引用本文： 趙斌, 馬信龍, 孫曉雷, 李秀蘭, 張楊, 郭悅, 楊強. 兔坐骨神經勻漿上清液對脂肪干細胞的誘導分化作用. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(4): 477-482. doi: 10.7507/1002-1892.20150103 復制
脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，且具有跨胚層分化能力，其數量大、易獲得、體外擴增迅速、獲取對供區影響較小[1]。其分化具有可塑性，分化方向受所處微環境的影響，已有研究表明在合適條件下其可向類雪旺細胞分化[2-4]，具有促進神經再生和功能恢復的作用[5-7]。但目前誘導分化方法大多為化學方法，化學試劑對細胞存在一定毒性作用，限制其臨床應用。本研究采用體外模擬周圍神經所處的微環境，將兔損傷坐骨神經勻漿與ADSCs共培養，誘導ADSCs向神經系細胞分化，為臨床治療神經損傷提供新思路和方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4月齡健康新西蘭大白兔18只，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg，由天津醫院動物房提供。
氯胺酮、速眠新（軍事醫學科學院）；DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；von Kossa染液、油紅O染液、甲苯胺藍染液（南京建成生物工程研究所）；cDNA合成試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒、PCR引物（GeneCopoeia公司，美國）。實時熒光定量PCR檢測系統（Bio-Rad公司，美國）；NanoDrop?8000分光光度計（Thermo公司，德國）；普通PCR儀（Takara公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；低溫高速離心機（Heraeus公司，德國）；組織研磨器（天津天波玻璃儀器有限公司）。
1.2 兔ADSCs分離培養及鑒定
取4月齡健康新西蘭大白兔2只，以氯胺酮及速眠新肌肉注射（氯胺酮0.1 mg/kg，1 min后速眠新0.1 mg/kg）麻醉，常規備皮、消毒，分離頸背部皮下脂肪組織，將脂肪組織迅速轉移至實驗室無菌操作臺，用含抗生素的D-Hank液浸泡5 min，再用D-Hank液沖洗2遍。分離肉眼可見的筋膜、血管，將脂肪組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊。將組織塊放入無菌玻璃瓶，加入3～5倍脂肪體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃搖床200 r/min消化90 min，200目鋼網過濾。將濾液移至離心管中，以離心半徑13.5 cm、1 500 r/ min離心10 min；棄上清，D-Hank液清洗1遍，用含10%FBS的L-DMEM培養基重懸，細胞計數板計數，調整細胞密度為4×104個/mL，移入25 cm2培養瓶中，放入37℃、5%CO2和飽和濕度培養箱中培養。24 h后半量換液，以后每2天全量換液1次。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況，待細胞生長融合達80%左右，以0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第3代細胞制備細胞懸液備用。按照文獻[8]方法，加入成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞誘導培養液，誘導14 d后，經von Kossa染色、甲苯胺藍染色和油紅O染色對其進行鑒定。
1.3 兔損傷坐骨神經勻漿上清液制備
取健康新西蘭大白兔16只，隨機分為實驗組和對照組，實驗組12只，對照組4只。臀部肌肉注射（氯胺酮0.1 mg/kg、1 min后速眠新0.1 mg/ kg）麻醉，無菌條件下于股骨中段后外方2 cm處作平行于股骨的縱切口，長6 cm，沿股二頭肌與半膜肌之間鈍性分離暴露坐骨神經。對照組僅分離暴露坐骨神經，然后逐層縫合。實驗組于梨狀肌下緣15 cm處完全閉合鉗夾坐骨神經30 s，鉗夾神經長度為3 mm；用1-0無損傷縫線標記損傷部位神經外膜，生理鹽水沖洗傷口，然后逐層關閉切口。術后連續3 d慶大霉素肌肉注射預防感染。常規飼養，每日觀察實驗動物存活及傷口感染情況等。
術后3、7、14 d實驗組分別處死4只動物，取損傷部位上下各2 cm神經，0.01 mol/L PBS液沖洗；體式顯微鏡下剝離神經周圍結締組織，稱取濕重，按200 mg組織∶1 mL蒸餾水的比例，以組織研磨器進行組織勻漿；收集勻漿液并以離心半徑13.5 cm、2 500 r/min離心20 min，取勻漿上清液用0.2 μm針頭濾器過濾，-20℃凍存備用。對照組取未損傷坐骨神經按上述方法制備組織勻漿。
1.4 兔坐骨神經勻漿上清液對ADSCs誘導分化
取第3代ADSCs調整密度為1×104個/mL，接種于5板6孔培養板中（其中2孔鋪有蓋玻片），培養24 h后吸棄完全培養液（含10%FBS的L-DMEM培養液），用含10 ng/mL bFGF的完全培養液預誘導24 h以促分裂，D-Hank液洗滌3次，每孔分別加入無血清L-DMEM培養液2 mL，以每板作為一組進行誘導：A組每孔加入D-Hank液200 μL，作為空白對照組；B組每孔加入未損傷坐骨神經勻漿上清液200 μL；C組每孔加入損傷3 d坐骨神經勻漿上清液200 μL；D組每孔加入損傷7 d坐骨神經勻漿上清液200 μL；E組每孔加入損傷14 d坐骨神經勻漿上清液200 μL。誘導7 d后進行以下檢測。
1.5 檢測指標
1.5.1 免疫細胞化學染色檢測S-100蛋白表達
各組誘導結束后吸棄培養液，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30 min以上，PBS沖洗，3%H2O2甲醛溶液浸泡約15 min，滅活過氧化物酶，PBS沖洗2 min×3次；滴加山羊血清封閉液10 min進行封閉；加入鼠抗兔S-100蛋白一抗（1∶100稀釋），4℃過夜，PBS沖洗2 min×3次；滴加生物素標記的山羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育10 min，PBS沖洗2 min×3次，加入SABC孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB溶液顯色，光鏡下觀察。
1.5.2 實時熒光定量PCR檢測
收集各組細胞，根據GenBank公布的兔細胞神經組織蛋白（S-100）、神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、巢蛋白（Nestin）的cDNA序列，采用Primer5.0設計引物序列，由廣州復能基因有限公司合成。引物序列：GAPDH上游5'-ATGTTTGTGATGGGCGTGAA-3'，下游3'-GCCGAAGTGGTCGTGGAT-5'；S-100上游5'-AGGAAATCAAAGAGCAGGAGG-3'，下游3'-CCATAGCGACGAAAGCCATA-5'；NSE上游5'-AGTGGGCCACATCAACAACA-3'，下游3'-CATCCAACTCCAGCATCAGGT-5'；Nestin上游5'-CTGACCATCCCAGTCCAGA-3'，下游3'-TCCACCAGCCCATCAATCT-5'；上述引物擴增片段大小均為120 bp。參考Trizol說明書，采用Trizol試劑處理各組細胞，提取細胞總RNA。取500 ng用于逆轉錄，取逆轉錄得到的cDNA，采用PCR試劑盒建立反應體系，將各反應管放入實時熒光定量PCR儀，按以下條件擴增：95℃、5 min；95℃、15 s，60℃、60 s，45個循環。溶解分析產物特異性，用LightCycler Software Version 4.0軟件分析目的基因相對表達量。
1.6 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兔ADSCs形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代ADSCs培養1 h后即有細胞貼壁，呈圓形；24 h后貼壁細胞逐漸增多，呈圓形或短梭形（圖 1 a）；傳代后大部分細胞為典型的長梭形，少數為三角形或多邊形，細胞緊密平行排列或呈漩渦狀生長，細胞增殖迅速，5 d左右即可達90%融合（圖 1 b）。連續傳至12代，細胞增殖速度未見明顯減弱，形態未見明顯改變。
ADSCs經成骨、成脂及成軟骨誘導14 d后觀察示，von Kossa染色可見鈣結節聚集（圖 2 a），油紅O染色可見亮紅色脂滴（圖 2 b），甲苯胺藍染色細胞質呈藍色（圖 2 c）。
圖1
ADSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代細胞 ? 第3代細胞? ?圖 2 ADSCs鑒定（倒置相差顯微鏡×100） ? ADSCs成骨誘導von Kossa染色 ? ADSCs成脂誘導油紅O染色 ? ADSCs成軟骨誘導甲苯胺藍染色? ?圖 3 兔坐骨神經勻漿上清液誘導ADSCs后形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? E組? ?圖 4 免疫細胞化學染色檢測各組S-100蛋白表達（倒置相差顯微鏡×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? E組
Figure1.
Morphological observation of ADSCs (Inverted phase contrast microscope ×100) ? Primary cells ? Third-generation cells? ? Fig. 2 Identification of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ? von Kossa staining after osteogenic induction ? Oil red staining after adipogenic induction ? Toluidine blue staining after chondrogenic induction? ? Fig. 3 The morphology observation of ADSCs induced by rabbit sciatic nerve extracts (Inverted phase contrast microscope×100) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D ? Group E? ? Fig. 4 S-100 immunohistochemistry staining observation of each group (Inverted phase contrast microscope ×100) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D ? Group E
2.2 兔坐骨神經勻漿上清液誘導ADSCs向神經系細胞分化
2.2.1 形態學觀察
C、D、E組經損傷坐骨神經勻漿上清液誘導后，細胞形態逐漸出現改變，胞體折光性增強，細胞突起伸出，變細、變長，呈雙極或多級，部分突起交織成網狀，類似神經系細胞；各組誘導1 d即出現上述變化，3～4 d變化明顯，其中以D組變化最為明顯。A、B組細胞形態未見明顯改變，仍以梭形為主。見圖 3。
2.2.2 免疫細胞化學染色檢測S-100蛋白表達
S-100免疫細胞化學染色示，C、D、E組染色均為陽性，以D組陽性細胞最多； A、B組細胞無陽性表達。見圖 4。
2.2.3 實時熒光定量PCR檢測
S-100基因相對表達量隨損傷時間延長呈上升趨勢，C、D組達高峰，之后緩慢下降；C、D組表達量顯著高于A、B、E組（P＜0.05），C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。NSE基因相對表達量呈相同趨勢，D組達高峰，之后緩慢下降；D、E組表達量顯著高于A、B、C組（P＜0.05），D、E組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。Nestin基因相對表達量各組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 5。
圖5
實時熒光定量PCR檢測各組目的基因表達 ? S-100 ? NSE Nestin
Figure5.
m RNA expression of each group by real-time fluorescent quantitative PCR ? S-100 ? NSE ? Nestin
3 討論
干細胞移植治療周圍神經損傷是目前研究熱點，干細胞因具有高度自我更新和多向分化潛能，成為細胞移植的首選靶細胞。細胞在體內分化為何種細胞受多種因素影響，包括微環境，相鄰或相近細胞誘導趨化作用，以及干細胞自身分泌的某種或某些趨化因子、細胞因子等。其中干細胞所處微環境對其增殖、分化的進程及方向具有決定性作用[9-11]，微環境包括化學微環境及力學微環境等。國內外一些學者應用組織勻漿模擬體內化學微環境誘導干細胞向特定細胞分化。王曉萃等[12]將腦勻漿上清液加入MSCs培養環境中進行誘導，誘導后的細胞具有神經元樣形態，并表達神經元細胞標記物NSE和神經絲蛋白；Luk等[13]將BMSCs與正常及損傷肝臟組織勻漿共培養，兩組細胞均檢測到肝細胞特異基因的表達；Choi等[14]采用胰腺提取物誘導鼠MSCs分化為胰島B細胞，且能夠分泌胰島素。
但周圍神經勻漿對ADSCs的誘導分化作用目前尚罕見報道。因此，本實驗采用兔正常坐骨神經、損傷3、7、14 d的坐骨神經勻漿上清液在體外對ADSCs進行誘導分化；誘導7 d，C、D、E組出現一定比例神經樣細胞，且存活時間較長。為證明其為何種細胞，我們采用實時熒光定量PCR法對其進行了鑒定。S-100是雪旺細胞特異性標記物，NSE是神經元表達的特異性蛋白，而Nestin是神經干細胞特異性標志。誘導7 d，實時熒光定量PCR結果表明所誘導的細胞為雪旺細胞和神經細胞。另外有研究表明，MSCs在腦組織勻漿培養條件下可向神經樣細胞分化，分化方向是先分化為神經干細胞，再向神經元樣細胞或星形膠質細胞分化[15]。而本實驗結果中Nestin基因相對表達量各組間差異無統計學意義，表明周圍神經勻漿上清液可將ADSCs誘導分化為雪旺細胞及神經細胞，但其誘導過程并不經歷神經干細胞這一階段，而是直接由ADSCs分化為雪旺細胞和神經細胞。
Ye等[16]通過模擬神經發育化學微環境，采用患者腦脊液誘導BMSCs為神經樣細胞，免疫熒光結果顯示其陽性率高于EGF、bFGF聯合誘導組。張儒有等[17]研究不同時期挫裂傷腦組織對神經干細胞分化的影響，認為腦挫裂傷后早期組織可誘導神經干細胞分化成更多神經元，腦挫裂傷后早期行神經干細胞移植可能有助于提高療效。Ankeny等[18]將MSCs植入大鼠損傷脊髓后，細胞表達膠質纖維酸性蛋白，提示MSCs在一定環境下可多向分化，脊髓勻漿上清液中可能包含促MSCs向神經細胞分化的誘導因子。本實驗結果顯示，損傷早期（3、7 d）坐骨神經勻漿上清液表現出相對較強的誘導作用，表明損傷早期局部化學微環境可能更有利于動員代償反應機制，導致各種神經生長因子分泌明顯增加。本課題組既往研究表明，損傷后不同時間坐骨神經勻漿上清液中bFGF、NGF及BDNF等生長因子含量與損傷時間有關，損傷后早期（3～7 d）其含量較高，之后均逐漸下降[19]。我們認為這些生長因子能夠促進神經組織增生，保護神經功能，同時能夠增強ADSCs向雪旺細胞和神經細胞方向分化。Hofstet ter 等[20]實驗研究表明，脊髓損傷后7 d采用干細胞移植治療比傷后立即進行干細胞移植治療能夠顯著提高細胞存活數量，并獲得明顯的功能改善。這些都為我們選擇最佳細胞移植時機提供了理論依據。
綜上述，干細胞所處化學微環境的改變可能是影響其向何種細胞分化的重要因素。兔坐骨神經勻漿上清液可誘導ADSCs分化為雪旺細胞和神經細胞，且傷后早期（3～7 d）誘導作用最強。由此我們推斷，傷后早期是進行干細胞移植治療的最佳時機，但其具體機制有待進一步研究明確。除了化學微環境外，干細胞在體內分化還受力學微環境的影響；另外，本研究中誘導后的雪旺細胞和神經細胞是否具有正常成熟細胞功能，均有待進一步研究。
脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，且具有跨胚層分化能力，其數量大、易獲得、體外擴增迅速、獲取對供區影響較小[1]。其分化具有可塑性，分化方向受所處微環境的影響，已有研究表明在合適條件下其可向類雪旺細胞分化[2-4]，具有促進神經再生和功能恢復的作用[5-7]。但目前誘導分化方法大多為化學方法，化學試劑對細胞存在一定毒性作用，限制其臨床應用。本研究采用體外模擬周圍神經所處的微環境，將兔損傷坐骨神經勻漿與ADSCs共培養，誘導ADSCs向神經系細胞分化，為臨床治療神經損傷提供新思路和方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4月齡健康新西蘭大白兔18只，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg，由天津醫院動物房提供。
氯胺酮、速眠新（軍事醫學科學院）；DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；von Kossa染液、油紅O染液、甲苯胺藍染液（南京建成生物工程研究所）；cDNA合成試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒、PCR引物（GeneCopoeia公司，美國）。實時熒光定量PCR檢測系統（Bio-Rad公司，美國）；NanoDrop?8000分光光度計（Thermo公司，德國）；普通PCR儀（Takara公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；低溫高速離心機（Heraeus公司，德國）；組織研磨器（天津天波玻璃儀器有限公司）。
1.2 兔ADSCs分離培養及鑒定
取4月齡健康新西蘭大白兔2只，以氯胺酮及速眠新肌肉注射（氯胺酮0.1 mg/kg，1 min后速眠新0.1 mg/kg）麻醉，常規備皮、消毒，分離頸背部皮下脂肪組織，將脂肪組織迅速轉移至實驗室無菌操作臺，用含抗生素的D-Hank液浸泡5 min，再用D-Hank液沖洗2遍。分離肉眼可見的筋膜、血管，將脂肪組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊。將組織塊放入無菌玻璃瓶，加入3～5倍脂肪體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃搖床200 r/min消化90 min，200目鋼網過濾。將濾液移至離心管中，以離心半徑13.5 cm、1 500 r/ min離心10 min；棄上清，D-Hank液清洗1遍，用含10%FBS的L-DMEM培養基重懸，細胞計數板計數，調整細胞密度為4×104個/mL，移入25 cm2培養瓶中，放入37℃、5%CO2和飽和濕度培養箱中培養。24 h后半量換液，以后每2天全量換液1次。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況，待細胞生長融合達80%左右，以0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第3代細胞制備細胞懸液備用。按照文獻[8]方法，加入成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞誘導培養液，誘導14 d后，經von Kossa染色、甲苯胺藍染色和油紅O染色對其進行鑒定。
1.3 兔損傷坐骨神經勻漿上清液制備
取健康新西蘭大白兔16只，隨機分為實驗組和對照組，實驗組12只，對照組4只。臀部肌肉注射（氯胺酮0.1 mg/kg、1 min后速眠新0.1 mg/ kg）麻醉，無菌條件下于股骨中段后外方2 cm處作平行于股骨的縱切口，長6 cm，沿股二頭肌與半膜肌之間鈍性分離暴露坐骨神經。對照組僅分離暴露坐骨神經，然后逐層縫合。實驗組于梨狀肌下緣15 cm處完全閉合鉗夾坐骨神經30 s，鉗夾神經長度為3 mm；用1-0無損傷縫線標記損傷部位神經外膜，生理鹽水沖洗傷口，然后逐層關閉切口。術后連續3 d慶大霉素肌肉注射預防感染。常規飼養，每日觀察實驗動物存活及傷口感染情況等。
術后3、7、14 d實驗組分別處死4只動物，取損傷部位上下各2 cm神經，0.01 mol/L PBS液沖洗；體式顯微鏡下剝離神經周圍結締組織，稱取濕重，按200 mg組織∶1 mL蒸餾水的比例，以組織研磨器進行組織勻漿；收集勻漿液并以離心半徑13.5 cm、2 500 r/min離心20 min，取勻漿上清液用0.2 μm針頭濾器過濾，-20℃凍存備用。對照組取未損傷坐骨神經按上述方法制備組織勻漿。
1.4 兔坐骨神經勻漿上清液對ADSCs誘導分化
取第3代ADSCs調整密度為1×104個/mL，接種于5板6孔培養板中（其中2孔鋪有蓋玻片），培養24 h后吸棄完全培養液（含10%FBS的L-DMEM培養液），用含10 ng/mL bFGF的完全培養液預誘導24 h以促分裂，D-Hank液洗滌3次，每孔分別加入無血清L-DMEM培養液2 mL，以每板作為一組進行誘導：A組每孔加入D-Hank液200 μL，作為空白對照組；B組每孔加入未損傷坐骨神經勻漿上清液200 μL；C組每孔加入損傷3 d坐骨神經勻漿上清液200 μL；D組每孔加入損傷7 d坐骨神經勻漿上清液200 μL；E組每孔加入損傷14 d坐骨神經勻漿上清液200 μL。誘導7 d后進行以下檢測。
1.5 檢測指標
1.5.1 免疫細胞化學染色檢測S-100蛋白表達
各組誘導結束后吸棄培養液，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30 min以上，PBS沖洗，3%H2O2甲醛溶液浸泡約15 min，滅活過氧化物酶，PBS沖洗2 min×3次；滴加山羊血清封閉液10 min進行封閉；加入鼠抗兔S-100蛋白一抗（1∶100稀釋），4℃過夜，PBS沖洗2 min×3次；滴加生物素標記的山羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育10 min，PBS沖洗2 min×3次，加入SABC孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB溶液顯色，光鏡下觀察。
1.5.2 實時熒光定量PCR檢測
收集各組細胞，根據GenBank公布的兔細胞神經組織蛋白（S-100）、神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、巢蛋白（Nestin）的cDNA序列，采用Primer5.0設計引物序列，由廣州復能基因有限公司合成。引物序列：GAPDH上游5'-ATGTTTGTGATGGGCGTGAA-3'，下游3'-GCCGAAGTGGTCGTGGAT-5'；S-100上游5'-AGGAAATCAAAGAGCAGGAGG-3'，下游3'-CCATAGCGACGAAAGCCATA-5'；NSE上游5'-AGTGGGCCACATCAACAACA-3'，下游3'-CATCCAACTCCAGCATCAGGT-5'；Nestin上游5'-CTGACCATCCCAGTCCAGA-3'，下游3'-TCCACCAGCCCATCAATCT-5'；上述引物擴增片段大小均為120 bp。參考Trizol說明書，采用Trizol試劑處理各組細胞，提取細胞總RNA。取500 ng用于逆轉錄，取逆轉錄得到的cDNA，采用PCR試劑盒建立反應體系，將各反應管放入實時熒光定量PCR儀，按以下條件擴增：95℃、5 min；95℃、15 s，60℃、60 s，45個循環。溶解分析產物特異性，用LightCycler Software Version 4.0軟件分析目的基因相對表達量。
1.6 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兔ADSCs形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代ADSCs培養1 h后即有細胞貼壁，呈圓形；24 h后貼壁細胞逐漸增多，呈圓形或短梭形（圖 1 a）；傳代后大部分細胞為典型的長梭形，少數為三角形或多邊形，細胞緊密平行排列或呈漩渦狀生長，細胞增殖迅速，5 d左右即可達90%融合（圖 1 b）。連續傳至12代，細胞增殖速度未見明顯減弱，形態未見明顯改變。
ADSCs經成骨、成脂及成軟骨誘導14 d后觀察示，von Kossa染色可見鈣結節聚集（圖 2 a），油紅O染色可見亮紅色脂滴（圖 2 b），甲苯胺藍染色細胞質呈藍色（圖 2 c）。
圖1
ADSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代細胞 ? 第3代細胞? ?圖 2 ADSCs鑒定（倒置相差顯微鏡×100） ? ADSCs成骨誘導von Kossa染色 ? ADSCs成脂誘導油紅O染色 ? ADSCs成軟骨誘導甲苯胺藍染色? ?圖 3 兔坐骨神經勻漿上清液誘導ADSCs后形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? E組? ?圖 4 免疫細胞化學染色檢測各組S-100蛋白表達（倒置相差顯微鏡×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? E組
Figure1.
Morphological observation of ADSCs (Inverted phase contrast microscope ×100) ? Primary cells ? Third-generation cells? ? Fig. 2 Identification of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ? von Kossa staining after osteogenic induction ? Oil red staining after adipogenic induction ? Toluidine blue staining after chondrogenic induction? ? Fig. 3 The morphology observation of ADSCs induced by rabbit sciatic nerve extracts (Inverted phase contrast microscope×100) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D ? Group E? ? Fig. 4 S-100 immunohistochemistry staining observation of each group (Inverted phase contrast microscope ×100) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D ? Group E
2.2 兔坐骨神經勻漿上清液誘導ADSCs向神經系細胞分化
2.2.1 形態學觀察
C、D、E組經損傷坐骨神經勻漿上清液誘導后，細胞形態逐漸出現改變，胞體折光性增強，細胞突起伸出，變細、變長，呈雙極或多級，部分突起交織成網狀，類似神經系細胞；各組誘導1 d即出現上述變化，3～4 d變化明顯，其中以D組變化最為明顯。A、B組細胞形態未見明顯改變，仍以梭形為主。見圖 3。
2.2.2 免疫細胞化學染色檢測S-100蛋白表達
S-100免疫細胞化學染色示，C、D、E組染色均為陽性，以D組陽性細胞最多； A、B組細胞無陽性表達。見圖 4。
2.2.3 實時熒光定量PCR檢測
S-100基因相對表達量隨損傷時間延長呈上升趨勢，C、D組達高峰，之后緩慢下降；C、D組表達量顯著高于A、B、E組（P＜0.05），C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。NSE基因相對表達量呈相同趨勢，D組達高峰，之后緩慢下降；D、E組表達量顯著高于A、B、C組（P＜0.05），D、E組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。Nestin基因相對表達量各組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 5。
圖5
實時熒光定量PCR檢測各組目的基因表達 ? S-100 ? NSE Nestin
Figure5.
m RNA expression of each group by real-time fluorescent quantitative PCR ? S-100 ? NSE ? Nestin
3 討論
干細胞移植治療周圍神經損傷是目前研究熱點，干細胞因具有高度自我更新和多向分化潛能，成為細胞移植的首選靶細胞。細胞在體內分化為何種細胞受多種因素影響，包括微環境，相鄰或相近細胞誘導趨化作用，以及干細胞自身分泌的某種或某些趨化因子、細胞因子等。其中干細胞所處微環境對其增殖、分化的進程及方向具有決定性作用[9-11]，微環境包括化學微環境及力學微環境等。國內外一些學者應用組織勻漿模擬體內化學微環境誘導干細胞向特定細胞分化。王曉萃等[12]將腦勻漿上清液加入MSCs培養環境中進行誘導，誘導后的細胞具有神經元樣形態，并表達神經元細胞標記物NSE和神經絲蛋白；Luk等[13]將BMSCs與正常及損傷肝臟組織勻漿共培養，兩組細胞均檢測到肝細胞特異基因的表達；Choi等[14]采用胰腺提取物誘導鼠MSCs分化為胰島B細胞，且能夠分泌胰島素。
但周圍神經勻漿對ADSCs的誘導分化作用目前尚罕見報道。因此，本實驗采用兔正常坐骨神經、損傷3、7、14 d的坐骨神經勻漿上清液在體外對ADSCs進行誘導分化；誘導7 d，C、D、E組出現一定比例神經樣細胞，且存活時間較長。為證明其為何種細胞，我們采用實時熒光定量PCR法對其進行了鑒定。S-100是雪旺細胞特異性標記物，NSE是神經元表達的特異性蛋白，而Nestin是神經干細胞特異性標志。誘導7 d，實時熒光定量PCR結果表明所誘導的細胞為雪旺細胞和神經細胞。另外有研究表明，MSCs在腦組織勻漿培養條件下可向神經樣細胞分化，分化方向是先分化為神經干細胞，再向神經元樣細胞或星形膠質細胞分化[15]。而本實驗結果中Nestin基因相對表達量各組間差異無統計學意義，表明周圍神經勻漿上清液可將ADSCs誘導分化為雪旺細胞及神經細胞，但其誘導過程并不經歷神經干細胞這一階段，而是直接由ADSCs分化為雪旺細胞和神經細胞。
Ye等[16]通過模擬神經發育化學微環境，采用患者腦脊液誘導BMSCs為神經樣細胞，免疫熒光結果顯示其陽性率高于EGF、bFGF聯合誘導組。張儒有等[17]研究不同時期挫裂傷腦組織對神經干細胞分化的影響，認為腦挫裂傷后早期組織可誘導神經干細胞分化成更多神經元，腦挫裂傷后早期行神經干細胞移植可能有助于提高療效。Ankeny等[18]將MSCs植入大鼠損傷脊髓后，細胞表達膠質纖維酸性蛋白，提示MSCs在一定環境下可多向分化，脊髓勻漿上清液中可能包含促MSCs向神經細胞分化的誘導因子。本實驗結果顯示，損傷早期（3、7 d）坐骨神經勻漿上清液表現出相對較強的誘導作用，表明損傷早期局部化學微環境可能更有利于動員代償反應機制，導致各種神經生長因子分泌明顯增加。本課題組既往研究表明，損傷后不同時間坐骨神經勻漿上清液中bFGF、NGF及BDNF等生長因子含量與損傷時間有關，損傷后早期（3～7 d）其含量較高，之后均逐漸下降[19]。我們認為這些生長因子能夠促進神經組織增生，保護神經功能，同時能夠增強ADSCs向雪旺細胞和神經細胞方向分化。Hofstet ter 等[20]實驗研究表明，脊髓損傷后7 d采用干細胞移植治療比傷后立即進行干細胞移植治療能夠顯著提高細胞存活數量，并獲得明顯的功能改善。這些都為我們選擇最佳細胞移植時機提供了理論依據。
綜上述，干細胞所處化學微環境的改變可能是影響其向何種細胞分化的重要因素。兔坐骨神經勻漿上清液可誘導ADSCs分化為雪旺細胞和神經細胞，且傷后早期（3～7 d）誘導作用最強。由此我們推斷，傷后早期是進行干細胞移植治療的最佳時機，但其具體機制有待進一步研究明確。除了化學微環境外，干細胞在體內分化還受力學微環境的影響；另外，本研究中誘導后的雪旺細胞和神經細胞是否具有正常成熟細胞功能，均有待進一步研究。
