引用本文： 崔兆輝, 滕元君, 姜金, 夏亞一, 汪靜, 安麗萍, 馬靖琳, 萬麟. Sonic Hedgehog信號通路在成年大鼠脊髓損傷后的表達. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(5): 576-581. doi: 10.7507/1002-1892.20150125 復制
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是機體經歷的一次復雜原發性損傷與繼發性損傷的序貫過程，最終造成不同程度的神經元細胞和神經膠質細胞凋亡、壞死、軸突斷裂、脫髓鞘等病理改變[1]。脊髓內微環境改變及星形膠質細胞反應性增生對軸突再生形成的物理屏障，使神經修復非常困難。近年來，神經干細胞（neural stem cells，NSCs）的發現及研究為SCI后的治療策略提供了廣闊前景。當前對于NSCs的研究主要集中在分子學領域，闡明有關NSCs調控途徑的分子機制對今后的臨床治療具有重要意義。
Sonic Hedgehog（Shh）信號通路是動物胚胎發育過程中調控細胞增殖和組織分化的重要信號通路之一[2]，其異常激活能導致消化道、泌尿道及婦產腫瘤等多種腫瘤的發生[3-7]。有研究顯示，Shh、Gli-1（Glioma-associated oncogene homolog-1）蛋白與星形膠質細胞增殖有關[8]；在氧化應激條件下，星形膠質細胞分泌的Shh參與了神經保護作用[9]。目前，SCI后星形膠質細胞能否表達Shh、Gli-1等信號分子，能否重新激活Shh信號通路尚缺乏報道。因此，我們擬通過驗證大鼠SCI后Shh信號通路成分Shh、Gli-1的表達，觀察其表達規律及意義。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級健康雄性SD大鼠64只，體重（230± 20） g，由蘭州大學動物實驗中心提供。
Triton X-100溶液（北京索萊寶科技有限公司）；山羊血清原液、BrdU試劑（上海碧云天生物技術有限公司）；OCT組織包埋劑（SAKURA公司，美國）；小鼠抗大鼠BrdU多克隆抗體，小鼠抗大鼠Shh多克隆抗體、小鼠抗大鼠Gli-1多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；兔抗大鼠神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）多克隆抗體、兔抗小鼠BrdU二抗、小鼠抗兔GFAP二抗、小鼠抗兔MBP二抗、兔抗小鼠Shh二抗、兔抗小鼠Gli-1二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；RT-PCR試劑盒、引物（寶生物工程大連有限公司）。
電子精密天平、電泳儀（北京醫用設備公司）；pH值測量儀（ThermoOrion公司，美國）；超速離心機（Bechman公司，美國）；電熱恒溫水槽、恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；超純水制備系統（USFELGA公司，美國）；移液槍（Dragon-lab公司，美國）；高溫高壓滅菌鍋（力康生物醫療科技控股有限公司）；磁力攪拌器（IKA公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；恒溫搖床（上海一恒科學儀器有限公司）；孵育用濕盒（武漢博士德生物工程有限公司）；冰凍切片機（Leica公司，德國）；實時熒光定量PCR儀（Ambion公司，美國）；凝膠成像系統（Ultra-Violet Products公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
取SD大鼠，使用隨機數字表法隨機分為正常組（A組，8只）、假手術組（B組，8只）和SCI組（C組，48只）。A組大鼠不作任何處理。B、C組大鼠采用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，作背部正中切口3～4 cm，逐層切開皮膚、皮下組織及深筋膜，分離兩側椎旁肌肉，顯露T7～9節段椎體。B組大鼠僅咬開椎板，不作損傷處理。C組大鼠用微型咬骨鉗咬除兩側棘突及椎板，充分暴露脊髓約1.5 cm；制作改良后Allen垂直打擊模型，以5 g×5 cm的致傷力損傷脊髓，造模成功標志為大鼠脊髓出血水腫，雙下肢回縮樣撲動并出現尾部痙攣性擺動，使大鼠呈現遲緩性癱瘓[10]。術后縫合傷口徹底止血，注射抗生素預防術后感染，每日定時擠壓膀胱，直至大鼠恢復自主排尿。C組于術后12 h及1、3、7、14、21 d分別取8只大鼠進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 行為學檢查
取A、B組及C組各時間點大鼠，參照BBB評分標準[11]評估大鼠后肢運動恢復情況。
1.3.2 免疫熒光染色觀察
取A、B組及C組各時間點大鼠，同上法麻醉后暴露胸腔找到心臟，鈍角針頭由左心室進入主動脈瓣膜，并剪開右心耳使血液流出；首先使用200 mL溫生理鹽水快速沖洗，然后用4%多聚甲醛緩慢灌注1～2 h。灌注完畢，取損傷節段及上下0.2 cm處脊髓，30%蔗糖脫水，OCT包埋后制作20 μm厚冰凍切片。0.3%Triton X-100和5%山羊血清室溫封閉30 min，加入兔抗大鼠GFAP一抗（1∶100），小鼠抗大鼠Shh、Gli-1一抗（1∶100），4℃過夜，PBS洗3遍，每次10 min；然后使用FITC標記小鼠抗兔GFAP二抗，羅丹明標記兔抗小鼠Shh、Gli-1二抗（均為1∶200），37℃孵育2 h，貼片后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。PBS代替一抗作陰性對照。
1.3.3 實時熒光定量PCR檢測
取A、B組及C組各時間點大鼠，同上法麻醉取損傷節段脊髓。按RNA抽提純化手冊進行操作，Trizol試劑提取組織總RNA并逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行各基因的PCR擴增。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，Shh上游5'-CCGAACGATTTAAGG-AACTCAC-3'，下游5'-TGTCTTTGCACCTCTGAGT-CAT-3'；Gli-1上游5'-TCTGCTGACTCTGGGATA-TG-3'，下游5'-GATCAGGATAGGAGCCTGCTG-3'；內參β-actin上游5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'。測定標準曲線及熔解曲線，采用2-ΔΔCt計算各基因mRNA相對表達量。
1.3.4 Western
blot檢測取A、B組及C組各時間點大鼠，同上法麻醉取損傷節段脊髓。提取細胞總蛋白，按照試劑盒操作步驟分別提取細胞質蛋白與細胞核蛋白。BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，加入5×Loading Buffer緩沖液并于100℃煮沸5 min，- 80℃保存。SDS-PAGE電泳蛋白分離后電轉印至聚偏氟乙烯膜；5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Shh、Gli-1一抗（1∶1 000）、全細胞及細胞質蛋白內參β-actin一抗（1∶800）、細胞核蛋白內參Histone一抗（1∶800），4℃過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育2 h，ECL發光液顯色，凝膠成像系統拍照。采用Image J軟件進行灰度值分析。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 行為學評分
A、B組大鼠BBB評分均為約21分。C組大鼠SCI后可觀察到明顯的神經功能缺損癥狀，表現為肢體活動遲緩、肌力下降，雙下肢功能缺失，飲食減少等現象；隨SCI時間延長，7 d時可觀察到大鼠后肢1、2個關節輕微活動；21 d可出現牽拉后輕微的肢體攣縮反應，但無協調步態。C組BBB評分隨時間延長緩慢升高，但各時間點BBB評分均顯著低于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1。
圖1
各時間點各組大鼠后肢功能BBB評分
Figure1.
The hindlimb function BBB score of rats in each group at different time points
2.2 免疫熒光染色觀察
A、B組大鼠可觀察到少量Shh、Gli-1蛋白；C組大鼠SCI后Shh、Gli-1蛋白表達隨時間延長明顯增多，術后7 d達峰值，隨后緩慢下降。高倍鏡下觀察可見，A、B組Shh、Gli-1蛋白少量存在于細胞質與細胞核中；C組SCI后Shh與Gli-1蛋白明顯增多，大量Gli-1蛋白集中分布于細胞核內。見圖 2～5。
圖2
術后各時間點各組星形膠質細胞內Shh分布（×200） ? A組 ? B組 ? C組12 h ? C組1 d ? C組3 d ? C組7 d ? C組14 d ? C組21 d? ?圖 3 術后各時間點各組星形膠質細胞內Gli-1分布（×200） ? A組 ? B組 ? C組12 h ? C組1 d ? C組3 d ? C組7 d ? C組14 d ? C組21 d
Figure2.
Expression of Shh protein in each group after SCI at different time points (×200) Group ? A Group ? B Group ? C at 12 hours Group ? C at 1 day Group ? C at 3 days Group ? C at 7 days Group ? C at 14 days Group ? C at 21 days? ? Fig. 3 Expression of Gli-1 protein in each group after SCI at different time points (×200) Group ? A Group ? B Group ? C at 12 hours Group ? C at 1 day Group ? C at 3 days Group ? C at 7 days Group ? C at 14 days Group ? C at 21 days
圖4
各組星形膠質細胞內Shh分布（×400） ? A組 ? B組 ? C組7 d? ?圖 5 各組星形膠質細胞內Gli-1分布（×400） ? A組 ? B組 ? C組7 d? ?圖 6 實時熒光定量PCR檢測C組各時間點Shh、Gli-1 mRNA相對表達量 ? ?圖 7 Western blot檢測各組各時間點Shh、Gli-1蛋白表達 1：A組 2：B組 3：C組12 h 4：C組1 d 5：C組3 d 6：C組7 d 7：C組14 d 8：C組21 d? ?圖 8 Western blot檢測C組各時間點Shh、Gli-1蛋白表達量? ?圖 9 A組與C組SCI后7 d Gli-1蛋白在細胞質與細胞核表達的變化 1：A組細胞質 2：C組7 d細胞質 3：A組細胞核 4：C組7 d細胞核
Figure4.
Expression of Shh protein in astrocytes in each group (×400) ? Group A ? Group B ? Group C at 7 days? ? Fig. 5 Expression of Gli-1 protein in astrocytes in each group (×400) ? Group A ? Group B ? Group C at 7 days? ? Fig. 6 The relative expressions of Shh and Gli-1 mRNA in group C at each time point by real-time PCR? ? Fig. 7 Expressions of Shh and Gli-1 proteins in each group by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C at 12 hours 4: Group C at 1 day 5: Group C at 3 days 6: Group C at 7 days 7: Group C at 14 days 8: Group C at 21 days? ? Fig. 8 Expressions of Shh and Gli-1 proteins in group C at each time point by Western blot? ? Fig. 9 Dynamic changes of Gli-1 protein in the cytoplasm and nucleus in group A and group C at 7 days 1: Group A in cytoplasm 2: Group C at 7 days in cytoplasm 3: Group A in nucleus 4: Group C at 7 days in nucleus
2.3 實時熒光定量PCR檢測
A、B組Shh mRNA相對表達量分別為1.21±0.21、1.26±0.19，Gli-1 mRNA相對表達量分別為1.13±0.15、1.28±0.17，兩組差異無統計學意義（P＞0.05）。C組SCI后Shh、Gli-1 mRNA相對表達量明顯增高，僅3 d時Gli-1 mRNA表達有一過性降低，Shh、Gli-1 mRNA相對表達量在7 d時均達最大值，21 d仍處于高水平表達。C組各時間點Shh、Gli-1 mRNA相對表達量均顯著高于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6。
2.4 Western blot檢測
A、B組Shh蛋白表達量分別為0.51±0.12、0.62±0.18，Gli-1蛋白表達量分別為0.43±0.09、0.52±0.14，兩組差異無統計學意義（P＞0.05）。C組SCI后各時間點Shh、Gli-1蛋白均高度表達，并在7 d時達最大值；各時間點Shh、Gli-1蛋白表達量均顯著高于A、B組（P＜0.05）。此外，相對于A組，C組SCI后Gli-1蛋白在細胞質中表達減少，細胞核中表達增加，呈現出“核轉移”現象。見圖 7～9。
3 討論
早在1928年，神經解剖學專家Cajal就首次提出，神經細胞的再生與其所處微環境密切相關，若能提供適宜的微環境，神經細胞能夠再生[12]。隨后眾多研究均證實，在一定條件下神經細胞具備再生能力。提示神經細胞不能再生可能是因為它們賴以生存的微環境受到破壞，受損微環境無法支持神經元再生。當前的細胞遺傳學觀點認為，細胞內微環境中的外源性信號和內部的遺傳機制共同決定了神經干細胞的分化方向。Johansson等[13]研究發現，處于發育期的神經干細胞聚居的微環境中可觀察到多種信號通路表達，這些信號通路成分的表達變化可能對神經干細胞的增殖分化方向具有重要意義。
1980年Hedgehog基因在果蠅的基因突變篩選時首次被發現，在哺乳動物主要包括Shh、Dhh、Ihh 3個Hedgehog同源體，其中Shh信號通路在脊椎動物的胚胎發育過程中發揮著重要作用[14]。Shh信號通路是一個高度保守的中軸器官形態通路，主要包括分泌蛋白Shh、跨膜受體Ptch、跨膜蛋白Smo和核轉錄因子Gli-1、2、3 四種信號分子。在無Shh信號傳導時，Ptch與Smo結合從而抑制Smo的活性及細胞表面定位，使Shh信號通路處于失活狀態；而當Shh跨膜蛋白與受體Ptch結合后，Smo的抑制被解除因而進入細胞質，引發細胞質內Gli以蛋白復合體形式（Cos2-Fused-Su-Gli）被轉導，激活的Gli以全長形態進入細胞核，啟動靶基因的轉錄[15]。
早期觀點普遍認為，Shh信號通路在成年動物處于沉默狀態；但近年研究發現，Shh信號通路可在多種來源于內胚層的組織中異常激活，這種異常激活導致了組織中細胞的持續性損傷修復與再生，由于持續再生的細胞抵抗力較弱，易受到致癌因素的侵襲而誘發腫瘤形成，如基底細胞癌、前列腺癌、胃腸道癌、胰腺癌、乳腺癌等發生[3-7]。研究表明這種持續性損傷修復機制還可見于神經細胞，Sims等[16]發現局灶性腦缺血后Shh、Gli-1在大鼠海馬齒狀回顆粒下區的表達有明顯增多。也有研究顯示，側腦室注射人重組Shh可促進Shh信號途徑的激活，從而降低腦缺血后腦水腫程度，保護血腦屏障，減少梗死面積[17]。本實驗中，免疫熒光染色結果表明，SCI后星形膠質細胞可分泌大量Shh、Gli-1信號分子；實時熒光定量PCR與Western blot檢測示，Shh在正常大鼠中表現為低度表達，SCI后Shh表達顯著上調，7 d達最大值，并在21 d仍處于高水平表達狀態（P＜0.05），這與先前實驗[18]所觀察到的SCI后內源性神經前體細胞的增殖分化規律具有高度一致性，我們猜測Shh可能參與了SCI后神經修復的調控作用。此外，Shh信號通路分子Shh、Gli-1等是否僅由星形膠質細胞分泌，或仍有其他膠質細胞/神經元參與，將會成為我們下一步實驗的重點。
作為Shh信號通路中的轉錄因子，3種Gli同源性基因Gli-1、2、3發揮著不同核轉錄激活或抑制功能，其中Gli-1具有激活功能，Gli-2、3則同時具有轉錄激活與抑制活性[19-20]。許多研究表明，Gli-1在許多腫瘤性疾病中有顯著異常表達，而進一步研究發現，Gli-1不僅參與Shh信號通路的發生，也受到Costal2蛋白、Fused激酶等某些上游蛋白以及KRAS、HAN11等其他信號通路的調控[21-23]。本實驗中我們觀察到，Gli-1與Shh有較為一致的表達趨勢，正常情況下Gli-1表達較少，SCI后Gli-1表達顯著增多并在7 d達峰值。此外，我們觀察到Gli-1蛋白在細胞質與細胞核表達的變化趨勢，Gli-1蛋白在SCI后發生了明顯的“核轉移”現象，均提示Gli可能在SCI后神經細胞的修復中發揮作用。值得一提的是，Gli-1在SCI后3 d表達量有一過性降低，此時正值水腫高峰期，是否由于脊髓發生水腫等因素抑制了Gli-1的表達，或是受到其他信號通路的抑制而降低，尚需要進一步研究。
綜上述，SCI后星形膠質細胞分泌Shh、Gli-1等信號分子，Shh、Gli-1在SCI后7 d達峰值，并在21 d仍處于高水平表達，提示Shh信號通路可能參與了SCI后的神經修復調控作用；關于介導Shh信號分子調控的細胞及具體調控機制還需進一步研究。
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是機體經歷的一次復雜原發性損傷與繼發性損傷的序貫過程，最終造成不同程度的神經元細胞和神經膠質細胞凋亡、壞死、軸突斷裂、脫髓鞘等病理改變[1]。脊髓內微環境改變及星形膠質細胞反應性增生對軸突再生形成的物理屏障，使神經修復非常困難。近年來，神經干細胞（neural stem cells，NSCs）的發現及研究為SCI后的治療策略提供了廣闊前景。當前對于NSCs的研究主要集中在分子學領域，闡明有關NSCs調控途徑的分子機制對今后的臨床治療具有重要意義。
Sonic Hedgehog（Shh）信號通路是動物胚胎發育過程中調控細胞增殖和組織分化的重要信號通路之一[2]，其異常激活能導致消化道、泌尿道及婦產腫瘤等多種腫瘤的發生[3-7]。有研究顯示，Shh、Gli-1（Glioma-associated oncogene homolog-1）蛋白與星形膠質細胞增殖有關[8]；在氧化應激條件下，星形膠質細胞分泌的Shh參與了神經保護作用[9]。目前，SCI后星形膠質細胞能否表達Shh、Gli-1等信號分子，能否重新激活Shh信號通路尚缺乏報道。因此，我們擬通過驗證大鼠SCI后Shh信號通路成分Shh、Gli-1的表達，觀察其表達規律及意義。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級健康雄性SD大鼠64只，體重（230± 20） g，由蘭州大學動物實驗中心提供。
Triton X-100溶液（北京索萊寶科技有限公司）；山羊血清原液、BrdU試劑（上海碧云天生物技術有限公司）；OCT組織包埋劑（SAKURA公司，美國）；小鼠抗大鼠BrdU多克隆抗體，小鼠抗大鼠Shh多克隆抗體、小鼠抗大鼠Gli-1多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；兔抗大鼠神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）多克隆抗體、兔抗小鼠BrdU二抗、小鼠抗兔GFAP二抗、小鼠抗兔MBP二抗、兔抗小鼠Shh二抗、兔抗小鼠Gli-1二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；RT-PCR試劑盒、引物（寶生物工程大連有限公司）。
電子精密天平、電泳儀（北京醫用設備公司）；pH值測量儀（ThermoOrion公司，美國）；超速離心機（Bechman公司，美國）；電熱恒溫水槽、恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；超純水制備系統（USFELGA公司，美國）；移液槍（Dragon-lab公司，美國）；高溫高壓滅菌鍋（力康生物醫療科技控股有限公司）；磁力攪拌器（IKA公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；恒溫搖床（上海一恒科學儀器有限公司）；孵育用濕盒（武漢博士德生物工程有限公司）；冰凍切片機（Leica公司，德國）；實時熒光定量PCR儀（Ambion公司，美國）；凝膠成像系統（Ultra-Violet Products公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
取SD大鼠，使用隨機數字表法隨機分為正常組（A組，8只）、假手術組（B組，8只）和SCI組（C組，48只）。A組大鼠不作任何處理。B、C組大鼠采用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，作背部正中切口3～4 cm，逐層切開皮膚、皮下組織及深筋膜，分離兩側椎旁肌肉，顯露T7～9節段椎體。B組大鼠僅咬開椎板，不作損傷處理。C組大鼠用微型咬骨鉗咬除兩側棘突及椎板，充分暴露脊髓約1.5 cm；制作改良后Allen垂直打擊模型，以5 g×5 cm的致傷力損傷脊髓，造模成功標志為大鼠脊髓出血水腫，雙下肢回縮樣撲動并出現尾部痙攣性擺動，使大鼠呈現遲緩性癱瘓[10]。術后縫合傷口徹底止血，注射抗生素預防術后感染，每日定時擠壓膀胱，直至大鼠恢復自主排尿。C組于術后12 h及1、3、7、14、21 d分別取8只大鼠進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 行為學檢查
取A、B組及C組各時間點大鼠，參照BBB評分標準[11]評估大鼠后肢運動恢復情況。
1.3.2 免疫熒光染色觀察
取A、B組及C組各時間點大鼠，同上法麻醉后暴露胸腔找到心臟，鈍角針頭由左心室進入主動脈瓣膜，并剪開右心耳使血液流出；首先使用200 mL溫生理鹽水快速沖洗，然后用4%多聚甲醛緩慢灌注1～2 h。灌注完畢，取損傷節段及上下0.2 cm處脊髓，30%蔗糖脫水，OCT包埋后制作20 μm厚冰凍切片。0.3%Triton X-100和5%山羊血清室溫封閉30 min，加入兔抗大鼠GFAP一抗（1∶100），小鼠抗大鼠Shh、Gli-1一抗（1∶100），4℃過夜，PBS洗3遍，每次10 min；然后使用FITC標記小鼠抗兔GFAP二抗，羅丹明標記兔抗小鼠Shh、Gli-1二抗（均為1∶200），37℃孵育2 h，貼片后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。PBS代替一抗作陰性對照。
1.3.3 實時熒光定量PCR檢測
取A、B組及C組各時間點大鼠，同上法麻醉取損傷節段脊髓。按RNA抽提純化手冊進行操作，Trizol試劑提取組織總RNA并逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行各基因的PCR擴增。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，Shh上游5'-CCGAACGATTTAAGG-AACTCAC-3'，下游5'-TGTCTTTGCACCTCTGAGT-CAT-3'；Gli-1上游5'-TCTGCTGACTCTGGGATA-TG-3'，下游5'-GATCAGGATAGGAGCCTGCTG-3'；內參β-actin上游5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'。測定標準曲線及熔解曲線，采用2-ΔΔCt計算各基因mRNA相對表達量。
1.3.4 Western
blot檢測取A、B組及C組各時間點大鼠，同上法麻醉取損傷節段脊髓。提取細胞總蛋白，按照試劑盒操作步驟分別提取細胞質蛋白與細胞核蛋白。BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，加入5×Loading Buffer緩沖液并于100℃煮沸5 min，- 80℃保存。SDS-PAGE電泳蛋白分離后電轉印至聚偏氟乙烯膜；5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Shh、Gli-1一抗（1∶1 000）、全細胞及細胞質蛋白內參β-actin一抗（1∶800）、細胞核蛋白內參Histone一抗（1∶800），4℃過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育2 h，ECL發光液顯色，凝膠成像系統拍照。采用Image J軟件進行灰度值分析。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 行為學評分
A、B組大鼠BBB評分均為約21分。C組大鼠SCI后可觀察到明顯的神經功能缺損癥狀，表現為肢體活動遲緩、肌力下降，雙下肢功能缺失，飲食減少等現象；隨SCI時間延長，7 d時可觀察到大鼠后肢1、2個關節輕微活動；21 d可出現牽拉后輕微的肢體攣縮反應，但無協調步態。C組BBB評分隨時間延長緩慢升高，但各時間點BBB評分均顯著低于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1。
圖1
各時間點各組大鼠后肢功能BBB評分
Figure1.
The hindlimb function BBB score of rats in each group at different time points
2.2 免疫熒光染色觀察
A、B組大鼠可觀察到少量Shh、Gli-1蛋白；C組大鼠SCI后Shh、Gli-1蛋白表達隨時間延長明顯增多，術后7 d達峰值，隨后緩慢下降。高倍鏡下觀察可見，A、B組Shh、Gli-1蛋白少量存在于細胞質與細胞核中；C組SCI后Shh與Gli-1蛋白明顯增多，大量Gli-1蛋白集中分布于細胞核內。見圖 2～5。
圖2
術后各時間點各組星形膠質細胞內Shh分布（×200） ? A組 ? B組 ? C組12 h ? C組1 d ? C組3 d ? C組7 d ? C組14 d ? C組21 d? ?圖 3 術后各時間點各組星形膠質細胞內Gli-1分布（×200） ? A組 ? B組 ? C組12 h ? C組1 d ? C組3 d ? C組7 d ? C組14 d ? C組21 d
Figure2.
Expression of Shh protein in each group after SCI at different time points (×200) Group ? A Group ? B Group ? C at 12 hours Group ? C at 1 day Group ? C at 3 days Group ? C at 7 days Group ? C at 14 days Group ? C at 21 days? ? Fig. 3 Expression of Gli-1 protein in each group after SCI at different time points (×200) Group ? A Group ? B Group ? C at 12 hours Group ? C at 1 day Group ? C at 3 days Group ? C at 7 days Group ? C at 14 days Group ? C at 21 days
圖4
各組星形膠質細胞內Shh分布（×400） ? A組 ? B組 ? C組7 d? ?圖 5 各組星形膠質細胞內Gli-1分布（×400） ? A組 ? B組 ? C組7 d? ?圖 6 實時熒光定量PCR檢測C組各時間點Shh、Gli-1 mRNA相對表達量 ? ?圖 7 Western blot檢測各組各時間點Shh、Gli-1蛋白表達 1：A組 2：B組 3：C組12 h 4：C組1 d 5：C組3 d 6：C組7 d 7：C組14 d 8：C組21 d? ?圖 8 Western blot檢測C組各時間點Shh、Gli-1蛋白表達量? ?圖 9 A組與C組SCI后7 d Gli-1蛋白在細胞質與細胞核表達的變化 1：A組細胞質 2：C組7 d細胞質 3：A組細胞核 4：C組7 d細胞核
Figure4.
Expression of Shh protein in astrocytes in each group (×400) ? Group A ? Group B ? Group C at 7 days? ? Fig. 5 Expression of Gli-1 protein in astrocytes in each group (×400) ? Group A ? Group B ? Group C at 7 days? ? Fig. 6 The relative expressions of Shh and Gli-1 mRNA in group C at each time point by real-time PCR? ? Fig. 7 Expressions of Shh and Gli-1 proteins in each group by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C at 12 hours 4: Group C at 1 day 5: Group C at 3 days 6: Group C at 7 days 7: Group C at 14 days 8: Group C at 21 days? ? Fig. 8 Expressions of Shh and Gli-1 proteins in group C at each time point by Western blot? ? Fig. 9 Dynamic changes of Gli-1 protein in the cytoplasm and nucleus in group A and group C at 7 days 1: Group A in cytoplasm 2: Group C at 7 days in cytoplasm 3: Group A in nucleus 4: Group C at 7 days in nucleus
2.3 實時熒光定量PCR檢測
A、B組Shh mRNA相對表達量分別為1.21±0.21、1.26±0.19，Gli-1 mRNA相對表達量分別為1.13±0.15、1.28±0.17，兩組差異無統計學意義（P＞0.05）。C組SCI后Shh、Gli-1 mRNA相對表達量明顯增高，僅3 d時Gli-1 mRNA表達有一過性降低，Shh、Gli-1 mRNA相對表達量在7 d時均達最大值，21 d仍處于高水平表達。C組各時間點Shh、Gli-1 mRNA相對表達量均顯著高于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6。
2.4 Western blot檢測
A、B組Shh蛋白表達量分別為0.51±0.12、0.62±0.18，Gli-1蛋白表達量分別為0.43±0.09、0.52±0.14，兩組差異無統計學意義（P＞0.05）。C組SCI后各時間點Shh、Gli-1蛋白均高度表達，并在7 d時達最大值；各時間點Shh、Gli-1蛋白表達量均顯著高于A、B組（P＜0.05）。此外，相對于A組，C組SCI后Gli-1蛋白在細胞質中表達減少，細胞核中表達增加，呈現出“核轉移”現象。見圖 7～9。
3 討論
早在1928年，神經解剖學專家Cajal就首次提出，神經細胞的再生與其所處微環境密切相關，若能提供適宜的微環境，神經細胞能夠再生[12]。隨后眾多研究均證實，在一定條件下神經細胞具備再生能力。提示神經細胞不能再生可能是因為它們賴以生存的微環境受到破壞，受損微環境無法支持神經元再生。當前的細胞遺傳學觀點認為，細胞內微環境中的外源性信號和內部的遺傳機制共同決定了神經干細胞的分化方向。Johansson等[13]研究發現，處于發育期的神經干細胞聚居的微環境中可觀察到多種信號通路表達，這些信號通路成分的表達變化可能對神經干細胞的增殖分化方向具有重要意義。
1980年Hedgehog基因在果蠅的基因突變篩選時首次被發現，在哺乳動物主要包括Shh、Dhh、Ihh 3個Hedgehog同源體，其中Shh信號通路在脊椎動物的胚胎發育過程中發揮著重要作用[14]。Shh信號通路是一個高度保守的中軸器官形態通路，主要包括分泌蛋白Shh、跨膜受體Ptch、跨膜蛋白Smo和核轉錄因子Gli-1、2、3 四種信號分子。在無Shh信號傳導時，Ptch與Smo結合從而抑制Smo的活性及細胞表面定位，使Shh信號通路處于失活狀態；而當Shh跨膜蛋白與受體Ptch結合后，Smo的抑制被解除因而進入細胞質，引發細胞質內Gli以蛋白復合體形式（Cos2-Fused-Su-Gli）被轉導，激活的Gli以全長形態進入細胞核，啟動靶基因的轉錄[15]。
早期觀點普遍認為，Shh信號通路在成年動物處于沉默狀態；但近年研究發現，Shh信號通路可在多種來源于內胚層的組織中異常激活，這種異常激活導致了組織中細胞的持續性損傷修復與再生，由于持續再生的細胞抵抗力較弱，易受到致癌因素的侵襲而誘發腫瘤形成，如基底細胞癌、前列腺癌、胃腸道癌、胰腺癌、乳腺癌等發生[3-7]。研究表明這種持續性損傷修復機制還可見于神經細胞，Sims等[16]發現局灶性腦缺血后Shh、Gli-1在大鼠海馬齒狀回顆粒下區的表達有明顯增多。也有研究顯示，側腦室注射人重組Shh可促進Shh信號途徑的激活，從而降低腦缺血后腦水腫程度，保護血腦屏障，減少梗死面積[17]。本實驗中，免疫熒光染色結果表明，SCI后星形膠質細胞可分泌大量Shh、Gli-1信號分子；實時熒光定量PCR與Western blot檢測示，Shh在正常大鼠中表現為低度表達，SCI后Shh表達顯著上調，7 d達最大值，并在21 d仍處于高水平表達狀態（P＜0.05），這與先前實驗[18]所觀察到的SCI后內源性神經前體細胞的增殖分化規律具有高度一致性，我們猜測Shh可能參與了SCI后神經修復的調控作用。此外，Shh信號通路分子Shh、Gli-1等是否僅由星形膠質細胞分泌，或仍有其他膠質細胞/神經元參與，將會成為我們下一步實驗的重點。
作為Shh信號通路中的轉錄因子，3種Gli同源性基因Gli-1、2、3發揮著不同核轉錄激活或抑制功能，其中Gli-1具有激活功能，Gli-2、3則同時具有轉錄激活與抑制活性[19-20]。許多研究表明，Gli-1在許多腫瘤性疾病中有顯著異常表達，而進一步研究發現，Gli-1不僅參與Shh信號通路的發生，也受到Costal2蛋白、Fused激酶等某些上游蛋白以及KRAS、HAN11等其他信號通路的調控[21-23]。本實驗中我們觀察到，Gli-1與Shh有較為一致的表達趨勢，正常情況下Gli-1表達較少，SCI后Gli-1表達顯著增多并在7 d達峰值。此外，我們觀察到Gli-1蛋白在細胞質與細胞核表達的變化趨勢，Gli-1蛋白在SCI后發生了明顯的“核轉移”現象，均提示Gli可能在SCI后神經細胞的修復中發揮作用。值得一提的是，Gli-1在SCI后3 d表達量有一過性降低，此時正值水腫高峰期，是否由于脊髓發生水腫等因素抑制了Gli-1的表達，或是受到其他信號通路的抑制而降低，尚需要進一步研究。
綜上述，SCI后星形膠質細胞分泌Shh、Gli-1等信號分子，Shh、Gli-1在SCI后7 d達峰值，并在21 d仍處于高水平表達，提示Shh信號通路可能參與了SCI后的神經修復調控作用；關于介導Shh信號分子調控的細胞及具體調控機制還需進一步研究。
