引用本文： 付維力, 陳剛, 唐新, 李棋, 李箭. BMP-12重組腺病毒載體轉染外周血MSCs向肌腱/韌帶細胞分化研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(4): 472-476. doi: 10.7507/1002-1892.20150102 復制
肌腱/韌帶損傷或病變因其自身愈合能力非常有限，其治療仍是骨科及運動醫學面臨的巨大挑戰，細胞治療和基因治療手段為其帶來了新希望[1]。中胚層來源的成體干細胞MSCs因具有較強的自我更新、多向分化潛能及免疫調控等優點，已被廣泛應用于肌腱/韌帶再生醫學領域[2]。骨髓是BMSCs最主要來源，也是用于肌腱/韌帶再生最多的種子細胞來源[3-4]；但BMSCs含量很低（約0.001%），且獲取骨髓創傷較大，存在供區并發癥[5-6]。外周血來源的MSCs，由于取材微創，且樣品處理過程中危險度低，可實現自體細胞移植，其作為一種可供選擇的MSCs來源用于肌腱/韌帶再生修復已成為近年研究焦點，具有臨床應用前景[7]。BMP-12也稱為生長分化因子7或軟骨衍生形態發生蛋白3，屬于TGF-β超家族成員，具有較強的誘導肌腱/韌帶樣組織形成能力[8-11]，但其對外周血MSCs的分化作用尚未證實。因此，本研究采用BMP-12基因轉染誘導外周血MSCs向肌腱/韌帶細胞分化，為臨床肌腱/韌帶損傷或病變的再生研究奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
3～4月齡新西蘭兔5只，雌雄不限，體重約3 kg，由四川大學華西醫學中心實驗動物部提供。攜帶BMP-12基因的cDNA第1代血清型5型腺病毒載體和AdEasy腺病毒載體系統由北京大學基礎醫學院周春燕教授惠贈。293A細胞購自美國ATCC公司。
密度為1.077 g/mL的Ficoll淋巴細胞分離液（北京鼎國生物技術有限責任公司）；FBS（HyClone公司，美國）；青霉素、鏈霉素、兩性霉素B（華北制藥有限公司）；L-谷氨酰胺、αMEM培養基（GIBCO公司，美國）； Lipofectamine2000、Trizol試劑（In ve tro gen公司，美國）；山羊血清、山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Ⅰ型膠原抗體（Merck公司，德國）；逆轉錄酶（Promega公司，美國）；SYBR Green real-time PCR Master Mix（TOY OBO公司，日本）。
流式細胞儀（flow cytometry，FCM；BD公司,美國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；ABI7700 型實時定量PCR 儀（ABI公司，美國）。
1.2 外周血MSCs分離培養
于麻醉和無菌條件下，用含300 U/mL肝素帶18號針頭的注射器從新西蘭兔耳中央動脈抽吸10 mL外周血。每份血液樣本用1∶1 PBS稀釋，小心加在等體積Ficoll淋巴細胞分離液上層，室溫以1 258×g離心30 min；仔細吸出中間棕黃色的單核細胞層，PBS洗滌后以200×g離心10 min收集細胞，重懸于完全培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/ mL鏈霉素、25 ng/mL兩性霉素B、2 mmol/L L-谷氨酰胺的αMEM培養基）中，置于37℃、 5%CO2和飽和濕度培養箱中孵育。3～5 d后棄非貼壁細胞和碎片，PBS清洗，更換新的完全培養基；每3～4天換液1次。10～15 d細胞達80%～90%融合時，0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA消化傳代。收集第3代細胞用于以下實驗[12]。
1.3 BMP-12重組腺病毒載體構建、病毒包裝及擴增純化
使用AdEasy腺病毒載體系統制備BMP-12重組腺病毒載體[13]。插入目的基因片段BMP-12-cDNA的穿梭質粒pAdtrack-CMV-BMP-12，用PmeΙ行酶切線性化后，轉入攜帶腺病毒骨架載體pAdEasy-1的E.coli.BJ5183菌株進行細菌內重組。將線性化的重組質粒按照Lipofectamine2000說明書轉入293A細胞中進行病毒包裝。BMP-12基因隨著重組腺病毒在感染的293A細胞中大量擴增，液氮反復凍融細胞3～4次，以13 400×g離心30 min，取上清收獲病毒，并通過氯化銫梯度離心法純化。純化的病毒液中加入10% FBS，以1×1010 pfu/ mL滴度[14]于-80℃保存備用。
1.4 BMP-12重組腺病毒體外轉染外周血MSCs
取第3代外周血MSCs生長至80%～90%融合時，用巴氏吸管吸除培養液，PBS洗滌1次后加入含感染復數為100[15]的病毒液的無血清αMEM培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱孵育6～8 h后，換含10%FBS的αMEM培養基繼續培養，每3天換液1次。
1.5 觀測指標
1.5.1 轉染效率檢測
① 倒置相差顯微鏡觀察：轉染后24 h，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況。② 熒光顯微鏡觀察：轉染后8、24 h在熒光顯微鏡下觀察轉染組的轉染效果。③ FCM檢測：轉染后24 h，用0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA消化細胞，PBS洗滌，流式細胞儀檢測轉染組細胞轉染效率，并設未轉染組為對照組。
1.5.2 肌腱/韌帶特異標記表達水平檢測
① 免疫組織化學染色：取轉染后即刻（0 d）、轉染后7 d和14 d細胞爬片，經PBS漂洗后，丙酮固定20 min，3%H2O2阻斷細胞內源性過氧化物酶15 min，5%山羊血清封閉15 min，滴加一抗（1∶200）室溫孵育1 h。PBS漂洗3次后，滴加二抗（1∶200）室溫孵育30 min。DAB顯色，光鏡下觀察。② 實時熒光定量PCR檢測：轉染組轉染后14 d，采用實時熒光定量PCR檢測肌腱/韌帶特異基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin mRNA表達水平。采用Trizol法提取細胞總RNA，經AMV 逆轉錄酶轉錄合成cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix在實時定量PCR 儀上行PCR反應，引物序列見表 1。反應體系15 μL： 2×SYBR Green緩沖液7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，滅菌去離子水補齊至15 μL。反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，40個循環。以GAPDH為對照基因，采用2-ΔΔCt 法計算各目的基因mRNA表達水平。同時設未轉染組細胞作為對照。
表1
實時熒光定量PCR檢測目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes for real-time fluorescent quantitative PCR
1.6 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 轉染效率觀察
2.1.1 倒置相差顯微鏡觀察
轉染后24 h，鏡下可見細胞生長增殖緩慢，細胞形態及輪廓清晰（圖 1）。
圖1
轉染后24 h倒置相差顯微鏡觀察細胞形態（×100）? ?圖 2 轉染后24 h熒光顯微鏡觀察GFP表達（×100）? ?圖 3 轉染后24 h FCM檢測 ? 轉染組 ? 未轉染組? ?圖 4 轉染后各時間點免疫組織化學染色觀察Ⅰ型膠原表達（×100） ? 0 d ? 7 d ? 14 d
Figure1.
The morphological characteristics of peripheral blood MSCs after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours under inverted phase contrast microscope (×100)? ? Fig. 2 GFP expression after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours under fluorescence microscopy (×100)? ? Fig. 3 Flow cytometry detection after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours ? Transfected group ? Untransfected group? ? Fig. 4 The immunohistochemical staining of collagen type Ι after transfected with Ad-BMP-12 at different time (×100) ? 0 day ? Seven days ? Fourteen days
2.1.2 熒光顯微鏡觀察
轉染后8 h，熒光顯微鏡下可見GFP表達；隨著體外培養時間延長，表達GFP的細胞逐漸增多，熒光強度也逐漸增強，轉染24 h，幾乎所有細胞均可見GFP表達，細胞質和細胞核均顯示綠色熒光（圖 2）。
2.1.3 FCM檢測
轉染后24 h FCM檢測示，轉染組轉染效率為99.57%，未轉染組為2.46%（圖 3）。
2.2 肌腱/韌帶特異標記表達水平檢測
2.2.1 免疫組織化學染色
光鏡觀察示，隨轉染時間延長，Ⅰ型膠原表達逐漸增強（圖 4）。
2.2.2 實時熒光定量PCR檢測
轉染組轉染后14 d，肌腱/韌帶特異基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin mRNA表達水平分別為0.061±0.013、0.029±0.008、0.679±0.067，均顯著高于未轉染組的0.004±0.002、0.003±0.001、0.142±0.024，差異有統計學意義（t= -7.700，P=0.031；t= -5.741，P=0.020；t= -1 2.998，P=0.000）。
3 討論
相比其他來源的MSCs，外周血來源MSCs具有取材微創、采集簡便等優點，且有利于實現自體細胞微創移植，在骨骼肌肉系統損傷治療以及肌腱/韌帶修復重建方面具有應用前景[16-17]。BMP-12具有較強的成肌腱/韌帶組織能力，有學者在兔模型上采用BMP-12基因修飾促進了后交叉韌帶損傷的組織學和生物力學愈合[18]。傳統的外源性BMP-12能有效誘導MSCs向肌腱樣細胞分化。直接添加外源性生長因子價格較昂貴且發揮生物活性時間短[19]。故本研究構建BMP-12重組腺病毒表達載體，采用基因工程的方法將BMP-12基因轉入至外周血MSCs，使外源性基因在一定時間內高效表達。用BMP-12重組腺病毒表達載體轉染外周血MSCs，可明顯促進外周血MSCs向肌腱/韌帶成纖維細胞表型分化并促進肌腱/韌帶特異基因表達和細胞外基質分泌。但目前尚無單一的表型標記來鑒定成熟的肌腱/韌帶成纖維細胞，因此本研究采用免疫組織化學和實時熒光定量PCR，從蛋白和基因水平來評價BMP-12重組腺病毒表達載體轉染外周血MSCs促進其向肌腱/韌帶細胞分化效果。
有學者研究BMP-12誘導脂肪來源干細胞成肌腱細胞分化能力，在犬和小鼠模型上BMP-12能有效增加肌腱標志物scleraxis 和 tenomodulin mRNA和蛋白表達水平。BMPs發揮作用是通過激活經典的Smad信號通路和非經典的MAPK通路進行調節，BMP-12是通過激活脂肪來源干細胞Smad1/5/8的磷酸化或p38 MAPK發揮作用[20]。
本研究采用BMP-12重組腺病毒表達載體成功轉染外周血MSCs，并誘導其向肌腱/韌帶細胞分化。重組腺病毒表達載體具有滴度高、易感染、毒性低、病毒粒子相對穩定、容納量大、非整合宿主染色體無插入突變風險等優點，被廣泛應用于基因工程表達載體系統，但存在有免疫原性、外源基因表達時間較短等缺陷。因此未來攜帶基因表達載體的研究應集中于腺病毒載體的優化改良或開發非病毒載體系統[21]。
綜上述，本研究將Ad-BMP12成功傳染外周血MSCs，誘導其成肌腱/韌帶細胞分化取得了較好效果，為外周血MSCs參與肌腱/韌帶損傷或病變的再生修復提供了參考，但確切機制尚需進一步研究。
肌腱/韌帶損傷或病變因其自身愈合能力非常有限，其治療仍是骨科及運動醫學面臨的巨大挑戰，細胞治療和基因治療手段為其帶來了新希望[1]。中胚層來源的成體干細胞MSCs因具有較強的自我更新、多向分化潛能及免疫調控等優點，已被廣泛應用于肌腱/韌帶再生醫學領域[2]。骨髓是BMSCs最主要來源，也是用于肌腱/韌帶再生最多的種子細胞來源[3-4]；但BMSCs含量很低（約0.001%），且獲取骨髓創傷較大，存在供區并發癥[5-6]。外周血來源的MSCs，由于取材微創，且樣品處理過程中危險度低，可實現自體細胞移植，其作為一種可供選擇的MSCs來源用于肌腱/韌帶再生修復已成為近年研究焦點，具有臨床應用前景[7]。BMP-12也稱為生長分化因子7或軟骨衍生形態發生蛋白3，屬于TGF-β超家族成員，具有較強的誘導肌腱/韌帶樣組織形成能力[8-11]，但其對外周血MSCs的分化作用尚未證實。因此，本研究采用BMP-12基因轉染誘導外周血MSCs向肌腱/韌帶細胞分化，為臨床肌腱/韌帶損傷或病變的再生研究奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
3～4月齡新西蘭兔5只，雌雄不限，體重約3 kg，由四川大學華西醫學中心實驗動物部提供。攜帶BMP-12基因的cDNA第1代血清型5型腺病毒載體和AdEasy腺病毒載體系統由北京大學基礎醫學院周春燕教授惠贈。293A細胞購自美國ATCC公司。
密度為1.077 g/mL的Ficoll淋巴細胞分離液（北京鼎國生物技術有限責任公司）；FBS（HyClone公司，美國）；青霉素、鏈霉素、兩性霉素B（華北制藥有限公司）；L-谷氨酰胺、αMEM培養基（GIBCO公司，美國）； Lipofectamine2000、Trizol試劑（In ve tro gen公司，美國）；山羊血清、山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Ⅰ型膠原抗體（Merck公司，德國）；逆轉錄酶（Promega公司，美國）；SYBR Green real-time PCR Master Mix（TOY OBO公司，日本）。
流式細胞儀（flow cytometry，FCM；BD公司,美國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；ABI7700 型實時定量PCR 儀（ABI公司，美國）。
1.2 外周血MSCs分離培養
于麻醉和無菌條件下，用含300 U/mL肝素帶18號針頭的注射器從新西蘭兔耳中央動脈抽吸10 mL外周血。每份血液樣本用1∶1 PBS稀釋，小心加在等體積Ficoll淋巴細胞分離液上層，室溫以1 258×g離心30 min；仔細吸出中間棕黃色的單核細胞層，PBS洗滌后以200×g離心10 min收集細胞，重懸于完全培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/ mL鏈霉素、25 ng/mL兩性霉素B、2 mmol/L L-谷氨酰胺的αMEM培養基）中，置于37℃、 5%CO2和飽和濕度培養箱中孵育。3～5 d后棄非貼壁細胞和碎片，PBS清洗，更換新的完全培養基；每3～4天換液1次。10～15 d細胞達80%～90%融合時，0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA消化傳代。收集第3代細胞用于以下實驗[12]。
1.3 BMP-12重組腺病毒載體構建、病毒包裝及擴增純化
使用AdEasy腺病毒載體系統制備BMP-12重組腺病毒載體[13]。插入目的基因片段BMP-12-cDNA的穿梭質粒pAdtrack-CMV-BMP-12，用PmeΙ行酶切線性化后，轉入攜帶腺病毒骨架載體pAdEasy-1的E.coli.BJ5183菌株進行細菌內重組。將線性化的重組質粒按照Lipofectamine2000說明書轉入293A細胞中進行病毒包裝。BMP-12基因隨著重組腺病毒在感染的293A細胞中大量擴增，液氮反復凍融細胞3～4次，以13 400×g離心30 min，取上清收獲病毒，并通過氯化銫梯度離心法純化。純化的病毒液中加入10% FBS，以1×1010 pfu/ mL滴度[14]于-80℃保存備用。
1.4 BMP-12重組腺病毒體外轉染外周血MSCs
取第3代外周血MSCs生長至80%～90%融合時，用巴氏吸管吸除培養液，PBS洗滌1次后加入含感染復數為100[15]的病毒液的無血清αMEM培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱孵育6～8 h后，換含10%FBS的αMEM培養基繼續培養，每3天換液1次。
1.5 觀測指標
1.5.1 轉染效率檢測
① 倒置相差顯微鏡觀察：轉染后24 h，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況。② 熒光顯微鏡觀察：轉染后8、24 h在熒光顯微鏡下觀察轉染組的轉染效果。③ FCM檢測：轉染后24 h，用0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA消化細胞，PBS洗滌，流式細胞儀檢測轉染組細胞轉染效率，并設未轉染組為對照組。
1.5.2 肌腱/韌帶特異標記表達水平檢測
① 免疫組織化學染色：取轉染后即刻（0 d）、轉染后7 d和14 d細胞爬片，經PBS漂洗后，丙酮固定20 min，3%H2O2阻斷細胞內源性過氧化物酶15 min，5%山羊血清封閉15 min，滴加一抗（1∶200）室溫孵育1 h。PBS漂洗3次后，滴加二抗（1∶200）室溫孵育30 min。DAB顯色，光鏡下觀察。② 實時熒光定量PCR檢測：轉染組轉染后14 d，采用實時熒光定量PCR檢測肌腱/韌帶特異基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin mRNA表達水平。采用Trizol法提取細胞總RNA，經AMV 逆轉錄酶轉錄合成cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix在實時定量PCR 儀上行PCR反應，引物序列見表 1。反應體系15 μL： 2×SYBR Green緩沖液7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，滅菌去離子水補齊至15 μL。反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，40個循環。以GAPDH為對照基因，采用2-ΔΔCt 法計算各目的基因mRNA表達水平。同時設未轉染組細胞作為對照。
表1
實時熒光定量PCR檢測目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes for real-time fluorescent quantitative PCR
1.6 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 轉染效率觀察
2.1.1 倒置相差顯微鏡觀察
轉染后24 h，鏡下可見細胞生長增殖緩慢，細胞形態及輪廓清晰（圖 1）。
圖1
轉染后24 h倒置相差顯微鏡觀察細胞形態（×100）? ?圖 2 轉染后24 h熒光顯微鏡觀察GFP表達（×100）? ?圖 3 轉染后24 h FCM檢測 ? 轉染組 ? 未轉染組? ?圖 4 轉染后各時間點免疫組織化學染色觀察Ⅰ型膠原表達（×100） ? 0 d ? 7 d ? 14 d
Figure1.
The morphological characteristics of peripheral blood MSCs after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours under inverted phase contrast microscope (×100)? ? Fig. 2 GFP expression after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours under fluorescence microscopy (×100)? ? Fig. 3 Flow cytometry detection after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours ? Transfected group ? Untransfected group? ? Fig. 4 The immunohistochemical staining of collagen type Ι after transfected with Ad-BMP-12 at different time (×100) ? 0 day ? Seven days ? Fourteen days
2.1.2 熒光顯微鏡觀察
轉染后8 h，熒光顯微鏡下可見GFP表達；隨著體外培養時間延長，表達GFP的細胞逐漸增多，熒光強度也逐漸增強，轉染24 h，幾乎所有細胞均可見GFP表達，細胞質和細胞核均顯示綠色熒光（圖 2）。
2.1.3 FCM檢測
轉染后24 h FCM檢測示，轉染組轉染效率為99.57%，未轉染組為2.46%（圖 3）。
2.2 肌腱/韌帶特異標記表達水平檢測
2.2.1 免疫組織化學染色
光鏡觀察示，隨轉染時間延長，Ⅰ型膠原表達逐漸增強（圖 4）。
2.2.2 實時熒光定量PCR檢測
轉染組轉染后14 d，肌腱/韌帶特異基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin mRNA表達水平分別為0.061±0.013、0.029±0.008、0.679±0.067，均顯著高于未轉染組的0.004±0.002、0.003±0.001、0.142±0.024，差異有統計學意義（t= -7.700，P=0.031；t= -5.741，P=0.020；t= -1 2.998，P=0.000）。
3 討論
相比其他來源的MSCs，外周血來源MSCs具有取材微創、采集簡便等優點，且有利于實現自體細胞微創移植，在骨骼肌肉系統損傷治療以及肌腱/韌帶修復重建方面具有應用前景[16-17]。BMP-12具有較強的成肌腱/韌帶組織能力，有學者在兔模型上采用BMP-12基因修飾促進了后交叉韌帶損傷的組織學和生物力學愈合[18]。傳統的外源性BMP-12能有效誘導MSCs向肌腱樣細胞分化。直接添加外源性生長因子價格較昂貴且發揮生物活性時間短[19]。故本研究構建BMP-12重組腺病毒表達載體，采用基因工程的方法將BMP-12基因轉入至外周血MSCs，使外源性基因在一定時間內高效表達。用BMP-12重組腺病毒表達載體轉染外周血MSCs，可明顯促進外周血MSCs向肌腱/韌帶成纖維細胞表型分化并促進肌腱/韌帶特異基因表達和細胞外基質分泌。但目前尚無單一的表型標記來鑒定成熟的肌腱/韌帶成纖維細胞，因此本研究采用免疫組織化學和實時熒光定量PCR，從蛋白和基因水平來評價BMP-12重組腺病毒表達載體轉染外周血MSCs促進其向肌腱/韌帶細胞分化效果。
有學者研究BMP-12誘導脂肪來源干細胞成肌腱細胞分化能力，在犬和小鼠模型上BMP-12能有效增加肌腱標志物scleraxis 和 tenomodulin mRNA和蛋白表達水平。BMPs發揮作用是通過激活經典的Smad信號通路和非經典的MAPK通路進行調節，BMP-12是通過激活脂肪來源干細胞Smad1/5/8的磷酸化或p38 MAPK發揮作用[20]。
本研究采用BMP-12重組腺病毒表達載體成功轉染外周血MSCs，并誘導其向肌腱/韌帶細胞分化。重組腺病毒表達載體具有滴度高、易感染、毒性低、病毒粒子相對穩定、容納量大、非整合宿主染色體無插入突變風險等優點，被廣泛應用于基因工程表達載體系統，但存在有免疫原性、外源基因表達時間較短等缺陷。因此未來攜帶基因表達載體的研究應集中于腺病毒載體的優化改良或開發非病毒載體系統[21]。
綜上述，本研究將Ad-BMP12成功傳染外周血MSCs，誘導其成肌腱/韌帶細胞分化取得了較好效果，為外周血MSCs參與肌腱/韌帶損傷或病變的再生修復提供了參考，但確切機制尚需進一步研究。
