度（A）值，評價其體外生物相容性。以上檢測均設純PLA纖維為對照。
1.3 實驗分組及方法
取SD大鼠，采用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，于右股后外側行縱切口，自肌間隙進入顯露坐骨神經約2 cm。將大鼠隨機分成3組，每組18只。A組：于坐骨神經中段切取7 mm，任其回縮至10 mm，采用長13 mm、內徑1.5 mm、壁厚0.1 mm的電紡絲ch/PLA神經導管橋接神經缺損，兩端分別套入1.5 mm，以10-0顯微外科縫線3針固定；B組：于坐骨神經中段切取10 mm，即行原位逆行神經移植；C組：于坐骨神經中段切取7 mm，任其回縮至10 mm，神經缺損處曠置處理。所有手術均在顯微鏡下完成，并分別于術后4、8、12周取材檢測。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
術后觀察記錄大鼠足趾潰瘍出現的時間及數量，并觀察大鼠切口愈合情況、精神狀態、營養狀況，有無傷口感染、壓迫性潰瘍和自噬現象等，觀察雙下肢肌肉萎縮程度、行走步態等。
1.4.2 坐骨神經功能指數（sciatic
functional index，SFI）檢測術后4、8、12周每組各取6只大鼠，分別將大鼠后爪浸沾黑色顏料，使大鼠在墊有白紙的狹窄直道內前行，取雙側各3個足印跡，以均數計算SFI[7]。
1.4.3 神經電生理檢測
術后4、8、12周每組各取6只大鼠，按原手術入路暴露。以0.5 mA、0.2 ms、1 Hz的電刺激分別于神經吻合口的近、遠端3 mm處進行刺激，測量動作電位波幅及神經傳導速度。
1.4.4 小腿三頭肌濕重測定
神經電生理檢測完成后頸椎脫臼處死大鼠，取出兩側小腿三頭肌，濾紙吸干表面血液后在電子分析天平上稱重，計算肌肉濕重恢復率[8]。
1.4.5 移植體大體觀察
對于有神經移植體和再生神經的A、B組，觀察吻合口有無神經瘤形成，移植體粗細、顏色、表面血管形成、粘連及導管降解情況。
1.4.6 組織學及免疫組織化學染色觀察
取右小腿三頭肌中部肌肉標本，置入10%甲醛固定48 h，脫水、固定，水平橫向切片（片厚5 μm）、HE染色，觀察神經發育情況。每個標本取5張切片，光鏡下隨機取5 個視野，測量視野中所有肌細胞的截面積，取均值。對于有神經移植體和再生神經的A、B組，取再生神經中段組織同法行HE染色，觀察神經發育情況。之后再取切片（片厚5 μm），分別進行生長相關蛋白43（growth associated protein 43，GAP-43）、神經纖維絲蛋白160亞單位（neurofilaments 160，NF-160）、S-100蛋白免疫組織化學染色，光鏡下觀察陽性表達，并測量各自的A值。
1.4.7 透射電鏡觀察
術后12周，對于有神經移植體和再生神經的A、B組，分別取再生神經中段組織，以4%戊二醛固定24 h以上，再以1%鋨酸固定2 h，環氧樹脂定向包埋，作超薄切片（片厚50 nm）。經醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色后，透射電鏡觀察再生神經纖維和髓鞘發育情況，計算再生神經髓鞘厚度和神經纖維直徑。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差等齊用LSD檢驗，方差不等齊用Dunnett T3檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 神經導管生物學性能及理化性能檢測
2.1.1 掃描電鏡觀察
縱切面觀察示，純PLA纖維表面未見chitosan包裹，孔徑尺寸大，孔隙率高；復合chitosan的ch/PLA神經導管復合纖維較純PLA呈高度取向排列，可明顯觀察到chitosan包裹在PLA纖維表面和纖維之間的空隙內，孔隙率下降。從斷面形貌可以看出，純PLA纖維呈單根有序排列；而ch/PLA復合纖維則呈纖維束形貌，chitosan將幾根PLA纖維包裹成束。見圖 1、2。
圖1
純PLA與的ch/PLA神經導管掃描電鏡縱切面觀察（×20 k） ? 純PLA ? ch/PLA神經導管? ?圖 2 純PLA與ch/PLA神經導管掃描電鏡斷面觀察（×20 k） ? 純PLA ? ch/PLA神經導管? ?圖 3 純PLA與ch/PLA神經導管生物力學測定 ? 抗拉伸力學 ? 抗壓力學? ?圖 4 純PLA與ch/PLA神經導管表面潤濕性檢測? ?圖 5 純PLA與ch/PLA神經導管表面細胞增殖曲線
Figure1.
Ultrastructure on longitudinal section of pure PLA nerve conduits and ch/PLA conduits under scanning electron microscopy (×20 k) ? Pure PLA ? ch/PLA? ? Fig. 2 Ultrastructure on cross section of pure PLA nerve conduits and ch/PLA conduits under scanning electron microscopy (×20 k) ? Pure PLA ? ch/PLA? ? Fig. 3 Biomechanical tests of pure PLA nerve conduits and ch/PLA conduits ? Tensile force ? Compressive stress? ? Fig. 4 Hydrophilisy of pure PLA nerve conduits and ch/PLA conduits? ? Fig. 5 Curve of cell proliferation on the surface of pure PLA nerve conduits and ch/PLA conduits
2.1.2 生物力學檢測
ch/PLA神經導管的拉伸力學強度明顯高于純PLA纖維，其最大拉伸強度為23 MPa，比純PLA纖維的最大拉伸強度11 MPa提高了1倍以上。純PLA纖維幾乎不耐受外部抗壓載荷，當應變為50%時，外部抗壓應力仍為0。而ch/ PLA神經導管在達到50%的應變后，其外部抗壓應力可提高至5 N，表明其抗塌縮能力有很大提高。見圖 3。
2.1.3 表面潤濕性檢測
結果顯示，純PLA纖維的水接觸角為128°，且不隨時間延長而變化。而復合chitosan后，復合纖維膜的水接觸角隨時間延長逐漸降低，其水接觸角在2.5 s內迅速降為0，表現出優異的親水性。見圖 4。
2.1.4 體外生物相容性
培養1 d時，ch/PLA復合纖維膜和純PLA纖維膜表面細胞A值相當，差異無統計學意義（P＞0.05）。培養3、7 d時，ch/PLA復合纖維膜表面細胞A值明顯高于純PLA（P＜0.05）。隨培養時間延長，復合纖維膜表面細胞A值不斷增加，培養7 d的細胞A值明顯高于培養1、3 d時（P＜0.05）。見圖 5。
2.2 神經修復動物實驗
2.2.1 大體觀察
術后各組大鼠精神良好，均成活，進食及飲水正常，營養狀況良好，切口愈合良好、無感染。術后3周，A組4只、B組3只、C組7只大鼠開始出現術側足趾潰瘍、脫趾現象。術后4周，3 組大鼠步態明顯跛行；術后8周，A、B組大鼠跛行步態減輕，C組大鼠跛行步態依然明顯；術后12周，A、B組大鼠跛行步態明顯減輕，C組大鼠跛行步態無明顯改善。術后4周開始，各組大鼠術側小腿三頭肌有不同程度萎縮，其中A、B組較輕，C組最重。
2.2.2 SFI檢測
術后4周，3組大鼠SFI比較差異無統計學意義（P＞0.05）。術后8、12周，A、B組SFI優于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A、B組間差異無統計學意義（P＞0.05）。隨著時間延長，A、B組SFI均在不斷恢復，組內各時間點間差異均有統計學意義（P＜0.05）；但C組SFI無明顯改善，組內各時間點間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組大鼠SFI比較（n=6，2.2.3 神經電生理檢測
術后各時間點C組及術后4周A、B組均未檢測出肌電圖表現。術后8 周，A、B組神經傳導速度相似，差異無統計學意義（P＞0.05）；而B組動作電位波幅大于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）。術后12周，A、B組神經傳導速度及動作電位波幅均較8周時明顯提高，差異有統計學意義（P＜0.05）。A組神經傳導速度略高于B組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；但A組動作電位波幅大于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
術后各時間點各組神經電生理檢測（n=6，2.2.4 小腿三頭肌濕重測定
術后4周，3組大鼠術側小腿三頭肌均較健側明顯萎縮，以C組最為明顯。隨時間延長，A、B組大鼠小腿三頭肌逐漸恢復，體積不斷增大，呈鮮紅色；而C組逐漸萎縮，顏色暗紅。術后4、8、12周，A、B組肌肉濕重恢復率均優于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A、B組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。隨時間延長，A、B組的肌肉濕重恢復率均逐漸升高，而C組不斷降低，各組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
術后各時間點各組肌肉濕重恢復率及肌細胞截面積比較（n=6，2.2.5 移植體大體觀察
術后4周，A組新生神經已完全長過神經缺損段，至術后12周導管仍未出現塌陷、變扁等情況。但術后4周A組再生神經較細；術后8周再生神經較前變粗，且在12周時神經直徑進一步增加，再生神經粘連較輕，表面可見豐富的再生血管網。B組移植神經吻合口輕度膨大，并與周圍組織粘連明顯，神經隨時間延長不斷增粗，而粘連程度不斷加重。見圖 6。
圖6
術后各時間點各組移植體大體觀察 ? A組4周 ? A組8周 ? A組12周 ? B組4周 ? B組8周 ? B組12周? ?圖 7 術后12周A、B組肌細胞HE染色觀察（×100） ? A組 ? B組 ? C組
Figure6.
General observation of grafted nerve at 4,8 and 12 weeks postoperatively ? At 4 weeks of group A ? At 8 weeks of group A ? At 12 weeks of group A ? At 4 weeks of group B ? At 8 weeks of group B ? At 12 weeks of group B? ? Fig. 7 Histological observation of myocyte at 12 weeks after operation (HE×100) ? Group A ? Group B ? Group C
2.2.6 組織學觀察
術后4、8周，3組肌細胞截面積比較差異無統計學意義（P＞0.05）。術后12周，A、B組肌細胞截面積均大于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A、B組間差異無統計學意義（P＞0.05）。隨時間延長，A、B組肌細胞截面積均逐漸恢復，C組卻不斷減小，但各組內各時間點間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 3。同時在術后12周可見，A、B組肌細胞形態飽滿，肌纖維豐富，周圍增生組織少；而C組肌細胞萎縮明顯，周圍組織明顯增生。見圖 7。
術后4周，A、B組橫切面均可見新生神經纖維，A組新生神經纖維數量較少，且排列紊亂、發育幼稚；而B組神經纖維排列更為致密、規律。術后8周，A組再生神經纖維內可見形成了大小不等的若干束，神經纖維髓鞘化明顯；B組再生神經纖維較A組排列緊密、整齊。術后12周，A、B組均可見再生神經纖維進一步增多，神經增粗，神經發育形態較前進一步成熟。見圖 8。
圖8
術后各時間點A、B組再生神經HE染色觀察（×200） ? A組4周 ? A組8周 ? A組12周 ? B組4周 ? B組8周 ? B組12周? ?圖 9 術后12周A、B組免疫組織化學染色觀察（DAB×100） ? A組GAP-43 ? B組GAP-43 ? A組NF-160 ? B組NF-160 ? A組S-100 ? B組S-100? ?圖 10 術后12周A、B組透射電鏡觀察（×5 000） ? A組 ? B組
Figure8.
HE-staining observation of regenerating nerve at 4,8 and 12 weeks postoperatively. (×200) ? At 4 weeks of group A ? At 8 weeks of group A ? At 12 weeks of group A ? At 4 weeks of group B ? At 8 weeks of group B ? At 12 weeks of group B? ? Fig. 9 Immunohistological observation at 12 weeks after operation (DAB×100) ? GAP-43 in group A ? GAP-43 in group B ? NF-160 in group A ? NF-160 in group B ? S-100 in group A ? S-100 in group B? ? Fig. 10 TEM observation of group A and group B at 12 weeks after operation (×5 000) ? Group A ? Group B
2.2.7 免疫組織化學染色觀察
① GAP-43：術后4、12周，A組A值略高于B組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；術后8周，A組A值高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。② NF-160：術后4周，A組A值略高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；術后8、12周，A、B組間A值比較差異無統計學意義（P＞0.05）。③ S-100：術后各時間點A、B組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；但A、B兩組隨時間延長，A值均在不斷增加，各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 4～6，圖 9。
表4
術后各時間點各組GAP-43 A值比較（n=6，
表5
術后各時間點各組NF-160 A值比較（n=6，
表6
術后各時間點各組S-100 A值比較（n=6，2.2.8 透射電鏡觀察
術后12周，A、B組均可見大量再生有髓神經纖維和無髓纖維混合，雪旺細胞形態正常，包繞再生軸突形成有髓纖維，大多數髓鞘結構發育良好，呈同心圓板層樣結構，少數為未完全閉合的不成熟髓鞘。見圖 10。
A、B組再生神經纖維直徑分別為（5.67±1.21）、（5.36±1.36）μm，比較差異無統計學意義（t=0.417，P=0.685）；髓鞘厚度分別為（0.95±0.23）、（0.62± 0.19） μm，比較差異有統計學意義（t=2.710，P=0.022）。
3 討論
周圍神經損傷是臨床常見疾患，治療棘手[9]；而自體神經移植的局限性[10-11]使得近年來對神經導管的研究逐漸引人關注[12]。以神經導管修復周圍神經缺損的主要問題是尋求生物學及力學性能均理想的導管材料和完善的制備方法。Chitosan是一種天然多糖類物質，具有良好的生物相容性、生物降解性，并具有抗炎、止血、抗腫瘤和防粘連功能，已被廣泛用于臨床[13-14]。但單純chitosan材料制成的神經導管過于堅硬，不利于手術操作及局部恢復。PLA是一種臨床上常用的人工合成材料，具有良好的生物可降解性和生物相容性，在臨床上也已得到廣泛應用。而純PLA機械強度不足，易于塌陷致使管腔閉鎖、阻礙神經生長，而且其代謝產物呈弱酸性，對周圍組織可能會造成一定刺激[15]。將chitosan與PLA交聯制成復合材料用于制備神經導管，使其兼具良好的機械強度與彈性，在確保手術操作的同時又可起到足夠支撐作用；而且在具有良好生物可降解性和生物相容性同時，不僅弱化了PLA代謝產物的刺激性，還具有一定防粘連、抗炎、抑菌、止血的作用。
靜電紡絲技術是近年來發展起來的一種制備聚合物納米纖維的紡絲工藝，其最大特點是所得到的支架材料具有孔隙率高、纖維直徑小、比表面積大、均一性好等優點，更重要的是所制得的納米纖維能夠從微觀尺度上模仿天然細胞外基質，這使得靜電紡絲在神經導管制備方面有著得天獨厚的優勢。已有研究證實，與溶劑澆鑄法得到的膜材料相比，電紡絲制備的纖維材料能更好地促進雪旺細胞貼附和增殖[16]。同時，通過特定收集裝置可很容易得到取向排列的電紡絲纖維，這種各向異性的物理信號已被證實可有效引導和促進軸突再生[17]。
本課題組首次采用電紡絲與化學交聯方法制作了電紡絲ch/PLA神經導管，制作方法簡便。導管管壁具有有序排列的納米纖維結構，孔隙率高，管腔內為中空結構，可為神經纖維再生起到支撐作用。體外實驗表明導管具有良好的物理性能與生物相容性。術后A、B組大鼠患肢功能均恢復良好，且在SFI、肌肉濕重恢復率、肌細胞截面積與神經傳導速度上，兩組結果相似，均充分說明了導管內神經功能良好；尤其A組動作電位波幅與再生神經髓鞘厚度甚至顯著高于B組，表明A組髓鞘再生良好，這可能與導管的機械支撐和抗炎、防粘連作用有關。術后導管均未出現塌陷、變扁等現象，與周圍組織無明顯粘連，且隨時間延長逐漸吸收，充分說明了神經導管的生物相容性、生物可降解性和防粘連作用，且具有理想的機械強度；鏡下觀察也進一步說明了導管內神經發育良好。S-100免疫組織化學染色示，A組A值雖略低于B組，但差異無統計學意義；GAP-43與NF-160免疫組織化學染色示，A、B組A值相似，透射電鏡也表明A、B組在神經纖維直徑上無明顯差異，說明神經纖維生長良好，這與神經功能恢復有密切聯系。
神經導管修復周圍神經缺損近年來受到研究者廣泛關注。神經導管有足夠的機械強度，可對神經再生起到支撐作用，防止周圍軟組織壓迫阻礙神經再生，這是神經導管修復周圍神經損傷的先決條件。神經近側斷端在順向軸突運輸和周圍組織液的營養作用下，可以以1 mm/d的速度向遠端生長，并最終對患肢的感覺和運動功能起到一定再支配作用。而取向排列的電紡絲纖維、仿生納米微結構以及chitosan的止血、防粘連、抗感染等生物學特性，均可對神經再生起到一定促進作用。神經導管可以橋接修復大鼠坐骨神經8～10 mm缺損[18-19]，并已有病例報道以chitosan/聚乙醇酸神經導管修復患者30 mm長正中神經缺損[20]。
綜上述，通過電紡絲與交聯方法制得的電紡絲ch/PLA神經導管具有良好的生物相容性、生物可降解性與防粘連作用，并可支撐神經生長。該導管可有效修復大鼠坐骨神經缺損，其修復效果與自體神經移植組大體一致。參考自體神經本身擁有的雪旺細胞、神經基底膜、毛細血管和NGF，未來在電紡絲ch/PLA神經導管中，可通過加入細胞組織、神經營養因子等進行深入研究；同時還可以結合臨床，并在將來有可能成為一種治療周圍神經缺損的新方法。
