引用本文： 戴麗冰, 劉志河, 梁偉國, 姚依村, 徐家科, 葉冬平, 鄒隆強, 沈雁. 維生素C對TNF-α及血清剝奪誘導的人髓核細胞凋亡的作用. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(4): 490-497. doi: 10.7507/1002-1892.20150105 復制
椎間盤是人體最大的無血運組織，主要靠其上下的軟骨終板滲透等被動擴散方式獲得營養，營養相對缺乏，且髓核細胞自我修復能力低。目前研究表明[1]，椎間盤退變是多種因素協同作用的結果，多因素作用下髓核細胞的過度凋亡使得細胞外基質合成減少和成分改變，從而導致椎間盤發生退行性變，可見髓核細胞凋亡是椎間盤退變的病理基礎之一。研究表明[2]，人正常髓核細胞凋亡率為28%，而退變椎間盤中髓核細胞凋亡率高達53%～73%，其中炎性反應及營養環境在椎間盤退變中發揮重要作用。
Esteban等[3]研究表明，細胞培養過程中加入維生素C（Vitamin C，Vit C）可顯著增加小鼠和人類誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）集落形成，緩解細胞衰老，得到高質量的iPSCs，增強機體細胞的重編程，增加綠色熒光蛋白/ALP比率。Vit C可抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）活性，從而使iPSCs誘導效率提升；Vit C還可降低P53蛋白含量，從而利于iPSCs前體細胞向iPSCs轉化[4]；其對TNF-α引起的充血性心力衰竭的心肌細胞凋亡有一定延緩作用[5]。但Vit C能否抑制或延緩TNF-α及血清剝奪誘導的髓核細胞凋亡罕見報道。本研究以髓核細胞為研究對象，探討Vit C抑制或延緩TNF-α及血清剝奪誘導髓核細胞凋亡的作用，以期為Vit C預防、延緩及治療椎間盤退變奠定實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞、主要試劑及儀器
實驗用髓核細胞來源于中山大學附屬第一醫院脊柱側彎中心7例行脊柱矯形手術患者的髓核組織，患者年齡7～16歲，平均12.3歲；排除惡性腫瘤和神經系統病史，術后病理檢查結果均為正常椎間盤。本研究均獲患者本人及家屬知情同意，并通過了廣州市紅十字會醫院倫理委員會批準。
Vit C注射液（2 mL∶0.5 g；廣州白云山天心制藥股份有限公司）；TNF-α（R&D公司，美國）；H-DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；100×青-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液、Ⅱ型膠原酶、CY3標記的羊抗兔IgG （Sigma公司，美國）；兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體（Abcam公司，英國）；兔抗人缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1 α，HIF-1α）多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；膜聯蛋白V（Annexin V）-FITC /碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；逆轉錄試劑盒（Promega公司，美國）。
25 cm2細胞培養瓶（Corning公司，美國）；Ther mo 8000DH型CO2培養箱（Thermo scientific公司，美國）；Ti-u倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；HC-3018R高速冷凍離心機（安徽科大創新股份有限公司）；ABI 3900臺式高通量DNA合成儀、ABI 9700 PCR儀、ABI 7500全自動熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）；流式細胞儀（B&D公司，美國）；熒光顯微鏡系統、數碼彩色CCD攝像機、顯微圖像分析系統（Zeiss公司，德國）。
1.2 椎間盤髓核細胞分離培養及鑒定
參考Kluba等[6]方法分離培養髓核細胞。用眼科剪將髓核組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小后，放入盛有10 mL 2%Ⅱ型膠原酶的100 mL燒杯中，磁力攪拌器攪拌約1 h，待組織完全溶解；加入等體積含10%FBS的H-DMEM培養基中止，以離心半徑9 cm、1 200 r/min離心10 min；棄上清，重懸細胞，按1×106個/mL接種至25 cm2細胞培養瓶，加入含10%FBS的H-DMEM培養基6～8 mL，于37℃、5%CO2孵箱中培養；3 d后倒置相差顯微鏡觀察細胞貼壁生長情況；隔天換液，10～14 d當細胞接近90%融合時行傳代擴增。
采用Ⅱ型膠原、HIF-1α免疫熒光細胞化學染色進行髓核細胞表型鑒定[7]。取第3代細胞以1×104 個/mL密度接種于表面涂有多聚賴氨酸的消毒蓋玻片上，每片接種2 mL，于37℃、5%CO2孵箱中培養24 h，收集細胞爬片，4%多聚甲醛固定液固定30 min，0.3%Triton X-100浸泡15 min破細胞膜，微波修復，非免疫山羊血清封閉，分別各加入1∶200稀釋的兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體和兔抗人HIF-1α多克隆抗體100 μL，0.02 mmol/L PBS替代抗體作為陰性對照，置4℃冰箱濕盒過夜；第2天加入1∶50稀釋的CY3標記羊抗兔IgG 100 μL、30 min，熒光顯微鏡系統、數碼彩色CCD攝像機及顯微圖像分析系統觀察。
1.3 實驗分組及方法
取第3代髓核細胞，按5×105個/mL 密度接種至含10%FBS、H-DMEM培養基的25 cm2細胞培養瓶中，第2天根據不同處理因素分為Vit C作用組（A組）、TNF-α誘導組（B組）和血清剝奪組（C組），基礎培養液為含8%FBS的H-DMEM培養基，37℃、5%CO2孵箱培養24 h，A組添加Vit C預作用24 h。每組再分為3個亞組：A組分為A1組（僅為基礎培養液），A2組（加入100 μg/mL Vit C），A3組（加入200 μg/mL Vit C）；B組分為B0組（對照組）、B1組（加入100 ng/mL TNF-α）、B2組（加入100 μg/ mL Vit C和100 ng/mL TNF-α）、B3組（加入200 μg/mL Vit C和100 ng/mL TNF-α）；C組分為C0組（對照組）、C1組（更換為含2%FBS的H-DMEM培養液）、C2組（含2%FBS的H-DMEM培養液及100 μg/ mL Vit C）、C3組（含2%FBS的H-DMEM培養液及200 μg/ mL Vit C）。
1.4 檢測指標
1.4.1 倒置相差顯微鏡觀察
取B1組和C1組分別干預24 h的細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態、體積、折光性的改變。
1.4.2 流式細胞術檢測細胞凋亡
髓核細胞按各組因素處理24 h中止，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化制成細胞懸浮液，以離心半徑9 cm、2 000 r/min離心5 min，PBS緩沖液洗滌細胞2次。在細胞懸液中加入5 μL AnnexinⅤ-FITC，混勻，2～8℃避光孵育15 min；加入10 μL PI后同上條件再孵育5 min，流式細胞術檢測各組AnnexinⅤ、PI雙染后髓核細胞UR/LR象限（早期凋亡及晚期凋亡）的凋亡百分率。實驗重復3次，取均值。
1.4.3 實時熒光定量PCR檢測細胞凋亡相關基因mRNA表達
采用實時熒光定量PCR檢測p53（基因編碼相對分子質量為53×103的蛋白質）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3）、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Sox9和糖胺多糖（Aggrecan）mRNA表達（B、C組未檢測Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Sox9 mRNA表達）。取4 μL RNA為逆轉錄模板，按一步法RT-PCR試劑盒說明書提取總RNA并進行擴增，逆轉錄反應體系為20 μL，PCR反應體系為50 μL。引物設計與合成：于GenBank數據庫中獲得目的基因mRNA序列，采用Primer express2.0軟件在CDS區設計特異性引物。引物序列及擴增產物長度見表 1。RT-PCR反應條件：逆轉錄反應37℃、45 min，95℃、3 min；PCR初始變性94℃、2 min，變性94℃、15 s，退火55℃、25 s，延伸72℃、25 s，40個循環；最終延伸65℃、10 min。反應結束后由電腦自動分析并計算結果，同時設無模板對照，每份標本重復3次，取均值；以目的基因與內參基因β-actin的比值作為mRNA相對表達量。
表1
目的基因序列及擴增產物長度
Table1.
The primer sequence and amplified product size
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 髓核細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代培養10～14 d細胞呈短梭多角形，放射狀排列并融合成單層；第3代細胞培養5～7 d時接近融合，細胞排列紊亂（圖 1 a）。B1組細胞經TNF-α誘導24 h及C1組細胞經血清剝奪24 h后，倒置相差顯微鏡下觀察示細胞變圓，體積縮小甚至脫壁；C1組細胞折光性低于B1組（圖 1 b、c）。第3代正常髓核細胞經Ⅱ型膠原和HIF-1α免疫熒光細胞化學染色鑒定細胞表型均呈陽性，Ⅱ型膠原和HIF-1α均在細胞質表達，具有類軟骨細胞表型特征（圖 2）
圖1
髓核細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 第3 代正常髓核細胞 ? B1組細胞 C1組細胞? ?圖 2 第3 代正常髓核細胞免疫熒光細胞化學染色鑒定（熒光倒置顯微鏡×100） ? II型膠原 ? HIF-1α ? ?圖 3 不同濃度Vit C對髓核細胞凋亡的影響 ? A1組 ? A2組 ? A3組? ?圖 4 不同濃度Vit C對TNF-α誘導的髓核細胞凋亡影響 ? B1組 ? B2組 ? B3組? ?圖 5 不同濃度Vit C對血清剝奪誘導的髓核細胞凋亡影響 ? C1組 ? C2組 ? C3組
Figure1.
Morphology observation of NP cells (Inverted phase contrast microscope×100) ? NP cells at 3rd passage ? NP cells cultured with TNF-α in B1 subgroup NP cells cultured with serum deprivation in C1 sub group? ? Fig. 2 Immunocytochemistry staining of NP cells (Fluorescent inverted microscope×100) ? Collagen type ⅠI ? HIF-1α? ? Fig. 3 Effect of Vit C on the apoptosis rate of NP cells ? A1 subgroup ? A2 subgroup ? A3 subgroup? ? Fig. 4 Effect of Vit C on the apoptosis rate of NP cells induced by TNF-α ? B1 subgroup ? B2 subgroup ? B3 subgroup? ? Fig. 5 Effect of Vit C on the apoptosis rate of NP cells induced by serum deprivation ? C1 subgroup ? C2 subgroup ? C3 subgroup
2.2 細胞凋亡檢測
2.2.1 A組
A1、A2、A3組髓核細胞凋亡率分別為5.86%±0.35%、4.76%±0.39%、4.75%±0.42%，A2、A3組凋亡率低于A1組，差異有統計學意義（t=3.636，P=0.022；t=3.517，P=0.025）；但A2、A3組間差異無統計學意義（t=6.030，P=0.977）。見圖 3。
2.2.2 B組
B1、B2、B3組髓核細胞凋亡率分別為10.51%±0.75%、18.55%±0.76%、4.21%±0.86%，B1組細胞凋亡率顯著高于A1組，差異有統計學意義（t=9.731，P=0.001）。與B1組比較，B3組可降低TNF-α誘導的髓核細胞凋亡，B2組則促進TNF-α誘導的髓核細胞凋亡，差異均有統計學意義（t=9.563，P=0.001；t=13.042，P=0.000）。見圖 4。
2.2.3 C組
C1、C2、C3組髓核細胞凋亡率分別為12.03%±0.81%、14.03%±0.68%、9.94%±0.82%，C1組細胞凋亡率顯著高于A1組，差異有統計學意義（t=12.111，P=0.000）。與C1組比較，C3組可降低血清剝奪的髓核細胞凋亡，C2組則促進血清剝奪的髓核細胞凋亡，差異均有統計學意義（t=3.1407，P=0.035；t=3.276，P=0.031）。見圖 5。
2.3 實時熒光定量PCR檢測
2.3.1 A組
與A1組比較，A2、A3組的Vit C均能促進髓核細胞Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Sox9 mRNA表達，且A3組促進作用大于A2組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與A1組比較，A2、A3組的Vit C均能降低髓核細胞p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.05）；但A2、A3組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 6 a、b。
圖6
實時熒光定量PCR檢測各組目的基因表達 A組（p53、FAS、Caspase 3） ? A組（Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Sox9） ? B組 ? C組
Figure6.
Gene expressions detected by real-time fluorescent quantitative PCR Group A (p53,FAS,and Caspase 3) ? Group A (collagen type Ⅰ,collagen type ⅠI,Aggrecan,and Sox9) ? Group B ? Group C
2.3.2 B組
與B0組比較，B1組TNF-α可增加髓核細胞p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。與B1組比較，B3組200 μg/mL Vit C能降低髓核細胞p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達，B2組100 μg/mL Vit C則增強其mRNA表達，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6 c。
2.3.3 C組
與C0組比較，C1組2%FBS可降低髓核細胞P53、FAS、Caspase 3 mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。與C1組比較，C2組的Vit C可增強其p53、FAS mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.05）；C3組的Vit C則能降低p53、FAS及Caspase 3 mRNA表達，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6 d。
3 討論
近年來隨著研究不斷深入，椎間盤退變的具體原因和發病機制已獲較大進展，但至今尚未完全闡明。髓核細胞是椎間盤的主要細胞之一，在維持椎間盤正常結構和功能方面起重要作用，是椎間盤功能的主要執行者，其過度凋亡使得細胞外基質合成減少和成分改變，從而導致椎間盤發生退行性變，可見髓核細胞的過渡凋亡是椎間盤退變的病理基礎之一[8-10]，炎癥及營養環境是椎間盤退變的重要因素。
椎間盤由于其獨特的營養獲取方式，營養狀態相對較差，尤其是位于椎間盤內部的髓核組織，營養缺乏導致了髓核細胞活力減弱，椎間盤修復能力較弱。TNF-α則是人體主要促炎因子，對中性粒細胞和單核細胞有趨化作用，并使之活化和脫顆粒，釋放炎性介質，誘導髓核細胞凋亡，同時還可抑制髓核細胞外基質表達，從而參與椎間盤退變的病理過程[11-13]，可見TNF-α及低營養環境是椎間盤退變的重要因素。Vit C是維持人體健康必需的營養物質，參與膠原等細胞外基質的合成，也是重要的抗氧化劑，在消除氧自由基、拮抗氧化應激等方面起重要作用[5, 14-15]，這為Vit C應用于防治椎間盤退變提供了新思路。
本研究采用Vit C對TNF-α以及血清剝奪誘導的髓核細胞凋亡進行干預，觀察Vit C在預防髓核細胞凋亡中的作用。結果表明，100 μg/mL和200 μg/ mL Vit C可降低髓核細胞凋亡率及p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達，促進髓核細胞Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Sox9 mRNA表達，且200 μg/ mL Vit C較100 μg/ mL Vit C促進髓核細胞外基質分泌作用更大，差異有統計學意義。Vit C促進了Ⅱ型膠原mRNA表達，同時也促進了Ⅰ型膠原mRNA表達，可能是Vit C通過同比例增加膠原含量來對人髓核細胞起作用，但具體機制尚待進一步研究。
p53是細胞重要的抑癌基因，在正常細胞中低水平表達。當細胞受到輕微異常刺激時，p53通過與其下游的Mdm2形成負反饋調節機制維持表達水平穩定，防止細胞凋亡；而當受到強烈異常刺激時，p53表達增高，并通過激活Caspase 3來抑制Mdm2表達，最終誘導細胞凋亡[16]。不僅如此，研究還發現，p53在細胞營養代謝中有特殊作用。一方面，p53可直接與細胞色素C氧化酶復合物的關鍵調節亞基（SCO2）基因中的p53特異結合序列結合，激活SCO2，調節細胞營養代謝；另一方面，p53還能通過p53誘導糖酵解和凋亡調節因子蛋白多肽抗原（TIGAR）調節磷酸戊糖旁路的限速酶--果糖-2，6-二磷酸酶活性，導致糖無氧酵解，起到抗自噬作用。因此，p53能維持生物有氧呼吸與糖酵解之間的平衡，使得細胞能夠適應低營養環境[17-20]。研究還表明，輕度營養缺乏時p53表達并不升高，而在重度營養缺乏時，p53表達富集，使細胞適應低營養環境[21-22]。而且An等[23]和Kim等[24]研究表明，在腫瘤細胞中，Vit C能通過上調p53，從而調節FAS、Bax等蛋白活性，進而調控Caspase 3等凋亡相關蛋白活性，介導細胞凋亡[16, 25]。因此，我們推測Vit C可能通過調節p53-FAS-Caspase 3信號通路，進而調節髓核細胞凋亡，最終干預椎間盤退變過程。
因此，本研究擬通過TNF-α及血清剝奪誘導髓核細胞凋亡，采用Vit C對髓核細胞進行干預，觀察髓核細胞p53、FAS及Caspase 3的基因表達，表明Vit C可能是通過p53-FAS-Caspase 3信號通路抑制髓核細胞凋亡，從而延緩甚至阻滯椎間盤退變。研究結果顯示，100 ng/mL TNF-α促進髓核細胞凋亡及升高p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達水平；而200 μg/mL Vit C能抑制TNF-α誘導的髓核細胞凋亡及p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達。Vit C作為一種抗氧化劑，對于炎性因子TNF-α誘導的凋亡有一定抑制作用，100 μg/mL Vit C為何反常性地促進其凋亡及p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達？查閱文獻發現，Vit C除了具有清除自由基、抗氧化作用外，還可將脂質過氧化物降解為內源性的基因毒性物質；而且可通過過氧化亞硝酸鹽，產生細胞毒性作用，介導細胞凋亡[26-27]。所以，本實驗100 μg/mL的Vit C可能更傾向于親氧化作用，與TNF-α協同促進p53、FAS及Caspase 3凋亡相關基因表達，進而促進髓核細胞凋亡。
另外，Vit C作為健康人體重要營養物質和抗氧化物，能夠清除由血清剝奪誘導的ROS，對于血清剝奪誘導的髓核細胞凋亡具有一定抑制作用。與空白組對比，血清剝奪后p53、FAS及Caspase 3轉錄活性降低，而100 μg/mL Vit C增加p53、FAS的轉錄活性，200 μg/mL Vit C則能有效降低其表達。作為一種異常刺激，血清剝奪主要通過升高ROS等方式誘導細胞凋亡，但p53等出現反常性的降低可能與下列因素有關：① 細胞質中p53可通過抑制AMPK和激活mTOR來抑制自噬。自噬是細胞在應激條件下發生的溶酶體崩解，從而介導蛋白降解，借此回收蛋白以及細胞器，釋放有利的ATP、氨基酸等，促使細胞適應營養缺乏的環境，可見自噬是機體細胞在營養缺乏時的一種良性應激。p53的降低有利于誘導細胞自噬[28-29]。② 研究表明，p53可有效抑制VEGF；不僅如此，p53基因還可抑制血管平滑肌細胞增殖，進而抑制新生內膜形成[30-31]。血清剝奪后，p53表達降低，有利于血管生成，從而使得髓核細胞適應低營養、低氧環境[31-34]。100 μg/mL Vit C和200 μg/mL Vit C對髓核細胞作用效果的差異可能與100 μg/mL Vit C更傾向于親氧化作用有關。
綜上述，Vit C對髓核細胞有保護作用，能降低或延緩髓核細胞凋亡，促進髓核細胞外基質合成與分泌；100 μg/ mL Vit C對髓核細胞有親氧化作用，促進TNF-α和血清剝奪誘導的細胞凋亡；200 μg/mL Vit C對髓核細胞有抗氧化作用，能夠抑制或延緩TNF-α和血清剝奪誘導的細胞凋亡，其作用機制可能與p53-FAS-Caspase 3信號傳導通路有關，這也是本課題組以后的研究方向。
椎間盤是人體最大的無血運組織，主要靠其上下的軟骨終板滲透等被動擴散方式獲得營養，營養相對缺乏，且髓核細胞自我修復能力低。目前研究表明[1]，椎間盤退變是多種因素協同作用的結果，多因素作用下髓核細胞的過度凋亡使得細胞外基質合成減少和成分改變，從而導致椎間盤發生退行性變，可見髓核細胞凋亡是椎間盤退變的病理基礎之一。研究表明[2]，人正常髓核細胞凋亡率為28%，而退變椎間盤中髓核細胞凋亡率高達53%～73%，其中炎性反應及營養環境在椎間盤退變中發揮重要作用。
Esteban等[3]研究表明，細胞培養過程中加入維生素C（Vitamin C，Vit C）可顯著增加小鼠和人類誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）集落形成，緩解細胞衰老，得到高質量的iPSCs，增強機體細胞的重編程，增加綠色熒光蛋白/ALP比率。Vit C可抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）活性，從而使iPSCs誘導效率提升；Vit C還可降低P53蛋白含量，從而利于iPSCs前體細胞向iPSCs轉化[4]；其對TNF-α引起的充血性心力衰竭的心肌細胞凋亡有一定延緩作用[5]。但Vit C能否抑制或延緩TNF-α及血清剝奪誘導的髓核細胞凋亡罕見報道。本研究以髓核細胞為研究對象，探討Vit C抑制或延緩TNF-α及血清剝奪誘導髓核細胞凋亡的作用，以期為Vit C預防、延緩及治療椎間盤退變奠定實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞、主要試劑及儀器
實驗用髓核細胞來源于中山大學附屬第一醫院脊柱側彎中心7例行脊柱矯形手術患者的髓核組織，患者年齡7～16歲，平均12.3歲；排除惡性腫瘤和神經系統病史，術后病理檢查結果均為正常椎間盤。本研究均獲患者本人及家屬知情同意，并通過了廣州市紅十字會醫院倫理委員會批準。
Vit C注射液（2 mL∶0.5 g；廣州白云山天心制藥股份有限公司）；TNF-α（R&D公司，美國）；H-DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；100×青-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液、Ⅱ型膠原酶、CY3標記的羊抗兔IgG （Sigma公司，美國）；兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體（Abcam公司，英國）；兔抗人缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1 α，HIF-1α）多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；膜聯蛋白V（Annexin V）-FITC /碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；逆轉錄試劑盒（Promega公司，美國）。
25 cm2細胞培養瓶（Corning公司，美國）；Ther mo 8000DH型CO2培養箱（Thermo scientific公司，美國）；Ti-u倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；HC-3018R高速冷凍離心機（安徽科大創新股份有限公司）；ABI 3900臺式高通量DNA合成儀、ABI 9700 PCR儀、ABI 7500全自動熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）；流式細胞儀（B&D公司，美國）；熒光顯微鏡系統、數碼彩色CCD攝像機、顯微圖像分析系統（Zeiss公司，德國）。
1.2 椎間盤髓核細胞分離培養及鑒定
參考Kluba等[6]方法分離培養髓核細胞。用眼科剪將髓核組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小后，放入盛有10 mL 2%Ⅱ型膠原酶的100 mL燒杯中，磁力攪拌器攪拌約1 h，待組織完全溶解；加入等體積含10%FBS的H-DMEM培養基中止，以離心半徑9 cm、1 200 r/min離心10 min；棄上清，重懸細胞，按1×106個/mL接種至25 cm2細胞培養瓶，加入含10%FBS的H-DMEM培養基6～8 mL，于37℃、5%CO2孵箱中培養；3 d后倒置相差顯微鏡觀察細胞貼壁生長情況；隔天換液，10～14 d當細胞接近90%融合時行傳代擴增。
采用Ⅱ型膠原、HIF-1α免疫熒光細胞化學染色進行髓核細胞表型鑒定[7]。取第3代細胞以1×104 個/mL密度接種于表面涂有多聚賴氨酸的消毒蓋玻片上，每片接種2 mL，于37℃、5%CO2孵箱中培養24 h，收集細胞爬片，4%多聚甲醛固定液固定30 min，0.3%Triton X-100浸泡15 min破細胞膜，微波修復，非免疫山羊血清封閉，分別各加入1∶200稀釋的兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體和兔抗人HIF-1α多克隆抗體100 μL，0.02 mmol/L PBS替代抗體作為陰性對照，置4℃冰箱濕盒過夜；第2天加入1∶50稀釋的CY3標記羊抗兔IgG 100 μL、30 min，熒光顯微鏡系統、數碼彩色CCD攝像機及顯微圖像分析系統觀察。
1.3 實驗分組及方法
取第3代髓核細胞，按5×105個/mL 密度接種至含10%FBS、H-DMEM培養基的25 cm2細胞培養瓶中，第2天根據不同處理因素分為Vit C作用組（A組）、TNF-α誘導組（B組）和血清剝奪組（C組），基礎培養液為含8%FBS的H-DMEM培養基，37℃、5%CO2孵箱培養24 h，A組添加Vit C預作用24 h。每組再分為3個亞組：A組分為A1組（僅為基礎培養液），A2組（加入100 μg/mL Vit C），A3組（加入200 μg/mL Vit C）；B組分為B0組（對照組）、B1組（加入100 ng/mL TNF-α）、B2組（加入100 μg/ mL Vit C和100 ng/mL TNF-α）、B3組（加入200 μg/mL Vit C和100 ng/mL TNF-α）；C組分為C0組（對照組）、C1組（更換為含2%FBS的H-DMEM培養液）、C2組（含2%FBS的H-DMEM培養液及100 μg/ mL Vit C）、C3組（含2%FBS的H-DMEM培養液及200 μg/ mL Vit C）。
1.4 檢測指標
1.4.1 倒置相差顯微鏡觀察
取B1組和C1組分別干預24 h的細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態、體積、折光性的改變。
1.4.2 流式細胞術檢測細胞凋亡
髓核細胞按各組因素處理24 h中止，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化制成細胞懸浮液，以離心半徑9 cm、2 000 r/min離心5 min，PBS緩沖液洗滌細胞2次。在細胞懸液中加入5 μL AnnexinⅤ-FITC，混勻，2～8℃避光孵育15 min；加入10 μL PI后同上條件再孵育5 min，流式細胞術檢測各組AnnexinⅤ、PI雙染后髓核細胞UR/LR象限（早期凋亡及晚期凋亡）的凋亡百分率。實驗重復3次，取均值。
1.4.3 實時熒光定量PCR檢測細胞凋亡相關基因mRNA表達
采用實時熒光定量PCR檢測p53（基因編碼相對分子質量為53×103的蛋白質）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3）、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Sox9和糖胺多糖（Aggrecan）mRNA表達（B、C組未檢測Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Sox9 mRNA表達）。取4 μL RNA為逆轉錄模板，按一步法RT-PCR試劑盒說明書提取總RNA并進行擴增，逆轉錄反應體系為20 μL，PCR反應體系為50 μL。引物設計與合成：于GenBank數據庫中獲得目的基因mRNA序列，采用Primer express2.0軟件在CDS區設計特異性引物。引物序列及擴增產物長度見表 1。RT-PCR反應條件：逆轉錄反應37℃、45 min，95℃、3 min；PCR初始變性94℃、2 min，變性94℃、15 s，退火55℃、25 s，延伸72℃、25 s，40個循環；最終延伸65℃、10 min。反應結束后由電腦自動分析并計算結果，同時設無模板對照，每份標本重復3次，取均值；以目的基因與內參基因β-actin的比值作為mRNA相對表達量。
表1
目的基因序列及擴增產物長度
Table1.
The primer sequence and amplified product size
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 髓核細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代培養10～14 d細胞呈短梭多角形，放射狀排列并融合成單層；第3代細胞培養5～7 d時接近融合，細胞排列紊亂（圖 1 a）。B1組細胞經TNF-α誘導24 h及C1組細胞經血清剝奪24 h后，倒置相差顯微鏡下觀察示細胞變圓，體積縮小甚至脫壁；C1組細胞折光性低于B1組（圖 1 b、c）。第3代正常髓核細胞經Ⅱ型膠原和HIF-1α免疫熒光細胞化學染色鑒定細胞表型均呈陽性，Ⅱ型膠原和HIF-1α均在細胞質表達，具有類軟骨細胞表型特征（圖 2）
圖1
髓核細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 第3 代正常髓核細胞 ? B1組細胞 C1組細胞? ?圖 2 第3 代正常髓核細胞免疫熒光細胞化學染色鑒定（熒光倒置顯微鏡×100） ? II型膠原 ? HIF-1α ? ?圖 3 不同濃度Vit C對髓核細胞凋亡的影響 ? A1組 ? A2組 ? A3組? ?圖 4 不同濃度Vit C對TNF-α誘導的髓核細胞凋亡影響 ? B1組 ? B2組 ? B3組? ?圖 5 不同濃度Vit C對血清剝奪誘導的髓核細胞凋亡影響 ? C1組 ? C2組 ? C3組
Figure1.
Morphology observation of NP cells (Inverted phase contrast microscope×100) ? NP cells at 3rd passage ? NP cells cultured with TNF-α in B1 subgroup NP cells cultured with serum deprivation in C1 sub group? ? Fig. 2 Immunocytochemistry staining of NP cells (Fluorescent inverted microscope×100) ? Collagen type ⅠI ? HIF-1α? ? Fig. 3 Effect of Vit C on the apoptosis rate of NP cells ? A1 subgroup ? A2 subgroup ? A3 subgroup? ? Fig. 4 Effect of Vit C on the apoptosis rate of NP cells induced by TNF-α ? B1 subgroup ? B2 subgroup ? B3 subgroup? ? Fig. 5 Effect of Vit C on the apoptosis rate of NP cells induced by serum deprivation ? C1 subgroup ? C2 subgroup ? C3 subgroup
2.2 細胞凋亡檢測
2.2.1 A組
A1、A2、A3組髓核細胞凋亡率分別為5.86%±0.35%、4.76%±0.39%、4.75%±0.42%，A2、A3組凋亡率低于A1組，差異有統計學意義（t=3.636，P=0.022；t=3.517，P=0.025）；但A2、A3組間差異無統計學意義（t=6.030，P=0.977）。見圖 3。
2.2.2 B組
B1、B2、B3組髓核細胞凋亡率分別為10.51%±0.75%、18.55%±0.76%、4.21%±0.86%，B1組細胞凋亡率顯著高于A1組，差異有統計學意義（t=9.731，P=0.001）。與B1組比較，B3組可降低TNF-α誘導的髓核細胞凋亡，B2組則促進TNF-α誘導的髓核細胞凋亡，差異均有統計學意義（t=9.563，P=0.001；t=13.042，P=0.000）。見圖 4。
2.2.3 C組
C1、C2、C3組髓核細胞凋亡率分別為12.03%±0.81%、14.03%±0.68%、9.94%±0.82%，C1組細胞凋亡率顯著高于A1組，差異有統計學意義（t=12.111，P=0.000）。與C1組比較，C3組可降低血清剝奪的髓核細胞凋亡，C2組則促進血清剝奪的髓核細胞凋亡，差異均有統計學意義（t=3.1407，P=0.035；t=3.276，P=0.031）。見圖 5。
2.3 實時熒光定量PCR檢測
2.3.1 A組
與A1組比較，A2、A3組的Vit C均能促進髓核細胞Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Sox9 mRNA表達，且A3組促進作用大于A2組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與A1組比較，A2、A3組的Vit C均能降低髓核細胞p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.05）；但A2、A3組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 6 a、b。
圖6
實時熒光定量PCR檢測各組目的基因表達 A組（p53、FAS、Caspase 3） ? A組（Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Sox9） ? B組 ? C組
Figure6.
Gene expressions detected by real-time fluorescent quantitative PCR Group A (p53,FAS,and Caspase 3) ? Group A (collagen type Ⅰ,collagen type ⅠI,Aggrecan,and Sox9) ? Group B ? Group C
2.3.2 B組
與B0組比較，B1組TNF-α可增加髓核細胞p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。與B1組比較，B3組200 μg/mL Vit C能降低髓核細胞p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達，B2組100 μg/mL Vit C則增強其mRNA表達，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6 c。
2.3.3 C組
與C0組比較，C1組2%FBS可降低髓核細胞P53、FAS、Caspase 3 mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。與C1組比較，C2組的Vit C可增強其p53、FAS mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.05）；C3組的Vit C則能降低p53、FAS及Caspase 3 mRNA表達，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6 d。
3 討論
近年來隨著研究不斷深入，椎間盤退變的具體原因和發病機制已獲較大進展，但至今尚未完全闡明。髓核細胞是椎間盤的主要細胞之一，在維持椎間盤正常結構和功能方面起重要作用，是椎間盤功能的主要執行者，其過度凋亡使得細胞外基質合成減少和成分改變，從而導致椎間盤發生退行性變，可見髓核細胞的過渡凋亡是椎間盤退變的病理基礎之一[8-10]，炎癥及營養環境是椎間盤退變的重要因素。
椎間盤由于其獨特的營養獲取方式，營養狀態相對較差，尤其是位于椎間盤內部的髓核組織，營養缺乏導致了髓核細胞活力減弱，椎間盤修復能力較弱。TNF-α則是人體主要促炎因子，對中性粒細胞和單核細胞有趨化作用，并使之活化和脫顆粒，釋放炎性介質，誘導髓核細胞凋亡，同時還可抑制髓核細胞外基質表達，從而參與椎間盤退變的病理過程[11-13]，可見TNF-α及低營養環境是椎間盤退變的重要因素。Vit C是維持人體健康必需的營養物質，參與膠原等細胞外基質的合成，也是重要的抗氧化劑，在消除氧自由基、拮抗氧化應激等方面起重要作用[5, 14-15]，這為Vit C應用于防治椎間盤退變提供了新思路。
本研究采用Vit C對TNF-α以及血清剝奪誘導的髓核細胞凋亡進行干預，觀察Vit C在預防髓核細胞凋亡中的作用。結果表明，100 μg/mL和200 μg/ mL Vit C可降低髓核細胞凋亡率及p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達，促進髓核細胞Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Sox9 mRNA表達，且200 μg/ mL Vit C較100 μg/ mL Vit C促進髓核細胞外基質分泌作用更大，差異有統計學意義。Vit C促進了Ⅱ型膠原mRNA表達，同時也促進了Ⅰ型膠原mRNA表達，可能是Vit C通過同比例增加膠原含量來對人髓核細胞起作用，但具體機制尚待進一步研究。
p53是細胞重要的抑癌基因，在正常細胞中低水平表達。當細胞受到輕微異常刺激時，p53通過與其下游的Mdm2形成負反饋調節機制維持表達水平穩定，防止細胞凋亡；而當受到強烈異常刺激時，p53表達增高，并通過激活Caspase 3來抑制Mdm2表達，最終誘導細胞凋亡[16]。不僅如此，研究還發現，p53在細胞營養代謝中有特殊作用。一方面，p53可直接與細胞色素C氧化酶復合物的關鍵調節亞基（SCO2）基因中的p53特異結合序列結合，激活SCO2，調節細胞營養代謝；另一方面，p53還能通過p53誘導糖酵解和凋亡調節因子蛋白多肽抗原（TIGAR）調節磷酸戊糖旁路的限速酶--果糖-2，6-二磷酸酶活性，導致糖無氧酵解，起到抗自噬作用。因此，p53能維持生物有氧呼吸與糖酵解之間的平衡，使得細胞能夠適應低營養環境[17-20]。研究還表明，輕度營養缺乏時p53表達并不升高，而在重度營養缺乏時，p53表達富集，使細胞適應低營養環境[21-22]。而且An等[23]和Kim等[24]研究表明，在腫瘤細胞中，Vit C能通過上調p53，從而調節FAS、Bax等蛋白活性，進而調控Caspase 3等凋亡相關蛋白活性，介導細胞凋亡[16, 25]。因此，我們推測Vit C可能通過調節p53-FAS-Caspase 3信號通路，進而調節髓核細胞凋亡，最終干預椎間盤退變過程。
因此，本研究擬通過TNF-α及血清剝奪誘導髓核細胞凋亡，采用Vit C對髓核細胞進行干預，觀察髓核細胞p53、FAS及Caspase 3的基因表達，表明Vit C可能是通過p53-FAS-Caspase 3信號通路抑制髓核細胞凋亡，從而延緩甚至阻滯椎間盤退變。研究結果顯示，100 ng/mL TNF-α促進髓核細胞凋亡及升高p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達水平；而200 μg/mL Vit C能抑制TNF-α誘導的髓核細胞凋亡及p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達。Vit C作為一種抗氧化劑，對于炎性因子TNF-α誘導的凋亡有一定抑制作用，100 μg/mL Vit C為何反常性地促進其凋亡及p53、FAS、Caspase 3 mRNA表達？查閱文獻發現，Vit C除了具有清除自由基、抗氧化作用外，還可將脂質過氧化物降解為內源性的基因毒性物質；而且可通過過氧化亞硝酸鹽，產生細胞毒性作用，介導細胞凋亡[26-27]。所以，本實驗100 μg/mL的Vit C可能更傾向于親氧化作用，與TNF-α協同促進p53、FAS及Caspase 3凋亡相關基因表達，進而促進髓核細胞凋亡。
另外，Vit C作為健康人體重要營養物質和抗氧化物，能夠清除由血清剝奪誘導的ROS，對于血清剝奪誘導的髓核細胞凋亡具有一定抑制作用。與空白組對比，血清剝奪后p53、FAS及Caspase 3轉錄活性降低，而100 μg/mL Vit C增加p53、FAS的轉錄活性，200 μg/mL Vit C則能有效降低其表達。作為一種異常刺激，血清剝奪主要通過升高ROS等方式誘導細胞凋亡，但p53等出現反常性的降低可能與下列因素有關：① 細胞質中p53可通過抑制AMPK和激活mTOR來抑制自噬。自噬是細胞在應激條件下發生的溶酶體崩解，從而介導蛋白降解，借此回收蛋白以及細胞器，釋放有利的ATP、氨基酸等，促使細胞適應營養缺乏的環境，可見自噬是機體細胞在營養缺乏時的一種良性應激。p53的降低有利于誘導細胞自噬[28-29]。② 研究表明，p53可有效抑制VEGF；不僅如此，p53基因還可抑制血管平滑肌細胞增殖，進而抑制新生內膜形成[30-31]。血清剝奪后，p53表達降低，有利于血管生成，從而使得髓核細胞適應低營養、低氧環境[31-34]。100 μg/mL Vit C和200 μg/mL Vit C對髓核細胞作用效果的差異可能與100 μg/mL Vit C更傾向于親氧化作用有關。
綜上述，Vit C對髓核細胞有保護作用，能降低或延緩髓核細胞凋亡，促進髓核細胞外基質合成與分泌；100 μg/ mL Vit C對髓核細胞有親氧化作用，促進TNF-α和血清剝奪誘導的細胞凋亡；200 μg/mL Vit C對髓核細胞有抗氧化作用，能夠抑制或延緩TNF-α和血清剝奪誘導的細胞凋亡，其作用機制可能與p53-FAS-Caspase 3信號傳導通路有關，這也是本課題組以后的研究方向。
