引用本文： 王小燕, 陳穎, 黃云超, 周友全, 趙光強, 葉聯華, 雷玉潔, 湯琦. 表皮葡萄球菌生物膜形成相關基因在表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合生物膜形成中的作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(1): 63-68. doi: 10.7507/1002-1892.20150015 復制
表皮葡萄球菌是存在于人體皮膚和黏膜的重要條件致病菌，常隨生物材料植入進入人體，并黏附在生物材料表面形成生物膜，導致術后感染反復發作、遷延不愈[1-3]。據報道，超過60%的感染性疾病與生物膜形成相關[4]。在感染治療過程中，隨著廣譜抗生素、皮質類固醇制劑的應用，后期常合并多種微生物混合感染，導致治療失敗。研究顯示，臨床出現的多種微生物混合感染通常是由凝固酶陰性葡萄球菌尤其是表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合感染引起[5-6]。與單一微生物感染相比，混合微生物感染預后較差，死亡率是單一微生物感染的2倍[7]。目前國內外關于生物膜感染的研究多基于單一微生物感染[8-9]，表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合微生物感染研究較少，且多為生物膜觀察報道。
聚氯乙烯氣管導管作為修復重建外科常用的生物材料，單一微生物感染的相關研究已有報道[10-11]。本實驗通過建立表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合生物膜模型，用結晶紫染色法半定量檢測生物膜形成能力，二甲氧唑黃[（2，3 bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）5 〔（phenylamino）Carbonyl〕 2H tetrazolium hydroxide assay，XTT]比色法評價生物膜的體外生長動力學；掃描電鏡觀察生物膜超微結構；熒光定量PCR分析表皮葡萄球菌生物膜形成相關基因--胞間黏附素A（intercellular adhesion A，icaA）基因、纖維蛋白原結合蛋白（fibrinogen binding protein，fbe）基因、聚集相關蛋白（accumulation-associated protein，aap）基因的表達情況，旨在為生物材料植入所致混合微生物膜感染防治提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗菌株及材料
表皮葡萄球菌標準株ATCC35984購自美國典型菌種保藏中心，白假絲酵母菌標準株ATCC10231購自中國科學院微生物研究所。聚氯乙烯氣管導管購自杭州坦帕醫療科技有限公司。
1.2 主要試劑及儀器
MH瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；沙保羅瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）；XTT細菌增殖及細菌毒性檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；PBS（上海立菲生物技術有限公司）；TRNzol-A+、FastQuant cDNA第1鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。多功能酶標儀（Thermo公司，美國）；掃描電鏡（HITACHI公司，日本）；熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為3組，單純表皮葡萄球菌ATCC35984培養組（表葡組）、單純白假絲酵母菌ATCC10231培養組（白念組）、表皮葡萄球菌ATCC35984和白假絲酵母菌ATCC10231混合培養組（混合組）。
將凍存的表皮葡萄球菌ATCC35984接種至MH瓊脂平板，白假絲酵母菌ATCC10231接種至沙保羅瓊脂平板，于35℃培養24 h，接種環挑取平板上單個菌落，分別接種至含5 mL TSB培養基的試管中，然后將試管放入恒溫振蕩器中，以35℃、90轉/ min培養16～18 h。待菌細胞生長至對數生長期后，用TSB培養基調整菌液濃度為1×106CFU/mL，即為表葡組和白念組。將調整濃度后的表葡組和白念組菌液按照1∶1配制即為混合組。菌液均為檢測前新鮮配制。
1.4 觀測指標
1.4.1 結晶紫染色法生物膜半定量檢測
取各組菌液100 μL，接種于96孔板，置于35℃溫箱培養，分別于培養后2、4、6、8、12、24、48、72 h，各組取10孔棄培養基，PBS洗去未黏附菌。將2%結晶紫100 μL加入孔內，35℃孵育30 min，PBS洗3次，加入DMSO溶解后，采用多功能酶標儀測定波長490 nm處的吸光度（A）值[12]；以A值大小反映黏附能力強弱，間接反映微生物形成生物膜的厚度。以只加入TSB培養基作為空白對照。以各實驗組A值與空白對照A值差值作為最終檢測值。實驗重復6次。
1.4.2 XTT比色法生長動力學檢測
同1.4.1方法接種培養生物膜，分別于上述各時間點各組取10孔，棄培養基，PBS洗去未黏附菌，各孔加入100 μL TSB培養基和20 μL XTT溶液，35℃繼續避光孵育2 h。以只加入TSB培養基和XTT溶液作為空白對照。采用多功能酶標儀測定波長450 nm處A值，以A值大小反應菌細胞活度[13]。以各實驗組A值與空白對照A值差值作為最終檢測值。實驗重復6次。
1.4.3 掃描電鏡觀察生物膜超微結構
取聚氯乙烯氣管導管套囊，用打孔器制備直徑0.8 cm的圓片，低溫等離子滅菌器滅菌。將氣管導管圓片置于24孔板中，每孔1片，分別加入各組菌液2 mL/孔，35℃溫箱孵育24、72 h后取出氣管導管圓片；PBS沖洗后置于3.5%戊二醛，4℃固定24 h；PBS沖洗3次，每次10 min；置于1%鋨酸溶液，4℃固定2 h；乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換20 min；叔丁醇40℃滲透2 h；-20℃冷凍、CO2臨界點干燥、真空鍍金。掃描電鏡下觀察氣管導管圓片表面生物膜形成情況。
1.4.4 熒光定量PCR檢測
熒光定量PCR分析表葡組及混合組中表皮葡萄球菌生物膜形成相關基因的表達。將氣管導管圓片置于24孔板中，每孔1片，分別加入表葡組及混合組菌液2 mL/孔，各組10片。置于35℃溫箱孵育，每24小時更換TSB培養基。孵育72 h取出氣管導管圓片，按照TRNzol-A+操作步驟提取生物膜總RNA。使用FastQuant cDNA第1鏈合成試劑盒，逆轉錄成cDNA后，SuperReal熒光定量試劑盒行RT-PCR檢測。參照文獻[14-15]設計icaA、fbe、aap及16s RNA特異性引物，引物由Invitrogen公司合成，引物序列見表 1。95℃孵育15 min預變性，95℃孵育10 s變性，60℃ 31 s退火/延伸，共40個循環。以各目的基因與16sRNA表達比值作為其相對表達量。各樣品重復測量3次。
表1
各目的基因引物序列及產物長度
Table1.
The primer sequence and length of product
1.5 統計學方法
采用SPSS11.5統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 結晶紫染色法生物膜半定量檢測
混合組和表葡組均在培養12 h生物膜明顯增厚，24 h出現迅速增長趨勢，72 h混合組超過表葡組；白念組12 h出現生物膜，48 h出現明顯增長趨勢并維持至72 h。在整個培養周期，白念組生物膜厚度均低于混合組。組間比較，培養2、4、6、72 h表葡組A值低于混合組，但8、12、24、48 h高于混合組；除72 h差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各時間點兩組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；白念組在2～72 h整個培養周期，A值均顯著低于混合組，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1。
圖1
各組不同時點結晶紫染色法生物膜半定量檢測 ? ?2.2 XTT比色法生長動力學檢測
XTT比色法生長動力學檢測示，各組均在培養6 h生長加速，12～48 h維持高生長動力，72 h再次出現生長明顯加快。混合組生長速度快于白念組，且48 h后超過表葡組。組間比較：混合組2、4、6、8、12、24 h時A值低于表葡組，48、72 h時高于表葡組；但除12 h兩組差異有統計學意義（P＜0.05）外，其余各時間點兩組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。混合組2、4 h時A值低于白念組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；6 h后各時間點混合組A值均顯著高于白念組，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2。
2.3 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，表葡組培養24 h可見表皮葡萄球菌生物膜呈團塊狀、蘑菇樣，具有多層結構，初步形成成熟生物膜；72 h葡萄球菌生長更密集，形成層次更復雜、更成熟的生物膜。白念組培養24 h可見白假絲酵母菌形成的生物膜中有大量孢子及假菌絲，孢子與假菌絲形成密集排列的網狀立體結構，孢子沿著菌絲成團聚集；72 h可見孢子及菌絲密集排列、相互交織，形成更為成熟的生物膜。混合組培養24 h可見表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌的孢子及假菌絲呈團塊狀混雜生長，在孢子與假菌絲形成立體網狀結構中混有大量表皮葡萄球菌；72 h可見更多的表皮葡萄球菌黏附在白假絲酵母菌菌絲和孢子表面，幾乎將菌絲和孢子完全包裹，生物膜更加成熟。見圖 3。
2.4 熒光定量PCR檢測
熒光定量PCR結果顯示，培養72 h時混合組fbe、icaA、aap基因相對表達量分別為28.60±0.20、24.72±0.22及25.27±0.14，與表葡組的29.67±0.38、25.45±0.05及25.94±0.04相比，平均分別增高了1.93、1.52、1.46倍，差異均有統計學意義（t=4.737，P=0.009；t=4.231，P=0.013；t=3.119，P=0.036）。
3 討論
近年來，隨著生物材料的廣泛應用，生物材料表面細菌生物膜感染已成為常見醫院內感染。生物材料的植入不僅增加了細菌入侵宿主的途徑，還降低了誘發機體感染的最低細菌數量。大量臨床報道顯示[5-7, 10]，混合微生物感染的發病率逐年升高，且混合微生物感染較單一微生物感染更易出現耐藥，治療效果不佳、病情反復明顯。綜合分析本研究結晶紫半定量檢測、XTT比色法生長動力學檢測及掃描電鏡觀察結果，提示表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌同時存在于生物材料表面后，能形成較單一微生物生長動力學更高以及結構更致密、更復雜的混合生物膜；表皮葡萄球菌黏附在白假絲酵母菌菌絲及孢子表面，使抗菌藥物更難發揮作用及抗真菌能效降低，這可能是臨床表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合感染耐藥性增加、病情遷延不愈的原因。
表皮葡萄球菌icaA基因編碼的多糖胞間黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）、aap基因編碼的聚集相關蛋白（Aap）、fbe基因編碼的纖維蛋白原結合蛋白（Fbe）參與了生物膜形成。在表皮葡萄球菌形成生物膜的黏附階段，fbe基因編碼合成Fbe，與宿主纖維蛋白原結合，介導表皮葡萄球菌黏附于生物材料表面，促使生物膜形成。在細菌增殖和聚集階段則通過PIA、Aap等因子發揮作用。研究表明，在表皮葡萄球菌生物膜形成所致感染中，ica基因在生物膜形成過程中起重要作用[16-17]。其編碼的PIA不僅參與生物膜形成，還與生物膜耐藥性密切相關，并影響生物膜的立體結構，是目前發現的與表皮葡萄球菌致病性關系最為密切的因子。國內外研究顯示，ica基因陰性的表皮葡萄球菌通過aap基因編碼的Aap形成蛋白依賴的生物膜，說明Aap作為聚集階段的另一重要因子，在生物膜形成中發揮一定作用[18-19]。宋超等[20]研究發現，假單胞菌屬、克雷白菌屬、鏈球菌菌屬存在伴隨生長關系，在生物膜形成過程中相互作用。本研究熒光定量PCR結果顯示，與表葡組相比，混合組 fbe、icaA、aap基因表達量分別增高1.93、1.52、1.46倍。結合宋超等[20]研究結果，我們分析在混合生物膜形成過程中，可能存在細菌與真菌之間不同水平相互作用，通過不同通路使表皮葡萄球菌icaA、fbe、aap表達量上調，在混合生物膜形成中起重要作用。
目前，臨床生物材料相關感染多為混合生物膜感染，國內外有關研究集中在生物膜觀察、可能藥物預防等方面[21-22]，對發生機制罕見報道。我們根據既往研究，設計并實施了本次研究，以期對臨床常見生物材料相關混合微生物感染的防治提供思路。通過觀察發現，表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合生長能形成較單一微生物更厚、結構更復雜的混合生物膜，進而導致慢性感染耐藥及遷延不愈；混合生物膜較單一生物膜更厚，可能與表皮葡萄球菌icaA、fbe、aap基因表達增加有關。生物膜的形成與調控是多層次、多通路的復雜過程，除此基因之外還有哪些機制參與調控尚有待進一步研究。
表皮葡萄球菌是存在于人體皮膚和黏膜的重要條件致病菌，常隨生物材料植入進入人體，并黏附在生物材料表面形成生物膜，導致術后感染反復發作、遷延不愈[1-3]。據報道，超過60%的感染性疾病與生物膜形成相關[4]。在感染治療過程中，隨著廣譜抗生素、皮質類固醇制劑的應用，后期常合并多種微生物混合感染，導致治療失敗。研究顯示，臨床出現的多種微生物混合感染通常是由凝固酶陰性葡萄球菌尤其是表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合感染引起[5-6]。與單一微生物感染相比，混合微生物感染預后較差，死亡率是單一微生物感染的2倍[7]。目前國內外關于生物膜感染的研究多基于單一微生物感染[8-9]，表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合微生物感染研究較少，且多為生物膜觀察報道。
聚氯乙烯氣管導管作為修復重建外科常用的生物材料，單一微生物感染的相關研究已有報道[10-11]。本實驗通過建立表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合生物膜模型，用結晶紫染色法半定量檢測生物膜形成能力，二甲氧唑黃[（2，3 bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）5 〔（phenylamino）Carbonyl〕 2H tetrazolium hydroxide assay，XTT]比色法評價生物膜的體外生長動力學；掃描電鏡觀察生物膜超微結構；熒光定量PCR分析表皮葡萄球菌生物膜形成相關基因--胞間黏附素A（intercellular adhesion A，icaA）基因、纖維蛋白原結合蛋白（fibrinogen binding protein，fbe）基因、聚集相關蛋白（accumulation-associated protein，aap）基因的表達情況，旨在為生物材料植入所致混合微生物膜感染防治提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗菌株及材料
表皮葡萄球菌標準株ATCC35984購自美國典型菌種保藏中心，白假絲酵母菌標準株ATCC10231購自中國科學院微生物研究所。聚氯乙烯氣管導管購自杭州坦帕醫療科技有限公司。
1.2 主要試劑及儀器
MH瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；沙保羅瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）；XTT細菌增殖及細菌毒性檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；PBS（上海立菲生物技術有限公司）；TRNzol-A+、FastQuant cDNA第1鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。多功能酶標儀（Thermo公司，美國）；掃描電鏡（HITACHI公司，日本）；熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為3組，單純表皮葡萄球菌ATCC35984培養組（表葡組）、單純白假絲酵母菌ATCC10231培養組（白念組）、表皮葡萄球菌ATCC35984和白假絲酵母菌ATCC10231混合培養組（混合組）。
將凍存的表皮葡萄球菌ATCC35984接種至MH瓊脂平板，白假絲酵母菌ATCC10231接種至沙保羅瓊脂平板，于35℃培養24 h，接種環挑取平板上單個菌落，分別接種至含5 mL TSB培養基的試管中，然后將試管放入恒溫振蕩器中，以35℃、90轉/ min培養16～18 h。待菌細胞生長至對數生長期后，用TSB培養基調整菌液濃度為1×106CFU/mL，即為表葡組和白念組。將調整濃度后的表葡組和白念組菌液按照1∶1配制即為混合組。菌液均為檢測前新鮮配制。
1.4 觀測指標
1.4.1 結晶紫染色法生物膜半定量檢測
取各組菌液100 μL，接種于96孔板，置于35℃溫箱培養，分別于培養后2、4、6、8、12、24、48、72 h，各組取10孔棄培養基，PBS洗去未黏附菌。將2%結晶紫100 μL加入孔內，35℃孵育30 min，PBS洗3次，加入DMSO溶解后，采用多功能酶標儀測定波長490 nm處的吸光度（A）值[12]；以A值大小反映黏附能力強弱，間接反映微生物形成生物膜的厚度。以只加入TSB培養基作為空白對照。以各實驗組A值與空白對照A值差值作為最終檢測值。實驗重復6次。
1.4.2 XTT比色法生長動力學檢測
同1.4.1方法接種培養生物膜，分別于上述各時間點各組取10孔，棄培養基，PBS洗去未黏附菌，各孔加入100 μL TSB培養基和20 μL XTT溶液，35℃繼續避光孵育2 h。以只加入TSB培養基和XTT溶液作為空白對照。采用多功能酶標儀測定波長450 nm處A值，以A值大小反應菌細胞活度[13]。以各實驗組A值與空白對照A值差值作為最終檢測值。實驗重復6次。
1.4.3 掃描電鏡觀察生物膜超微結構
取聚氯乙烯氣管導管套囊，用打孔器制備直徑0.8 cm的圓片，低溫等離子滅菌器滅菌。將氣管導管圓片置于24孔板中，每孔1片，分別加入各組菌液2 mL/孔，35℃溫箱孵育24、72 h后取出氣管導管圓片；PBS沖洗后置于3.5%戊二醛，4℃固定24 h；PBS沖洗3次，每次10 min；置于1%鋨酸溶液，4℃固定2 h；乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換20 min；叔丁醇40℃滲透2 h；-20℃冷凍、CO2臨界點干燥、真空鍍金。掃描電鏡下觀察氣管導管圓片表面生物膜形成情況。
1.4.4 熒光定量PCR檢測
熒光定量PCR分析表葡組及混合組中表皮葡萄球菌生物膜形成相關基因的表達。將氣管導管圓片置于24孔板中，每孔1片，分別加入表葡組及混合組菌液2 mL/孔，各組10片。置于35℃溫箱孵育，每24小時更換TSB培養基。孵育72 h取出氣管導管圓片，按照TRNzol-A+操作步驟提取生物膜總RNA。使用FastQuant cDNA第1鏈合成試劑盒，逆轉錄成cDNA后，SuperReal熒光定量試劑盒行RT-PCR檢測。參照文獻[14-15]設計icaA、fbe、aap及16s RNA特異性引物，引物由Invitrogen公司合成，引物序列見表 1。95℃孵育15 min預變性，95℃孵育10 s變性，60℃ 31 s退火/延伸，共40個循環。以各目的基因與16sRNA表達比值作為其相對表達量。各樣品重復測量3次。
表1
各目的基因引物序列及產物長度
Table1.
The primer sequence and length of product
1.5 統計學方法
采用SPSS11.5統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 結晶紫染色法生物膜半定量檢測
混合組和表葡組均在培養12 h生物膜明顯增厚，24 h出現迅速增長趨勢，72 h混合組超過表葡組；白念組12 h出現生物膜，48 h出現明顯增長趨勢并維持至72 h。在整個培養周期，白念組生物膜厚度均低于混合組。組間比較，培養2、4、6、72 h表葡組A值低于混合組，但8、12、24、48 h高于混合組；除72 h差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各時間點兩組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；白念組在2～72 h整個培養周期，A值均顯著低于混合組，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1。
圖1
各組不同時點結晶紫染色法生物膜半定量檢測 ? ?2.2 XTT比色法生長動力學檢測
XTT比色法生長動力學檢測示，各組均在培養6 h生長加速，12～48 h維持高生長動力，72 h再次出現生長明顯加快。混合組生長速度快于白念組，且48 h后超過表葡組。組間比較：混合組2、4、6、8、12、24 h時A值低于表葡組，48、72 h時高于表葡組；但除12 h兩組差異有統計學意義（P＜0.05）外，其余各時間點兩組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。混合組2、4 h時A值低于白念組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；6 h后各時間點混合組A值均顯著高于白念組，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2。
2.3 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，表葡組培養24 h可見表皮葡萄球菌生物膜呈團塊狀、蘑菇樣，具有多層結構，初步形成成熟生物膜；72 h葡萄球菌生長更密集，形成層次更復雜、更成熟的生物膜。白念組培養24 h可見白假絲酵母菌形成的生物膜中有大量孢子及假菌絲，孢子與假菌絲形成密集排列的網狀立體結構，孢子沿著菌絲成團聚集；72 h可見孢子及菌絲密集排列、相互交織，形成更為成熟的生物膜。混合組培養24 h可見表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌的孢子及假菌絲呈團塊狀混雜生長，在孢子與假菌絲形成立體網狀結構中混有大量表皮葡萄球菌；72 h可見更多的表皮葡萄球菌黏附在白假絲酵母菌菌絲和孢子表面，幾乎將菌絲和孢子完全包裹，生物膜更加成熟。見圖 3。
2.4 熒光定量PCR檢測
熒光定量PCR結果顯示，培養72 h時混合組fbe、icaA、aap基因相對表達量分別為28.60±0.20、24.72±0.22及25.27±0.14，與表葡組的29.67±0.38、25.45±0.05及25.94±0.04相比，平均分別增高了1.93、1.52、1.46倍，差異均有統計學意義（t=4.737，P=0.009；t=4.231，P=0.013；t=3.119，P=0.036）。
3 討論
近年來，隨著生物材料的廣泛應用，生物材料表面細菌生物膜感染已成為常見醫院內感染。生物材料的植入不僅增加了細菌入侵宿主的途徑，還降低了誘發機體感染的最低細菌數量。大量臨床報道顯示[5-7, 10]，混合微生物感染的發病率逐年升高，且混合微生物感染較單一微生物感染更易出現耐藥，治療效果不佳、病情反復明顯。綜合分析本研究結晶紫半定量檢測、XTT比色法生長動力學檢測及掃描電鏡觀察結果，提示表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌同時存在于生物材料表面后，能形成較單一微生物生長動力學更高以及結構更致密、更復雜的混合生物膜；表皮葡萄球菌黏附在白假絲酵母菌菌絲及孢子表面，使抗菌藥物更難發揮作用及抗真菌能效降低，這可能是臨床表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合感染耐藥性增加、病情遷延不愈的原因。
表皮葡萄球菌icaA基因編碼的多糖胞間黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）、aap基因編碼的聚集相關蛋白（Aap）、fbe基因編碼的纖維蛋白原結合蛋白（Fbe）參與了生物膜形成。在表皮葡萄球菌形成生物膜的黏附階段，fbe基因編碼合成Fbe，與宿主纖維蛋白原結合，介導表皮葡萄球菌黏附于生物材料表面，促使生物膜形成。在細菌增殖和聚集階段則通過PIA、Aap等因子發揮作用。研究表明，在表皮葡萄球菌生物膜形成所致感染中，ica基因在生物膜形成過程中起重要作用[16-17]。其編碼的PIA不僅參與生物膜形成，還與生物膜耐藥性密切相關，并影響生物膜的立體結構，是目前發現的與表皮葡萄球菌致病性關系最為密切的因子。國內外研究顯示，ica基因陰性的表皮葡萄球菌通過aap基因編碼的Aap形成蛋白依賴的生物膜，說明Aap作為聚集階段的另一重要因子，在生物膜形成中發揮一定作用[18-19]。宋超等[20]研究發現，假單胞菌屬、克雷白菌屬、鏈球菌菌屬存在伴隨生長關系，在生物膜形成過程中相互作用。本研究熒光定量PCR結果顯示，與表葡組相比，混合組 fbe、icaA、aap基因表達量分別增高1.93、1.52、1.46倍。結合宋超等[20]研究結果，我們分析在混合生物膜形成過程中，可能存在細菌與真菌之間不同水平相互作用，通過不同通路使表皮葡萄球菌icaA、fbe、aap表達量上調，在混合生物膜形成中起重要作用。
目前，臨床生物材料相關感染多為混合生物膜感染，國內外有關研究集中在生物膜觀察、可能藥物預防等方面[21-22]，對發生機制罕見報道。我們根據既往研究，設計并實施了本次研究，以期對臨床常見生物材料相關混合微生物感染的防治提供思路。通過觀察發現，表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合生長能形成較單一微生物更厚、結構更復雜的混合生物膜，進而導致慢性感染耐藥及遷延不愈；混合生物膜較單一生物膜更厚，可能與表皮葡萄球菌icaA、fbe、aap基因表達增加有關。生物膜的形成與調控是多層次、多通路的復雜過程，除此基因之外還有哪些機制參與調控尚有待進一步研究。
