引用本文： 薛珂, 張小蝶, 劉凱. 三種亞型軟骨組織來源干細胞的分離培養及鑒定. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(4): 483-489. doi: 10.7507/1002-1892.20150104 復制
各種疾病和創傷造成的軟骨缺損修復是臨床難題[1-3]，軟骨組織工程為軟骨組織缺損修復提供了一種新方法[4-5]。軟骨組織工程包括3大要素：種子細胞、支架材料、誘導環境[6]。其中，種子細胞成為制約軟骨組織工程臨床應用的關鍵因素之一。軟骨細胞是首先用于軟骨組織工程研究的種子細胞，但存在來源有限、體外培養增殖較慢、容易去分化等缺點，不是理想的種子細胞選擇[7]。而干細胞具有取材簡便、增殖能力強、具備多向分化潛能等優點，以BMSCs為主的成體干細胞逐漸被學者們關注，利用BMSCs或脂肪來源MSCs構建組織工程軟骨修復軟骨缺損成為研究熱點[8-10]。然而，進一步研究發現將BMSCs分化獲得的軟骨細胞移植至裸鼠皮下存在“血管化”、“骨化”等問題[11-12]。此外，利用脂肪、滑膜以及骨膜來源干細胞構建的組織工程軟骨同樣面臨軟骨表型不穩定等缺陷[13-15]。因此，這些干細胞不能成為軟骨組織工程理想種子細胞。近來有研究報道，軟骨組織中存在一群具有干細胞特性的細胞，可能成為軟骨缺損修復的理想種子細胞[16-18]。本實驗旨在從不同亞型軟骨組織中分離軟骨來源干細胞，檢測其細胞特性，以期為軟骨組織工程提供理想種子細胞。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
纖維連接蛋白、anti-CD29、anti-CD34、anti-CD45、anti-CD90、地塞米松、β-磷酸甘油、L-抗壞血酸-2-磷酸酯、甲基異丁基黃嘌呤、吲哚美辛、茜素紅、油紅O、甲苯胺藍，重組人IGF （R&D公司，美國）；L-DMEM、H-DMEM、EDTA-胰蛋白酶(GIBCO公司，美國)；FBS (HyClone公司，美國)；Trizol試劑盒（Life Technologies公司，美國）。倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）。
1.2 軟骨來源干細胞和BMSCs分離培養
取豬耳、關節及椎間盤組織（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物實驗室），無菌條件下分離耳軟骨（彈性軟骨）、關節軟骨（透明軟骨）及椎間盤軟骨（纖維軟骨），切成1 mm×1 mm×1 mm大小，氯霉素浸泡30 min，PBS沖洗3次。置于0.2%Ⅱ型膠原酶，于37℃搖床中消化6～8 h，200目濾網過濾去除未消化組織，PBS重懸后接種于預先用纖維連接蛋白處理的100 mm培養皿中，20 min后去除未貼壁細胞和培養液，PBS沖洗培養皿3次，已經貼壁細胞即為軟骨來源干細胞。當細胞達80%～90%融合時，吸棄培養液，0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA（1∶1）消化細胞并傳代，以后隔天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況。
無菌條件下取豬髂骨骨髓，置于無菌離心管中，以離心半徑16 cm、1 500 r/min離心20 min。取沉淀，用含10%FBS的L-DMEM培養液重懸，輕輕吹打成單細胞懸液，接種于培養皿中，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，3 d 后更換培養液。當細胞達80%～90%融合時，吸棄培養液，0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA（1∶1）消化細胞并傳代，以后隔天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況。
1.3 觀測指標
1.3.1 流式細胞術鑒定
用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化收集細胞前3代不同亞型軟骨組織來源干細胞，PBS清洗3次，PBS重懸制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個/mL。分別加入anti-CD29、anti-CD34、anti-CD45、anti-CD90抗體，不加抗體作為空白對照。室溫下避光孵育30 min，每10分鐘搖晃1次。PBS清洗3次，PBS重懸，流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達水平。
1.3.2 克隆形成實驗
取第3代不同亞型軟骨組織來源干細胞，用200目濾網過濾，接種至100 mm培養皿上，每個培養皿接種500個細胞。搖勻培養皿，使細胞均勻分布在培養皿上。于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養2周，倒置相差顯微鏡下觀察克隆形成情況。
1.3.3 成骨誘導分化
取第3代不同亞型軟骨組織來源干細胞，以50 000個/孔接種至6孔板，用含10%FBS的L-DMEM于37℃、5%CO2條件下培養，24 h待細胞貼壁后，更換為成骨誘導培養基（含10%FBS、1×10-7 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油和50 μmol/L L-抗壞血酸-2-磷酸酯的H-DMEM）。隔天換液，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況，誘導16 d后行茜素紅染色。吸棄培養液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。PBS沖洗3次，茜素紅染液染色15 min，PBS漂洗3次至棕紅色。鏡下觀察礦化結節形成，紅色為陽性染色。
1.3.4 成脂肪誘導分化
同1.3.3方法培養細胞，待細胞貼壁后，更換為成脂誘導培養基（含10%FBS、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和200 μmol/L吲哚美辛的H-DMEM）。隔天換液，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況，誘導14 d后行油紅O染色。吸棄原培養液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。PBS沖洗3次，加入油紅O染液（0.5%油紅異內醇∶水=3:2）染色15 min，PBS漂洗3次。鏡下觀察脂滴形成，脂滴為橙紅色為陽性染色。
1.3.5 成軟骨誘導分化
同1.3.3方法培養細胞，待細胞貼壁后，更換為成軟骨誘導培養基（含10%FBS、1×10-7 mol/L地塞米松、50 μmol/L L-抗壞血酸-2-磷酸酯和40 ng/mL重組人IGF的H-DMEM）。隔天換液，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況，誘導14 d后行甲苯胺藍染色。吸棄培養液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。PBS沖洗3次，加入甲苯胺藍染液染色30 min，PBS漂洗3次。鏡下觀察細胞，藍色為陽性染色。
1.3.6 RT-PCR檢測
取1.3.3、1.3.4及1.3.5中經成骨（16 d）、成脂（14 d）、成軟骨（14 d）誘導后細胞，檢測成骨（Ⅰ型膠原、X型膠原）、成軟骨[蛋白聚糖（Aggrecan）、Ⅱ型膠原]、成脂[脂聯素(Adiponectin)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)]基因表達。以第3代豬BMSCs同上法成骨、成脂、成軟骨誘導后作為對照。用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，進行逆轉錄，按逆轉錄試劑盒一步法獲得cDNA。取cDNA 1 μL，分別加入上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL、2×PCR Taq Mix 12.5 μL，補足超純水至25 μL。PCR擴增條件：95℃預變性3 min，94℃變性20 s，退火20 s，72℃延伸15 s，循環30次。GAPDH作為內參。制備濃度為2.0%瓊脂糖凝膠，對PCR產物進行電泳，結束后對各電泳條帶吸光度（A）值進行分析。引物序列及產物大小見表 1。
表1
RT-PCR引物序列及產物大小
Table1.
The primer sequence and product size for RT-PCR
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨組織來源干細胞形態及克隆實驗觀察
通過纖維連結蛋白黏附法分別從豬耳軟骨、關節軟骨、椎間盤軟骨分離出一群細胞。關節軟骨和椎間盤軟骨來源干細胞形態介于多角形和長梭形之間，呈短梭形；耳軟骨來源干細胞在低密度培養時呈短梭形，高密度培養時呈小圓形。傳代后，不同來源的細胞均向短梭形變化。見圖 1。三種亞型軟骨組織來源的干細胞體外培養2周后，均能形成單細胞克隆（圖 2）。
圖1
細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40） 從左至右分別為第1代、第2代、第3代細胞耳軟骨來源干細胞關節軟骨來源干細胞椎間盤軟骨來源干細胞? ?圖 2 細胞克隆形成觀察耳軟骨來源干細胞關節軟骨來源干細胞椎間盤軟骨來源干細胞? ?圖 3 流式細胞術檢測細胞表面標志物 CD29 CD90 CD45 CD34
Figure1.
Cell morphology (inverted phase contrast microscope ×40) From left to right for cells at passage 1,passage 2 and passage 3 respectively Auricular cartilage derived stem cells Articular cartilage derived stem cells Intervertebral disc cartilage-derived stem cells? ? Fig. 2 Cell colony formation Auricular cartilage derived stem cells Articular cartilage derived stem cells Intervertebral disc cartilage-derived stem cells? ? Fig. 3 The cell surface markers by flow cytometry analysis CD29 CD90 CD45 CD34
2.2 流式細胞術檢測
分離獲得的細胞均高表達干細胞陽性標志物CD29、CD90，幾乎不表達干細胞陰性標志物CD45、CD34。細胞傳至第3代時，從不同軟骨組織中分離出的干細胞仍能保持較高的陽性標志物表達率。見圖 3。
2.3 成骨、成脂、成軟骨誘導鑒定
不同亞型軟骨組織來源干細胞觀察情況一致。成骨誘導后，隨時間延長，細胞內顆粒逐漸增多，細胞間鈣質沉積；16 d時茜素紅染色可見紅褐色鈣結節。成脂誘導后，細胞內出現脂滴；14 d時油紅O染色可見明顯紅色脂滴。成軟骨誘導后，細胞由短梭形或小圓形變成多角形；14 d時甲苯胺藍染色呈陽性。見圖 4。
圖4
不同亞型軟骨組織來源干細胞誘導培養觀察（×40） 從左至右分別為耳軟骨、關節軟骨、椎間盤軟骨來源干細胞茜素紅染色油紅O染色甲苯胺藍染色? ?圖 5 RT-PCR檢測成骨、成軟骨及成脂相關基因表達水平 Ⅰ型膠原 Ⅹ型膠原 Ⅱ型膠原 Aggrecan Adiponectin FAS
Figure4.
Osteocytic,adipocytic,and chondrogenic differentiation observation (×40) From left to right for auricular cartilage-derived stem cells,articular cartilage-derived stem cells,and intervertebral disc cartilage-derived stem cells,respectively Alizarin Red staining Oil red O staining Toluidine blue staining? ? Fig. 5 The relative expressions of osteogenic,chondrogenic,and adipogenic genes by RT-PCR Collagen type Ⅰ Collagen type X Collagen type ⅠI Aggrecan Adiponectin FAS
2.4 RT-PCR檢測
成骨誘導后，關節和椎間盤軟骨來源干細胞中Ⅰ、Ⅹ型膠原基因相對表達量明顯高于BMSCs，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；耳軟骨來源干細胞與BMSCs比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。成軟骨誘導后，3種亞型軟骨組織來源干細胞中Aggrecan、II型膠原基因相對表達量均高于BMSCs，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而成脂誘導后Adiponectin及FAS基因相對表達量均低于BMSCs，但比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 5。
3 討論
研究表明，軟骨組織中存在一群具有多向分化潛能的干細胞，有望成為軟骨缺損修復的理想種子細胞[16-18]。本研究中，我們初步從3種亞型軟骨組織（彈性軟骨、透明軟骨、纖維軟骨）分離軟骨組織來源干細胞。由于干細胞可以特異性高表達纖維連結蛋白的受體--整聯蛋白(integrin)，我們利用纖維連結蛋白黏附法從豬耳軟骨、關節軟骨和椎間盤軟骨組織中成功分離出一群軟骨細胞。干細胞表面標志物是判斷一種細胞是否具有干細胞特性的重要指標，我們選擇了干細胞陽性表面標志物CD29 、CD90以及干細胞陰性表面標志物CD45、CD34對分離細胞進行檢測。結果顯示，通過纖維連接蛋白黏附法分離獲得的細胞，其干細胞陽性表面標志物表達率均在90%以上，這表明這群細胞具有干細胞特性[19-20]。同時，細胞傳至第3代時仍能保持較高表達率，提示軟骨來源干細胞可以為軟骨組織工程提供充足的種子細胞。
單克隆形成能力和多向分化潛能是干細胞基本特征之一，為此我們進行了單克隆形成能力和多向分化潛能實驗[21-22]，以進一步驗證從軟骨組織中分離獲得的細胞其干細胞特性。我們各取500個3種亞型軟骨組織來源干細胞，分別接種至100 mm培養皿中，培養2周后發現這些細胞可以形成單克隆。三向誘導分化實驗結果表明，細胞可以向骨、軟骨、脂肪分化，進一步明確其干細胞特性。
綜上述，3種亞型軟骨組織來源干細胞既具備干細胞特性，又具備軟骨細胞的特性，可能會成為軟骨組織工程中替代BMSCs的理想種子細胞。
各種疾病和創傷造成的軟骨缺損修復是臨床難題[1-3]，軟骨組織工程為軟骨組織缺損修復提供了一種新方法[4-5]。軟骨組織工程包括3大要素：種子細胞、支架材料、誘導環境[6]。其中，種子細胞成為制約軟骨組織工程臨床應用的關鍵因素之一。軟骨細胞是首先用于軟骨組織工程研究的種子細胞，但存在來源有限、體外培養增殖較慢、容易去分化等缺點，不是理想的種子細胞選擇[7]。而干細胞具有取材簡便、增殖能力強、具備多向分化潛能等優點，以BMSCs為主的成體干細胞逐漸被學者們關注，利用BMSCs或脂肪來源MSCs構建組織工程軟骨修復軟骨缺損成為研究熱點[8-10]。然而，進一步研究發現將BMSCs分化獲得的軟骨細胞移植至裸鼠皮下存在“血管化”、“骨化”等問題[11-12]。此外，利用脂肪、滑膜以及骨膜來源干細胞構建的組織工程軟骨同樣面臨軟骨表型不穩定等缺陷[13-15]。因此，這些干細胞不能成為軟骨組織工程理想種子細胞。近來有研究報道，軟骨組織中存在一群具有干細胞特性的細胞，可能成為軟骨缺損修復的理想種子細胞[16-18]。本實驗旨在從不同亞型軟骨組織中分離軟骨來源干細胞，檢測其細胞特性，以期為軟骨組織工程提供理想種子細胞。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
纖維連接蛋白、anti-CD29、anti-CD34、anti-CD45、anti-CD90、地塞米松、β-磷酸甘油、L-抗壞血酸-2-磷酸酯、甲基異丁基黃嘌呤、吲哚美辛、茜素紅、油紅O、甲苯胺藍，重組人IGF （R&D公司，美國）；L-DMEM、H-DMEM、EDTA-胰蛋白酶(GIBCO公司，美國)；FBS (HyClone公司，美國)；Trizol試劑盒（Life Technologies公司，美國）。倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）。
1.2 軟骨來源干細胞和BMSCs分離培養
取豬耳、關節及椎間盤組織（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物實驗室），無菌條件下分離耳軟骨（彈性軟骨）、關節軟骨（透明軟骨）及椎間盤軟骨（纖維軟骨），切成1 mm×1 mm×1 mm大小，氯霉素浸泡30 min，PBS沖洗3次。置于0.2%Ⅱ型膠原酶，于37℃搖床中消化6～8 h，200目濾網過濾去除未消化組織，PBS重懸后接種于預先用纖維連接蛋白處理的100 mm培養皿中，20 min后去除未貼壁細胞和培養液，PBS沖洗培養皿3次，已經貼壁細胞即為軟骨來源干細胞。當細胞達80%～90%融合時，吸棄培養液，0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA（1∶1）消化細胞并傳代，以后隔天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況。
無菌條件下取豬髂骨骨髓，置于無菌離心管中，以離心半徑16 cm、1 500 r/min離心20 min。取沉淀，用含10%FBS的L-DMEM培養液重懸，輕輕吹打成單細胞懸液，接種于培養皿中，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，3 d 后更換培養液。當細胞達80%～90%融合時，吸棄培養液，0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA（1∶1）消化細胞并傳代，以后隔天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況。
1.3 觀測指標
1.3.1 流式細胞術鑒定
用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化收集細胞前3代不同亞型軟骨組織來源干細胞，PBS清洗3次，PBS重懸制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個/mL。分別加入anti-CD29、anti-CD34、anti-CD45、anti-CD90抗體，不加抗體作為空白對照。室溫下避光孵育30 min，每10分鐘搖晃1次。PBS清洗3次，PBS重懸，流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達水平。
1.3.2 克隆形成實驗
取第3代不同亞型軟骨組織來源干細胞，用200目濾網過濾，接種至100 mm培養皿上，每個培養皿接種500個細胞。搖勻培養皿，使細胞均勻分布在培養皿上。于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養2周，倒置相差顯微鏡下觀察克隆形成情況。
1.3.3 成骨誘導分化
取第3代不同亞型軟骨組織來源干細胞，以50 000個/孔接種至6孔板，用含10%FBS的L-DMEM于37℃、5%CO2條件下培養，24 h待細胞貼壁后，更換為成骨誘導培養基（含10%FBS、1×10-7 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油和50 μmol/L L-抗壞血酸-2-磷酸酯的H-DMEM）。隔天換液，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況，誘導16 d后行茜素紅染色。吸棄培養液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。PBS沖洗3次，茜素紅染液染色15 min，PBS漂洗3次至棕紅色。鏡下觀察礦化結節形成，紅色為陽性染色。
1.3.4 成脂肪誘導分化
同1.3.3方法培養細胞，待細胞貼壁后，更換為成脂誘導培養基（含10%FBS、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和200 μmol/L吲哚美辛的H-DMEM）。隔天換液，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況，誘導14 d后行油紅O染色。吸棄原培養液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。PBS沖洗3次，加入油紅O染液（0.5%油紅異內醇∶水=3:2）染色15 min，PBS漂洗3次。鏡下觀察脂滴形成，脂滴為橙紅色為陽性染色。
1.3.5 成軟骨誘導分化
同1.3.3方法培養細胞，待細胞貼壁后，更換為成軟骨誘導培養基（含10%FBS、1×10-7 mol/L地塞米松、50 μmol/L L-抗壞血酸-2-磷酸酯和40 ng/mL重組人IGF的H-DMEM）。隔天換液，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況，誘導14 d后行甲苯胺藍染色。吸棄培養液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。PBS沖洗3次，加入甲苯胺藍染液染色30 min，PBS漂洗3次。鏡下觀察細胞，藍色為陽性染色。
1.3.6 RT-PCR檢測
取1.3.3、1.3.4及1.3.5中經成骨（16 d）、成脂（14 d）、成軟骨（14 d）誘導后細胞，檢測成骨（Ⅰ型膠原、X型膠原）、成軟骨[蛋白聚糖（Aggrecan）、Ⅱ型膠原]、成脂[脂聯素(Adiponectin)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)]基因表達。以第3代豬BMSCs同上法成骨、成脂、成軟骨誘導后作為對照。用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，進行逆轉錄，按逆轉錄試劑盒一步法獲得cDNA。取cDNA 1 μL，分別加入上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL、2×PCR Taq Mix 12.5 μL，補足超純水至25 μL。PCR擴增條件：95℃預變性3 min，94℃變性20 s，退火20 s，72℃延伸15 s，循環30次。GAPDH作為內參。制備濃度為2.0%瓊脂糖凝膠，對PCR產物進行電泳，結束后對各電泳條帶吸光度（A）值進行分析。引物序列及產物大小見表 1。
表1
RT-PCR引物序列及產物大小
Table1.
The primer sequence and product size for RT-PCR
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨組織來源干細胞形態及克隆實驗觀察
通過纖維連結蛋白黏附法分別從豬耳軟骨、關節軟骨、椎間盤軟骨分離出一群細胞。關節軟骨和椎間盤軟骨來源干細胞形態介于多角形和長梭形之間，呈短梭形；耳軟骨來源干細胞在低密度培養時呈短梭形，高密度培養時呈小圓形。傳代后，不同來源的細胞均向短梭形變化。見圖 1。三種亞型軟骨組織來源的干細胞體外培養2周后，均能形成單細胞克隆（圖 2）。
圖1
細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40） 從左至右分別為第1代、第2代、第3代細胞耳軟骨來源干細胞關節軟骨來源干細胞椎間盤軟骨來源干細胞? ?圖 2 細胞克隆形成觀察耳軟骨來源干細胞關節軟骨來源干細胞椎間盤軟骨來源干細胞? ?圖 3 流式細胞術檢測細胞表面標志物 CD29 CD90 CD45 CD34
Figure1.
Cell morphology (inverted phase contrast microscope ×40) From left to right for cells at passage 1,passage 2 and passage 3 respectively Auricular cartilage derived stem cells Articular cartilage derived stem cells Intervertebral disc cartilage-derived stem cells? ? Fig. 2 Cell colony formation Auricular cartilage derived stem cells Articular cartilage derived stem cells Intervertebral disc cartilage-derived stem cells? ? Fig. 3 The cell surface markers by flow cytometry analysis CD29 CD90 CD45 CD34
2.2 流式細胞術檢測
分離獲得的細胞均高表達干細胞陽性標志物CD29、CD90，幾乎不表達干細胞陰性標志物CD45、CD34。細胞傳至第3代時，從不同軟骨組織中分離出的干細胞仍能保持較高的陽性標志物表達率。見圖 3。
2.3 成骨、成脂、成軟骨誘導鑒定
不同亞型軟骨組織來源干細胞觀察情況一致。成骨誘導后，隨時間延長，細胞內顆粒逐漸增多，細胞間鈣質沉積；16 d時茜素紅染色可見紅褐色鈣結節。成脂誘導后，細胞內出現脂滴；14 d時油紅O染色可見明顯紅色脂滴。成軟骨誘導后，細胞由短梭形或小圓形變成多角形；14 d時甲苯胺藍染色呈陽性。見圖 4。
圖4
不同亞型軟骨組織來源干細胞誘導培養觀察（×40） 從左至右分別為耳軟骨、關節軟骨、椎間盤軟骨來源干細胞茜素紅染色油紅O染色甲苯胺藍染色? ?圖 5 RT-PCR檢測成骨、成軟骨及成脂相關基因表達水平 Ⅰ型膠原 Ⅹ型膠原 Ⅱ型膠原 Aggrecan Adiponectin FAS
Figure4.
Osteocytic,adipocytic,and chondrogenic differentiation observation (×40) From left to right for auricular cartilage-derived stem cells,articular cartilage-derived stem cells,and intervertebral disc cartilage-derived stem cells,respectively Alizarin Red staining Oil red O staining Toluidine blue staining? ? Fig. 5 The relative expressions of osteogenic,chondrogenic,and adipogenic genes by RT-PCR Collagen type Ⅰ Collagen type X Collagen type ⅠI Aggrecan Adiponectin FAS
2.4 RT-PCR檢測
成骨誘導后，關節和椎間盤軟骨來源干細胞中Ⅰ、Ⅹ型膠原基因相對表達量明顯高于BMSCs，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；耳軟骨來源干細胞與BMSCs比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。成軟骨誘導后，3種亞型軟骨組織來源干細胞中Aggrecan、II型膠原基因相對表達量均高于BMSCs，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而成脂誘導后Adiponectin及FAS基因相對表達量均低于BMSCs，但比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 5。
3 討論
研究表明，軟骨組織中存在一群具有多向分化潛能的干細胞，有望成為軟骨缺損修復的理想種子細胞[16-18]。本研究中，我們初步從3種亞型軟骨組織（彈性軟骨、透明軟骨、纖維軟骨）分離軟骨組織來源干細胞。由于干細胞可以特異性高表達纖維連結蛋白的受體--整聯蛋白(integrin)，我們利用纖維連結蛋白黏附法從豬耳軟骨、關節軟骨和椎間盤軟骨組織中成功分離出一群軟骨細胞。干細胞表面標志物是判斷一種細胞是否具有干細胞特性的重要指標，我們選擇了干細胞陽性表面標志物CD29 、CD90以及干細胞陰性表面標志物CD45、CD34對分離細胞進行檢測。結果顯示，通過纖維連接蛋白黏附法分離獲得的細胞，其干細胞陽性表面標志物表達率均在90%以上，這表明這群細胞具有干細胞特性[19-20]。同時，細胞傳至第3代時仍能保持較高表達率，提示軟骨來源干細胞可以為軟骨組織工程提供充足的種子細胞。
單克隆形成能力和多向分化潛能是干細胞基本特征之一，為此我們進行了單克隆形成能力和多向分化潛能實驗[21-22]，以進一步驗證從軟骨組織中分離獲得的細胞其干細胞特性。我們各取500個3種亞型軟骨組織來源干細胞，分別接種至100 mm培養皿中，培養2周后發現這些細胞可以形成單克隆。三向誘導分化實驗結果表明，細胞可以向骨、軟骨、脂肪分化，進一步明確其干細胞特性。
綜上述，3種亞型軟骨組織來源干細胞既具備干細胞特性，又具備軟骨細胞的特性，可能會成為軟骨組織工程中替代BMSCs的理想種子細胞。
