引用本文： 任紅革, 李振浩, 李國振, 金京日. 趨化因子13在膝關節骨關節炎滑膜中的表達研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(1): 39-42. doi: 10.7507/1002-1892.20150010 復制
骨關節炎是一種退行性疾病，隨病程進展關節功能逐漸喪失，嚴重影響生活質量。研究表明，引起骨關節炎的因素有年齡、肥胖、外傷、性別等[1]，但具體作用機制尚不清楚。趨化因子是一類在炎癥灶引起白細胞定向遷移、發育和活化的小蛋白細胞因子 [2]，目前已發現約50種趨化因子，并根據靠近趨化因子分子氨基末端（N端）的兩個半胱氨酸（C）之間是否插入其他氨基酸，分為C、CC、CXC、CX3C 4個亞類[3]。趨化因子13（CXCL13）是由基質細胞產生的趨化因子，與CXCR5受體結合，調節B細胞歸巢和T細胞聚集在淋巴濾泡。研究發現，CXCL13與風濕性關節炎的發生密切相關[4-6]，且CXC類趨化因子參與調節骨關節炎軟骨細胞的代謝及間充質細胞的成骨活性[7-8]。本研究擬觀察膝關節原發性骨關節炎組織中CXCL13表達變化，分析其相關機制，為揭示骨關節炎的發病機制及進一步基因治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及分組
實驗標本均由延邊大學附屬醫院骨科2012 年2月－2013年8月收治患者自愿捐贈，標本采集通過醫院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。其中30例為接受人工全膝關節置換術的原發性骨關節炎患者（骨關節炎組），男11例，女19例；年齡62～76歲，平均66.7歲。22例為無骨關節炎病史、創傷性截肢患者（正常對照組），男15例，女7例；年齡48～56歲，平均51.3歲。取兩組膝關節滑膜組織，液氮存放30 min，-70℃冰箱凍存，備用。
1.2 主要試劑與儀器
兔抗人CXCL13多克隆抗體（Cell Signaling公司，美國）；Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國）；免疫組織化學試劑盒、實時定量PCR試劑盒（大連寶生物有限公司）。實時定量PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統、NimbleGen 雜交儀、NimbleGen MS200掃描儀（Roche公司，美國）；基因芯片顯著性分析軟件（美國斯坦福大學）；NIH圖像分析系統（美國國立衛生研究院）。
1.3 觀測指標
1.3.1 基因芯片檢測
為篩查膝關節骨關節炎滑膜組織基因表達差異，取10例骨關節炎組以及3例正常對照組滑膜組織行NimbleGen真核生物基因表達譜芯片檢測，由北京博奧生物技術有限公司完成。以總RNA為模板，T7Oligo（dT）Primer為引物，逆轉錄合成第1鏈cDNA，用RNase H 將雜合鏈中的RNA切成短片段，DNA 聚合酶Ⅰ以RNA短片段為引物延伸，合成第2鏈cDNA，并純化雙鏈cDNA。體外轉錄合成cRNA，然后純化定量，以Random Primer為引物進行Klenow酶（Cy3-dCTP）標記，將標記的樣品與雜交Buffer混勻后，注入至已經與相應Mixer粘合的芯片上，采用NimbleGen 雜交儀42℃雜交14～16 h，清洗芯片，甩干，NimbleGen MS200掃描儀掃描芯片并進行圖像分析，將圖像信號轉換為數字信號，基因芯片顯著性分析軟件進行分析。差異基因篩選標準為：錯誤發現率控制在5%以內，倍數變化（Fold Change）達2倍以上。
1.3.2 免疫組織化學染色觀察
取兩組滑膜組織，4%甲醛固定24 h，常規石蠟包埋，切片，片厚5μm，低溫保存。染色前切片37℃預熱5 min，常規脫蠟，抑制內源酶，蒸餾水洗2次，用0.05%胰酶37℃消化2 min。PBS洗2次，1∶20正常馬血清封閉，37℃孵育20 min。加一抗（1∶50，CXCL13多克隆抗體），37℃孵育1 h，4℃過夜，不加一抗作為對照。PBS洗3次，滴加對應的生物素標記的二抗，37℃孵育1 h，PBS洗3次。加DAB顯色5～10 min，加DAB增強劑10 s，自來水洗2 min，待切片自然干燥后用水溶性封片劑封片，光鏡下觀察陽性染色細胞。CXCL13蛋白陽性表達為細胞質內有棕黃色或棕褐色細顆粒。
1.3.3 Western blot檢測
取兩組滑膜組織于1～2 mL勻漿器中，剪碎、勻漿，裂解30 min后用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，于4℃，以離心半徑13.5 cm、12 000 r/min離心5 min，取上清置于-20℃保存。取20 μg總蛋白樣品，行SDS-PAGE分離、電泳。以90 V電壓轉膜1.5 h，將蛋白轉移至經甲醇處理的PVDF膜上。麗春紅染色，觀察轉膜效果。PBS洗膜2次，每次10 min，5%脫脂奶粉（溶于PBST中）室溫封閉1 h。加入一抗，室溫反應2 h，PBST洗膜3次，每次15 min；加入抗小鼠IgG或抗兔IgG，室溫反應1 h，PBST洗膜3次，每次15 min。采用ECL顯色系統暗室曝光顯影。采用NIH圖像分析系統對各條帶灰度值進行測定比較。
1.3.4 實時定量PCR檢測
采用Trizol法分別提取兩組樣本滑膜細胞系的總RNA，以SuperScriptⅡ RNase H-Reverese Transcriptase合成cDNA第1鏈，進行CXCL13基因的PCR擴增。引物序列：GAPDH，上游5’-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3’，下游5’-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3’，產物長度202 bp；CXCL13，上游5’-GCTGAATGGATACAAAGAATGATG-3’，下游，5’-TAAAACTAAAATCCAGAGCAGGG-3’，產物長度154 bp。反應條件： 94℃ 10 min，94℃ 30 s，50℃ 45 s，72℃ 45 s，35個循環；72℃延伸10 min。反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以GAPDH作為內參，以2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 基因芯片檢測
與正常對照組相比，骨關節炎組基因芯片所包含的22 885個基因中上調基因451個，下調基因810個，其中CXCL13基因表達也明顯下調，變化值的倍數為0.0324，提示人骨關節炎滑膜組織與正常滑膜組織存在明顯基因差異表達。
2.2 免疫組織化學染色觀察
CXCL13在滑膜細胞細胞質中表達，其中骨關節炎組CXCL13表達較正常對照組明顯減弱。見圖 1。
圖1
免疫組織化學染色觀察（× 40） ? 正常對照組 ? 骨關節炎組 ? ?2.3 Western blot及實時定量PCR檢測
Western blot檢測示兩組均有CXCL13蛋白表達（圖 2），其中骨關節炎組CXCL13蛋白表達量為0.408 0±0.101 8，較正常對照組的0.785 9±0.057 9明顯降低，差異有統計學意義（t=15.630，P=0.000）。實時定量PCR檢測示骨關節炎組CXCL13基因相對表達量為0.011 7±0.003 2，較正常對照組的1.041 4±0.129 7明顯降低，差異有統計學意義（t=43.634，P=0.000）。
3 討論
骨關節炎主要特點是關節軟骨破壞、細胞外基質減少、軟骨下骨改變和滑膜組織炎性改變[9]。近年研究發現，在膝關節骨關節炎發生、發展過程中有多種細胞因子參與[10-11]，包括IL、趨化因子和TNF等 [12-13]。趨化因子是一類小分子分泌蛋白，參與炎癥和免疫應答過程，如淋巴細胞游走至炎癥部位、聯系天然免疫和獲得性免疫應答、刺激或抑制血管生成、抑制病毒感染和增強細胞毒性T淋巴細胞應答 [14]。CX3CL1、CXCR4等多種趨化因子及受體參與了骨關節炎的發生發展[15-16]。相關研究表明，CXCL13與炎癥性疾病、淋巴細胞相關性疾病的發病相關 [17-18]，與風濕性關節炎的發生發展及骨結構重建亦有密切關系[6, 19]。Halvorsen等 [20]發現CXCL13在動脈粥樣硬化斑塊的單核細胞中表達升高，起抗炎和抗凋亡作用。本研究基因芯片檢測發現，膝關節骨關節炎滑膜組織中CXCL13基因表達顯著降低，與實時定量PCR檢測結果一致。免疫組織化學染色及Western blot檢測示骨關節炎滑膜組織中CXCL13蛋白表達也較正常組織顯著降低。以上結果均提示CXCL13低表達可能引起抗炎活性降低，進而加重關節疼痛、關節腔積液等關節炎癥狀。
Yuvaraj等[21]在口腔鱗狀細胞癌骨轉移的研究中發現CXCL13可增強NF-κB受體激活因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）的分泌，而RANKL是重要的骨吸收與破骨細胞調節因子，具有增強骨吸收作用。Sambandam等[22]研究發現，口腔鱗狀細胞癌骨轉移的腫瘤骨基質細胞與骨母細胞中CXCL13的激活劑c-Myc會增強RANKL表達，CXC亞家族趨化因子受體5（CXCR5）會顯著降低RANKL表達。本研究結果提示膝關節骨關節炎滑膜組織中CXCL13表達明顯降低。CXCL13低表達可能導致RANKL低表達，進而引起骨吸收減少，最終引起骨質生成與吸收失衡，大量骨質增生，從而導致骨關節炎的發生。
綜上述，CXCL13低表達可能與膝關節骨關節炎的發生、發展有關，CXCL13的表達水平可能對膝關節骨關節炎的早期診斷及預后判斷有幫助，但其在骨關節炎發生發展中的具體分子作用機制尚需進一步研究。
骨關節炎是一種退行性疾病，隨病程進展關節功能逐漸喪失，嚴重影響生活質量。研究表明，引起骨關節炎的因素有年齡、肥胖、外傷、性別等[1]，但具體作用機制尚不清楚。趨化因子是一類在炎癥灶引起白細胞定向遷移、發育和活化的小蛋白細胞因子 [2]，目前已發現約50種趨化因子，并根據靠近趨化因子分子氨基末端（N端）的兩個半胱氨酸（C）之間是否插入其他氨基酸，分為C、CC、CXC、CX3C 4個亞類[3]。趨化因子13（CXCL13）是由基質細胞產生的趨化因子，與CXCR5受體結合，調節B細胞歸巢和T細胞聚集在淋巴濾泡。研究發現，CXCL13與風濕性關節炎的發生密切相關[4-6]，且CXC類趨化因子參與調節骨關節炎軟骨細胞的代謝及間充質細胞的成骨活性[7-8]。本研究擬觀察膝關節原發性骨關節炎組織中CXCL13表達變化，分析其相關機制，為揭示骨關節炎的發病機制及進一步基因治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及分組
實驗標本均由延邊大學附屬醫院骨科2012 年2月－2013年8月收治患者自愿捐贈，標本采集通過醫院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。其中30例為接受人工全膝關節置換術的原發性骨關節炎患者（骨關節炎組），男11例，女19例；年齡62～76歲，平均66.7歲。22例為無骨關節炎病史、創傷性截肢患者（正常對照組），男15例，女7例；年齡48～56歲，平均51.3歲。取兩組膝關節滑膜組織，液氮存放30 min，-70℃冰箱凍存，備用。
1.2 主要試劑與儀器
兔抗人CXCL13多克隆抗體（Cell Signaling公司，美國）；Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國）；免疫組織化學試劑盒、實時定量PCR試劑盒（大連寶生物有限公司）。實時定量PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統、NimbleGen 雜交儀、NimbleGen MS200掃描儀（Roche公司，美國）；基因芯片顯著性分析軟件（美國斯坦福大學）；NIH圖像分析系統（美國國立衛生研究院）。
1.3 觀測指標
1.3.1 基因芯片檢測
為篩查膝關節骨關節炎滑膜組織基因表達差異，取10例骨關節炎組以及3例正常對照組滑膜組織行NimbleGen真核生物基因表達譜芯片檢測，由北京博奧生物技術有限公司完成。以總RNA為模板，T7Oligo（dT）Primer為引物，逆轉錄合成第1鏈cDNA，用RNase H 將雜合鏈中的RNA切成短片段，DNA 聚合酶Ⅰ以RNA短片段為引物延伸，合成第2鏈cDNA，并純化雙鏈cDNA。體外轉錄合成cRNA，然后純化定量，以Random Primer為引物進行Klenow酶（Cy3-dCTP）標記，將標記的樣品與雜交Buffer混勻后，注入至已經與相應Mixer粘合的芯片上，采用NimbleGen 雜交儀42℃雜交14～16 h，清洗芯片，甩干，NimbleGen MS200掃描儀掃描芯片并進行圖像分析，將圖像信號轉換為數字信號，基因芯片顯著性分析軟件進行分析。差異基因篩選標準為：錯誤發現率控制在5%以內，倍數變化（Fold Change）達2倍以上。
1.3.2 免疫組織化學染色觀察
取兩組滑膜組織，4%甲醛固定24 h，常規石蠟包埋，切片，片厚5μm，低溫保存。染色前切片37℃預熱5 min，常規脫蠟，抑制內源酶，蒸餾水洗2次，用0.05%胰酶37℃消化2 min。PBS洗2次，1∶20正常馬血清封閉，37℃孵育20 min。加一抗（1∶50，CXCL13多克隆抗體），37℃孵育1 h，4℃過夜，不加一抗作為對照。PBS洗3次，滴加對應的生物素標記的二抗，37℃孵育1 h，PBS洗3次。加DAB顯色5～10 min，加DAB增強劑10 s，自來水洗2 min，待切片自然干燥后用水溶性封片劑封片，光鏡下觀察陽性染色細胞。CXCL13蛋白陽性表達為細胞質內有棕黃色或棕褐色細顆粒。
1.3.3 Western blot檢測
取兩組滑膜組織于1～2 mL勻漿器中，剪碎、勻漿，裂解30 min后用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，于4℃，以離心半徑13.5 cm、12 000 r/min離心5 min，取上清置于-20℃保存。取20 μg總蛋白樣品，行SDS-PAGE分離、電泳。以90 V電壓轉膜1.5 h，將蛋白轉移至經甲醇處理的PVDF膜上。麗春紅染色，觀察轉膜效果。PBS洗膜2次，每次10 min，5%脫脂奶粉（溶于PBST中）室溫封閉1 h。加入一抗，室溫反應2 h，PBST洗膜3次，每次15 min；加入抗小鼠IgG或抗兔IgG，室溫反應1 h，PBST洗膜3次，每次15 min。采用ECL顯色系統暗室曝光顯影。采用NIH圖像分析系統對各條帶灰度值進行測定比較。
1.3.4 實時定量PCR檢測
采用Trizol法分別提取兩組樣本滑膜細胞系的總RNA，以SuperScriptⅡ RNase H-Reverese Transcriptase合成cDNA第1鏈，進行CXCL13基因的PCR擴增。引物序列：GAPDH，上游5’-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3’，下游5’-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3’，產物長度202 bp；CXCL13，上游5’-GCTGAATGGATACAAAGAATGATG-3’，下游，5’-TAAAACTAAAATCCAGAGCAGGG-3’，產物長度154 bp。反應條件： 94℃ 10 min，94℃ 30 s，50℃ 45 s，72℃ 45 s，35個循環；72℃延伸10 min。反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以GAPDH作為內參，以2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 基因芯片檢測
與正常對照組相比，骨關節炎組基因芯片所包含的22 885個基因中上調基因451個，下調基因810個，其中CXCL13基因表達也明顯下調，變化值的倍數為0.0324，提示人骨關節炎滑膜組織與正常滑膜組織存在明顯基因差異表達。
2.2 免疫組織化學染色觀察
CXCL13在滑膜細胞細胞質中表達，其中骨關節炎組CXCL13表達較正常對照組明顯減弱。見圖 1。
圖1
免疫組織化學染色觀察（× 40） ? 正常對照組 ? 骨關節炎組 ? ?2.3 Western blot及實時定量PCR檢測
Western blot檢測示兩組均有CXCL13蛋白表達（圖 2），其中骨關節炎組CXCL13蛋白表達量為0.408 0±0.101 8，較正常對照組的0.785 9±0.057 9明顯降低，差異有統計學意義（t=15.630，P=0.000）。實時定量PCR檢測示骨關節炎組CXCL13基因相對表達量為0.011 7±0.003 2，較正常對照組的1.041 4±0.129 7明顯降低，差異有統計學意義（t=43.634，P=0.000）。
3 討論
骨關節炎主要特點是關節軟骨破壞、細胞外基質減少、軟骨下骨改變和滑膜組織炎性改變[9]。近年研究發現，在膝關節骨關節炎發生、發展過程中有多種細胞因子參與[10-11]，包括IL、趨化因子和TNF等 [12-13]。趨化因子是一類小分子分泌蛋白，參與炎癥和免疫應答過程，如淋巴細胞游走至炎癥部位、聯系天然免疫和獲得性免疫應答、刺激或抑制血管生成、抑制病毒感染和增強細胞毒性T淋巴細胞應答 [14]。CX3CL1、CXCR4等多種趨化因子及受體參與了骨關節炎的發生發展[15-16]。相關研究表明，CXCL13與炎癥性疾病、淋巴細胞相關性疾病的發病相關 [17-18]，與風濕性關節炎的發生發展及骨結構重建亦有密切關系[6, 19]。Halvorsen等 [20]發現CXCL13在動脈粥樣硬化斑塊的單核細胞中表達升高，起抗炎和抗凋亡作用。本研究基因芯片檢測發現，膝關節骨關節炎滑膜組織中CXCL13基因表達顯著降低，與實時定量PCR檢測結果一致。免疫組織化學染色及Western blot檢測示骨關節炎滑膜組織中CXCL13蛋白表達也較正常組織顯著降低。以上結果均提示CXCL13低表達可能引起抗炎活性降低，進而加重關節疼痛、關節腔積液等關節炎癥狀。
Yuvaraj等[21]在口腔鱗狀細胞癌骨轉移的研究中發現CXCL13可增強NF-κB受體激活因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）的分泌，而RANKL是重要的骨吸收與破骨細胞調節因子，具有增強骨吸收作用。Sambandam等[22]研究發現，口腔鱗狀細胞癌骨轉移的腫瘤骨基質細胞與骨母細胞中CXCL13的激活劑c-Myc會增強RANKL表達，CXC亞家族趨化因子受體5（CXCR5）會顯著降低RANKL表達。本研究結果提示膝關節骨關節炎滑膜組織中CXCL13表達明顯降低。CXCL13低表達可能導致RANKL低表達，進而引起骨吸收減少，最終引起骨質生成與吸收失衡，大量骨質增生，從而導致骨關節炎的發生。
綜上述，CXCL13低表達可能與膝關節骨關節炎的發生、發展有關，CXCL13的表達水平可能對膝關節骨關節炎的早期診斷及預后判斷有幫助，但其在骨關節炎發生發展中的具體分子作用機制尚需進一步研究。
